Articolo metodologico

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

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DOI:

10.3791/53874

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3 giugno 2016

 ,  , 
1INSERM UMR-910, Faculté de Médecine, Université Aix-Marseille, 2Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center, Johannes Gutenberg University

In questo articolo

Sommario

Un regolamento messa a punto della trascrizione genica alla base embrionali decisione destino della cellula. Qui, descriviamo immunoprecipitazione della cromatina utilizzati per indagare regolazione epigenetica di entrambi differenziazione cardiaca delle cellule staminali e sviluppo cardiaco di embrioni di topo.

Abstract

Specifico trascrizione genica è un processo biologico fondamentale che sta alla base decisione destino delle cellule durante lo sviluppo embrionale. Il processo biologico è mediata da fattori di trascrizione che si legano regioni regolatorie genomiche compresi stimolatori e promotori di geni costitutivi cardiaci. DNA è avvolto attorno istoni che sono sottoposti a modificazioni chimiche. Le modifiche degli istoni ulteriormente portano a repressa, attivo o in bilico la trascrizione del gene, portando così un altro livello di regolazione fine messa a punto della trascrizione genica. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) ricapitolano entro corpi embrionali (cioè aggregati di cellule) o in coltura 2D primi passi dello sviluppo cardiaco. Essi forniscono in linea di principio abbastanza materiale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), una tecnologia ampiamente utilizzata per identificare geni regioni regolatorie. Inoltre, le cellule ES umane rappresentano un modello di cellule umane di cardiogenesis. Alle successive fasi di sviluppo, di topo tessuti embrionali consentonoindagare specifici paesaggi epigenetici necessarie per la determinazione dell'identità cellulare. Qui, descriviamo i protocolli di Chip, ChIP sequenziale seguita da PCR o chip-sequenziamento utilizzando cellule ES, corpi embrionali e cardiaci regioni embrionali specifiche. Questi protocolli consentono di indagare la regolazione epigenetica della trascrizione genica cardiaca.

Introduzione

Il cuore è il primo organo a formarsi e diventare funzionale nell'embrione. Il cuore è costruito da molte linee cellulari che nascono dal primo e dal secondo campo cardiaci embrionali 1. Dal blastocisti post-fecondazione in scena fino alla forma di cuore, le cellule embrionali devono quindi prendere molte decisioni destino delle cellule. Gene trascrizione è regolata in modo tempo e spazio-dipendente ed è un processo biologico fondamentale che sta alla base decisione destino delle cellule durante lo sviluppo embrionale. Tale processo è mediato da specifici fattori di trascrizione che si legano regioni regolatorie all'interno del genoma compresi stimolatori e promotori di geni costitutivi cardiaci. DNA è avvolto attorno istoni che sono sottoposti a modificazioni come acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, e / o fosforilazione. Modificazione degli istoni porta a repressa, attivo o in bilico la trascrizione del gene a seconda di quale lisina residuo dell'istone viene modificato 2.

jove_content "> test di immunoprecipitazione della cromatina (chip) è stato istituito anni fa 3 ed è attualmente la tecnologia più ampiamente utilizzato al fine di identificare gli obiettivi di una istoni modificati o fattori di trascrizione 4. In seguito immunoprecipitazione degli istoni o fattori di trascrizione, DNA legato può essere sia amplificato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) o sequenziato. ChIP è tecnicamente superato i test più impegnativi gel ritardo 5. Tuttavia ChIP non implica legame diretto di un fattore di trascrizione di DNA, un vantaggio di test gel ritardo. D'altra parte, ChIP combinati per il sequenziamento del DNA ha aperto una nuova prospettiva genome-wide sulla regolazione genica.

Cellule staminali embrionali (cellule ES) ricapitolano entro corpi embrionali (es., Aggregati di cellule) o in coltura 2D primi passi dello sviluppo cardiaco 6 e dispongono di massima abbastanza materiale per chip. Inoltre, le cellule ES umane rappresentano un modello di cellule umane di cardiogenesis anche se il loro potenziale cardiogenico dipende dalla loro firma epigenetica 7. Alle successive fasi di sviluppo, di topo tessuti embrionali consentono di indagare specifici paesaggi epigenetici necessarie per la determinazione dell'identità cellulare. Tuttavia, il genoma è trascritto in un tempo e di cellule specifiche del tipo maniera 8. regolazione epigenetica della trascrizione genica deve essere studiato all'interno delle regioni localizzate. Qui, descriviamo i protocolli di Chip, ChIP sequenziale seguita da PCR o sequenziamento utilizzando cellule ES, corpi embrionali e cardiaci regioni embrionali specifiche. Questi protocolli consentono di indagare la regolazione epigenetica della trascrizione genica cardiaca.

