Articolo metodologico

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

DOI:

10.3791/53851

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16 marzo 2016

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1Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, 2Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

In questo articolo

Sommario

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Sebbene la struttura dei ribosomi sia stata ampiamente caratterizzata, l'organizzazione dei polisomi è ancora poco studiata. Per ovviare a questa mancanza di conoscenza, presentiamo qui un protocollo di preparazione dettagliato per l'imaging accurato dei polisomi dei mammiferi mediante microscopia a forza atomica (AFM) in aria e liquidi.

Abstract

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Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine ​​e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l'organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l'acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l'imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.

Introduzione

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La sintesi delle proteine ​​è la più processo consumo di energia nelle cellule 1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine ​​sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che 3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono 6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi 14- 16, le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia d....

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Protocollo

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Le pratiche utilizzate per ottenere i tessuti di topo sono stati approvati dal corpo per la protezione degli animali (OPBA) dell'Università degli Studi di Trento (Italia), il protocollo n. 04-2015, il decreto di cui al art.31 legislativo n. 26/2014. Tutti i topi sono stati mantenuti al Organismo modello Struttura del Centro per la Biologia Integrata (CIBIO), Università degli Studi di Trento, Italia.

Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell'RNA dei campioni, preparare tutti i buffer con acqua DEPC trattati per ridurre al minimo la contaminazione RNasi.

1. Preparazione di polisomi da Brains Interi

  1. Raccolta di tessuti cerebr....

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Risultati

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Il saccarosio gradiente polisomale profiling dell'intero cervello di topo

È possibile purificare polisomi da un lisato cellulare mediante profilatura polisomale, che separa macromolecole conformemente al loro peso e dimensioni. Con profiling polisomale, lisati citoplasmatici ottenuti da cellule o tessuti coltivati, come in questo esempio, vengono caricati su un gradiente di saccarosio lineare e trattati da ult.......

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Discussione

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Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l'organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell'espressione genica, è essenziale analizzare l'organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione.

Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizzati s.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti in questo articolo e nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata dal progetto di ricerca AXonomIX finanziato dalla Provincia Autonoma di Trento, Italia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CycloheximideSigma01810Preparazione del lisato
DNAseIThermo Scientific89836Preparazione del lisato
RiboLock RNAse InhibitorLife technologiesEO-0381Preparazione del lisato
DEPCSigma40718Preparazione del lisato
Triton X100SigmaT8532Preparazione del lisato
DTTSigma43815Preparazione del lisato
Desossicolato di sodioSigmaD6750Preparazione del lisato
Microcentrifuga Eppendorf5417RPreparazione di lisato
SaccarosioSigmaS5016Preparazione a gradiente di saccarosio
UltracentrifugaBeckman CoulterOptima LE-80KCentrifugazione a gradiente di saccarosio
Ultracentrifuga RotoreBeckman CoulterSW 41 TiCentrifugazione a gradiente di saccarosio
Provetta in poliallomeroBeckman Coulter331372
Sistema di frazionamento a gradiente di densità di centrifugazione a gradiente di saccarosio Teledyne Isco67-9000-176Frazionamento in gradiente di saccarosio
AFMAsylum ResearchCypherPolysome visualization

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (....

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