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Protocollo

1. DNA-proteina cross-linking

  1. Correzione in provette da 15 ml celle-ES raccolte (2 x 10 6 cellule per il chip regolare, 2 x 10 5 cellule per microchip), corpi embrionali (EBS) generati da cellule ES e tessuti cardiaci embrionali sezionati da embrioni di topo E9.5 (atrioventricolare canale, tratto di efflusso del ventricolo e) usando 1% di formaldeide in PBS per cellule o nel buffer di permeabilizzazione PB2 per i tessuti embrionali. Posizionare i tubi sul agitatore orbitale a una velocità di 60 rpm a temperatura ambiente per esattamente 10 minuti.
  2. Arrestare la reazione di cross-linking aggiungendo glicina ad una concentrazione finale di 125 mM e incubare per 5 minuti a temperatura l'agitatore orbitale camera ad una velocità di 60 rpm.

2. cellulare lisi e cromatina frammentazione

  1. Lavare due volte le cellule cross-linked risospese in 10 ml di PBS 1x o tessuti embrionali risospesi in 1 ml PB2. Centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
  2. Aggiungere inibitori della proteasi per tamponare PB1 PB2 o (2 mg / ml leupeptina, 1 mg / ml aprotinina, e 0,1 mM PMSF) (Tabella 1). Risospendere il pellet di cellule o tessuti embrionali dal punto 2.1 in 1 ml di tampone PB1 e PB2, rispettivamente. Pipettare su e giù e risospendere le cellule oi tessuti. Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago calibro 21 per omogeneizzare cellule o tessuti. Incubare a 4 ° C (su una ruota) per 10 min.
  3. Spin down a 3.000 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
  4. Risospendere il pellet in 300 ml di rispettivi tamponi SB (Tabella 1) integrato con inibitori della proteasi in una provetta pulita (certificati esenti da RNasi, DNase- e apirogena) per prevenire qualsiasi degradazione del DNA. Incubare per 15 a 30 min in ghiaccio.
  5. Sonicare i campioni a 4 ° C per inclinare l'cromatina utilizzando un sonicatore secondo programmi elencati nella Tabella 2 per ciascun materiale. Regolare la durata sonicazione seconda della successiva applicazione ( cioè, PCR o sequenziamento). dimensione del DNA Sheared dovrebbe essere di circa 500 bp per PCR e 300 bp per il sequenziamento.
  6. Centrifugare sonicato lisato cellulare per 10 min a 6000 xga 4 ° C, trasferire il surnatante (cromatina) in una provetta pulita da 1,5 ml e scartare il pellet.
  7. Diluire la cromatina in soluzione (surnatante tampone B) per 10 volte con acqua e valutare la densità ottica utilizzando 1,5 ml in un nano-spettrofotometro. Ottenere la concentrazione di proteine ​​in mg / mL utilizzando la seguente formula: 1,55 x OD 280 - 0,76 x OD 260.
Buffer utilizzo Composizione materiale
UN permeabilizzazione PB1: 5 mm TUBI pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 Tutti
PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100 tessuto embrionale
B Lysis / Sonicazione SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 ESC
SB2: 50 mm HEPES-KOH pH7.9; 140 mm; 1mM EDTA; 0,1% desossicolato; 0,1% SDS EBs
SB3: 15 mm HEPES pH7.6, 15 mM NaCl; 60 mm KCl, 1mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% Triton-X100, 0, 1% SDS, 0,5% laurylsarcosine tessuto embrionale
C buffer di ChIP 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% Triton-X100. Tutti
D DNA / proteine ​​eluizione D1: 1% SDS; 100mM NaHCO 3
D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
E DNA preparazione perline vincolanti E: 20% PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1mM EDTA

Tabella 1. buffer chip.

Materiale programma sonicazione
Cellule staminali embrionali 15 cicli di 30 sec ON e OFF 30 sec
corpi embrionali 30 cicli di 30 sec ON e OFF 30 sec
tessuti embrionali 21 cicli di 30 sec ON e OFF 30 sec

Tabella 2. Programmi ultrasuoni.

3. Immunoprecipitazione elavaggi

  1. Lavare 3 volte Proteina perline A coniugato con tampone C. Prendere 100 ml di perline in una provetta pulita da 1,5 ml e aggiungere 1 ml di tampone C (Tabella 1). Il tubo viene poi trasferito su un magnete; attendere per 1 min e aspirare il surnatante. Ripetere due volte la fase di lavaggio.
  2. Incubare anticorpi sollevato contro gli istoni modificati o fattore di trascrizione (concentrazioni elencate nella tabella 3) con 20 pl di proteine ​​lavata un perline coniugati e 1 ml di tampone C integrati con inibitori della proteasi in una provetta pulita da 1,5 ml. Impostare i campioni su un rotore a 40 rpm per almeno 2 ore a 4 ° C.
  3. Lavare anticorpo-perle Complessi 3 volte con 1 ml di tampone C (manipolazione descritto in 3.1).
  4. Preparare 2 tubi, uno contenente 150 mg di cromatina e anticorpi-perline complessi e l'altro tubo contenente 150 mg di cromatina e 20 pl di perline lavate; Aggiungere 1 ml di tampone C integrate con inibitori della proteasi a ciascuna provettae incubare i campioni su una ruota rotante a 40 rpm notte a 4 ° C.
    NOTA: La concentrazione di cromatina deve essere di almeno 300 mg di immunoprecipitare un fattore di trascrizione o per Chip sequenziale.
Standard concentrazione (ng / ml) Volume (ml) Concentrazione totale di DNA (ng)
UN 10.0 1 10.0
B 5.00 1 5.00
C 2,50 1 2,50
D 1.25 1 1.25
E 0,625 1 0,625
F 0,3125 1 00,3125
sol 0,156 1 0,156
H 0.0 1 0.0

Tabella 3. Le concentrazioni campioni.

4. DNA eluizione, Cross-link Reversal e proteinasi K digestione

  1. Impostare i campioni nel rack magnetica. Recuperare il surnatante contenente non legato cromatina anticorpi.
    NOTA: I campioni possono essere rapidamente congelati in azoto liquido a quella sezione e conservati a -80 ° C. Cromatina può essere utilizzato in altre immunoprecipitazione con altri anticorpi. Lavare ciascun campione 3 volte con 1 ml di tampone C (manipolazione descritto in precedenza).
  2. Eluire la proteina dell'anticorpo legato aggiungendo 150 ml di tampone D1 o D2 se ChIP sequenziale debba venir effettuata (Tabella 1) per materiali ChIP lavati e incubare i campioni per 20 min a 50 ° C su una piastra riscaldante.
  3. Rimuovere tubi dail blocco di riscaldamento e mettere i campioni nel rack magnetica, recuperare il surnatante in una provetta da 1,5 ml pulito (certificati esenti da RNasi, DNase- e apirogena) ed eliminare le perline.
  4. Utilizzare surnatante per un chip sequenziale aggiungendo 1 a 3 ug del secondo anticorpo in 2 volumi di tampone C o invertire reticolazione aggiungendo 5 M NaCl per ottenere una concentrazione finale di 200 mM.
  5. Preparare un campione di ingresso della cromatina in una provetta da 1,5 ml pulito (certificate esenti da RNasi, DNase-, ed apirogena) prendendo la stessa quantità di cromatina come quella del campione IP (150 mg) in un volume finale di 150 ml di acqua (acqua libera RNase DNasi). Aggiungere 5M NaCl ad una concentrazione finale di 200 mm. Incubare i campioni per una notte a 65 ° C.
  6. Il giorno seguente, rimuovere i campioni dal gruppo di riscaldamento, aggiungere 250 mM EDTA per ottenere una concentrazione finale di 12,5 mM e proteinasi K per ottenere una concentrazione finale di 250 ug / ml nel materiale ChIP e digerire a 55 ° C per 2 ore in blocco di riscaldamento.

5. L'isolamento del DNA utilizzando biglie di DNA-binding

  1. Preparazione di perline
    1. Inizia a portare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, vortex le perline molto accuratamente. Perline stabilirsi, in modo da lavorare velocemente durante il pipettaggio. Trasferire 1 ml di perline in provetta pulita da 1,5 ml (certificato RNasi, DNase- e apirogena).
    2. Situato su magnete, attendere 2 - 3 minuti per la soluzione per chiarire, il surnatante scarto. Togliere dal magnete, aggiungere 1 ml di 0,5 M EDTA e mescolare breve vortex.
    3. Ripetere il passaggio 5.1.2 due volte, e scartare il surnatante alla fine.
    4. Togliere dal magnete, aggiungere 1 ml di tampone E e risospendere lentamente le perline. Trasferire la miscela (perline in tampone E) in 50 ml di tampone E. posto su un agitatore e lasciate mescolare lentamente a temperatura ambiente per 1 ora.
    5. perline test DNA-binding seguendo il protocollo di purificazione descritto di seguito utilizzando 3 condizioni sperimentali: 50 ml di perline / 50 ml di DNA (1 volume / 1 volume), 100 ml di perline/ 50 ml di DNA (2 volumi / 1 volume) e 125 ml di perline / 50 ml di DNA (2,5 volumi / 1 volume). Let migrare DNA purificato su gel di agarosio 1,5% per controllare la dimensione dei frammenti (Figura 1A).
  2. Purificazione del DNA
    1. Aggiungere 425 ml (2,5 volumi) di legame al DNA sfere magnetiche di ciascun campione di DNA (circa 170 ml). Risospendere lentamente pipettando su e giù (circa 10 volte) e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    2. Posizionare il magnete per 5 minuti, quindi aspirare il surnatante e scartare (a magnete).
    3. Aggiungere 600 ml di appena fatto 80% di etanolo al tubo sul magnete, attendere per 1 minuto, aspirare il surnatante e scartare e poi ripetere il passaggio precedente una volta di più.
    4. Dare una rotazione rapida, per 5 sec (microcentrifuga), posizionare il tubo sul magnete e rimuovere le ultime gocce di etanolo. Lasciare asciugare per 1 min a RT
    5. Eluire il DNA con l'aggiunta di 20 ml di DNasi RNasi acqua libera. Togliere dal magnete e vortice del campione.
    6. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente e poi posto su campioni magnete. Aspirare DNA eluito in un nuovo tubo (certificato RNasi, DNase- e apirogena).
    7. Eseguire il DNA dalla frazione di ingresso su un gel di agarosio 1,5% per controllare la dimensione dei frammenti di DNA (Figura 1B).

6. DNA quantificazione con uno strumento di rilevamento di fluorescenza

  1. Serie diluito in acqua 1 mg DNA (1 kb scala) per dare un totale di 7 diluizioni più un punto di non-DNA (diluizioni raccolti nella tabella 3).
  2. Preparare una soluzione di PCR Green I tintura, sufficienti per tutti i campioni (purificato DNA e diluizioni standard AH): diluire 10.000X il colorante verde in 1x tampone TE.
  3. Aggiungere 1 ml di ogni campioni di DNA (il DNA purificato e diluizioni standard AH) a 10 microlitri 1x mix colorante verde nei capillari cuvette da leggere in un fluorimetro a 488 nm di lunghezza d'onda. Per il saggio no-DNA, utilizzare 1 ml di buffer 1x TE.
  4. Costruireuna curva di calibrazione utilizzando un software grafico e determinare le concentrazioni relative alla gamma di campioni di DNA in ng / ml. Il DNA è quindi pronto per PCR o per effettuare librerie sequenziamento.

7. PCR

  1. Selezione di primer
    1. primer design di interesse di interrogare le regioni genomiche di interesse. primer design per amplificare regioni enhancer dei geni utilizzando il browser genoma UCSC. Esaltatori sono ulteriormente previsti utilizzando H3K4me1 o p300 ChIP-Seq 9 i dati disponibili nel set di dati GEO.
  2. PCR
    1. Le reazioni Run PCR per 45 cicli (8 sec 95 ° C, 8 sec a 60 ° C, 8 sec 72 ° C) utilizzando una real-time PCR termociclatore in 25 microlitri miscela colorante verde, DNA 2 ng, e miscela di primer 0,5 ml (20 soluzione madre mM) 10.
  3. Analisi di arricchimento
    1. Calcola l'arricchimento assoluta partendo dal presupposto che al massimo l'1% dei nucleosomi sono stati immunoprecipitati 11.
    2. consider la genomica arricchita se 10 campioni ng IP mostrano un arricchimento migliori rispetto a 0,1 ng di DNA di ingresso.
    3. Esprimere risultati come l'aumento volte arricchimento su una regione non arricchito dopo la normalizzazione all'ingresso e regolazione con un campione di controllo non specifico.
    4. Si consideri il DNA di ingresso da diluire 100 (fattore di diluizione o DF).
    5. Normalizzare l'ingresso utilizzando la seguente equazione 2 -ΔCt x 100%, dove -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
    6. Regolare il controllo utilizzando la seguente equazione (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) dove NS è il campione non specifico (senza anticorpi IP, o IP IgG).
    7. Calcolare l'arricchimento piega del campione come 2 -ΔΔCt. Un file compresi tutti i passaggi di calcoli con le formule in cui solo ogni campione PCR può essere immesso faciliterà l'analisi dei risultati.

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Risultati

La figura 1A illustra dapprima la preparazione di perline DNA-binding e controllo di qualità usando il DNA di diverse dimensioni (1 kb scala). 0ne, 2 e 2,5 volumi (da 1 a 3) di perline inserito in un volume del campione per purificare frammenti di DNA ad alta e bassa dimensione molecolare.

Figure 1 B, C, D sono tipici esempi di gel di DNA provenienti da tutto il DNA sonicato estratto da cellul...

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Discussione

L'epigenetica è diventato un importante campo di ricerca in biologia dello sviluppo. Come un programma genetico viene attivato nelle cellule embrionali per consentire alle cellule di acquisire una specifica identità all'interno di un lignaggio embrionale è stato per lungo tempo una questione chiave per biologi dello sviluppo.

Chip è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni e combinati per il sequenziamento del DNA in seguito miglioramento della risoluzione di sequenziamento. Que...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono le agenzie di finanziamento, il programma della comunità europea IMI StemBANCC, la Fondazione leducq (SHAPEHEART) e l'Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Formaldeide Fissazione cellulare SigmaF8775nbsp;
GlycineSigmaG8898Cross-link stop
AprotininFluka10820Inibitore delle proteasi
Leupeptin emisolfatoSigmaL2882Inibitore delle proteasi
PMSFSigmaP7626Inibitore delle proteasi
Proteina A perline magnetiche Tecnologie di vita10001DImmunoprecipitazione
SPRI perle magneticheThermo Scientific15002-01Purificazione del DNA
Proteinasi KTecnologie di vita25530-015Digestione delle proteine 
Standard DNA BR Life technologiesQ32850Intervallo di calibrazione 
Syber greenMolecular ProbesS-11484tampone TE per quantificazione del DNA
 InvitrogenP7589Quantificazione del DNA
PBX 1xTecnologie per la vita14190-094Lavaggio
DNase Acqua priva di RNasiTecnologie per la vita10977-035Diluizione
Tubo AxygenMCT-175-CChIP purifiction
Antibody  AziendaReferenceChIP concentration
H3K27acAbcamab47293 &; g per ESC e EB, 1 & micro; g per tessuti
H3K4me1DiagenodeC15410194 (pAb-194-050)3 µ g per ESC e EB, 1 & micro; g per tessuti
H3K36me3DiagenodeC15410058 (pAb-058-050)3 &; g per ESC e EB, 1 & micro; g per tessuti
H3K9me2DiagenodeC15410060 (pAb-060-050)3 &; g per ESC e EB, 1 & micro; g per tessuti
H3K4me3DiagenodeC15410030 (pAb-030-050)3 µ g per ESC e EB, 1 & micro; g per tessuti
H3K27me3DiagenodeC15410069 (pAb-069-050)3 &; g per ESC e EB, 1 & micro; g per fazzoletti
&

Riferimenti

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