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Articolo metodologico

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

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DOI:

10.3791/53877

⸱

12 marzo 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è un potente organismo modello per studiare lo sviluppo dei vertebrati. Sebbene molti aspetti dello sviluppo embrionale del pesce zebra siano stati descritti a livello morfologico, poco si sa sulle basi molecolari dei cambiamenti cellulari che si verificano durante lo sviluppo dell'organismo. Con i recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di multiplexing, è ora possibile caratterizzare l'espressione genica in singole cellule. Ciò consente di studiare l'eterogeneità tra le singole cellule di specifiche popolazioni cellulari per identificare e classificare i sottotipi cellulari, caratterizzare gli stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare ed esplorare le risposte cellulari differenziali agli stimoli. Questo studio descrive un protocollo per isolare singole cellule vitali da embrioni di zebrafish per saggi di multiplexing ad alto rendimento. Questo metodo può essere rapidamente applicato a qualsiasi tipo di cellula embrionale di zebrafish con marcatori fluorescenti. Un'estensione di questo metodo può essere utilizzata anche in combinazione con tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento per caratterizzare completamente il trascrittoma di singole cellule. A riprova del principio, l'abbondanza relativa dei marcatori di differenziazione cardiaca è stata valutata in singole cellule isolate derivate da progenitori cardiaci positivi per nkx2.5. Attraverso la valutazione dell'espressione genica a livello di singola cellula e in un singolo punto temporale, i dati supportano un modello in cui i progenitori cardiaci coesistono con la progenie differenziante. Il metodo e il flusso di lavoro qui descritti sono ampiamente applicabili alla comunità di ricerca del pesce zebra, richiedendo solo una linea di pesce transgenica etichettata e l'accesso alle tecnologie microfluidiche.

Introduzione

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l'esito della malattia. Comprendere l'espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti 1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che rende difficile per rilevare sottili cambiamenti nell'espressione genica che in ultima analisi iniziativa per le decisioni sul destino delle cellule 3. Analogamente, un singolo tipo di cellula può avere diversi profili di espressione in risposta al microambiente 4. Ad esempio, le cellule endoteliali residenti nello stesso organo o in diversi organi (ad es., Dell'aorta o renali) mostrano una significativa eterogeneità, nonostante la condivisione di MORP comunehological e funzionale dispone di 5. Inoltre, le cellule tumorali che popolano lo stesso tumore può anche avere diversi profili molecolari o mutazioni a livello di singola cellula 6.

In sistemi modello, trascrittomica in singole cellule ha identificato con successo nuove popolazioni di cellule, caratterizzato stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare, e ha rivelato le risposte cellulari differenziali agli stimoli 7,8,9. Tali intuizioni sarebbero stati mascherati in studi basati sulla popolazione convenzionali. embrioni di zebrafish sono una fonte immensamente utilizzato sotto-dello stelo, progenitore, e differenziazione delle cellule per esplorare questioni di singola eterogeneità cellulare e regolazione molecolare delle identità cellulari durante lo sviluppo. Il loro altamente stereotipato, ex vivo lo sviluppo e la facilità di manipolazione genetica loro un sistema modello eccellente per questo approccio 10,11 fanno. In particolare, una limitazione importante per l'interpretazione della singola cellula gendati e espressione è che l'identificazione affidabile di nuovi stati di cella intermedi durante lo sviluppo richiede molto attenti tempi di raccolta dei tessuti 9. Ciò è necessario per garantire che eterogeneità tra cellule catturate rappresenta eterogeneità all'interno di un tessuto in un singolo punto tempo piuttosto che eterogeneità nell'espressione genica presentata dalla differenziazione cellulare dipendente dall'età. Rispetto ai topi, sviluppo embrionale zebrafish può essere sincronizzato con precisione su un ampio numero di embrioni 12. Inoltre, con le grandi dimensioni della covata, embrioni di zebrafish può essere utilizzato come una fonte abbondante di cellule staminali e progenitrici.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare le cellule da embrioni zebrafish e catturare singole cellule utilizzando un chip e autoprep sistema disponibile commercialmente circuito microfluidica integrato (CFI) per qRT-PCR analisi di espressione genica. Questo protocollo può essere rapidamente trasferibili a qualsiasi test di throughput elevato di multiplazione tra cui interotrascrittoma sequenziamento che permette l'analisi più completa della eterogeneità cellulare 13. Inoltre, offre diversi vantaggi per analisi di espressione genica tradizionali. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule produce alta la vitalità dopo FACS, che diminuisce la proporzione di cellule compromesse che sono inclusi in applicazioni a valle. Utilizzando un IFC, le cellule catturate possono essere osservati direttamente per valutare i tassi di cattura e di valutare la salute delle cellule morfologicamente. Inoltre, questo protocollo è ampiamente applicabile per la comunità di ricerca zebrafish, che richiede solo una linea di pesce transgenico etichettati e l'accesso alle tecnologie di cattura microfluidica cellulare.

Come prova di principio, singole cellule derivate da progenitori cardiaci sono stati isolati e catturato su un chip IFC, e quindi la relativa abbondanza di marcatori di differenziazione cardiaci stata misurata qRT-PCR. analisi di espressione genica a livello di singola cellula dimostra che i progenitori cardiaci convivono con la loro differeprogenie ntiating. La conoscenza acquisita da profilatura cella singola di progenitori cardiaci può far luce su l'eterogeneità nei modelli di espressione genica tra cellule progenitrici cardiache durante lo sviluppo dei vertebrati, che potrebbe essere stato mascherato nelle analisi tradizionali basati sulla popolazione.

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Protocollo

Questo protocollo richiede l'utilizzo di vivo, zebrafish adulto per la produzione di embrioni. Gli embrioni vengono raccolti per la raccolta dei tessuti. E 'essenziale per ottenere l'approvazione da etici appropriati revisione schede per condurre questo esperimento.

1. Ottenere embrioni graduali

  1. Il giorno prima dell'esperimento, preparare sano, zebrafish adulti per la riproduzione. Inserire un maschio e una femmina su lati opposti di una netta barriera in un serbatoio di allevamento.
  2. Ripetere 1.1 a molti vasche di allevamento come necessari per la produzione di embrioni sufficiente per l'applicazione a valle. Ottenere embrioni da entrambi i pesci wild type e pesci transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti nel tipo cellulare di interesse.
    NOTA: Il numero di embrioni necessari per applicazioni a valle Fasi 2-8 dipende dalla abbondanza relativa delle cellule di interesse per il punto temporale di interesse. Anche se questo può variare a seconda del tipo di cellula, 200 embrioni producono 2,000-5,000 cellule ordinati quando la cbraccia di interesse rappresentano <1,0% delle cellule totali a 24 HPF (ore dopo la fecondazione).
  3. La mattina successiva, cambiare l'acqua nel serbatoio panatura trasferendo pesce a un serbatoio di allevamento fresco e rimuovere il divisore. Inclinare il serbatoio con un angolo per incoraggiare l'allevamento.
  4. Raccogliere gli embrioni in scena.
    1. Ogni 15 minuti, raccogliere gli embrioni trasferendo gli adulti ad un serbatoio di allevamento fresco e passando le uova, che sono lasciati alle spalle attraverso un colino da tè.
      NOTA: zebrafish embrioni si sviluppano in modo sincrono quando mantenuto a densità e temperature paragonabili.
    2. Lavare le uova con l'uovo d'acqua (0,21 g / L sali Ocean istantanei in acqua distillata doppia 1 L) e trasferimento in una capsula di Petri. Trasferire la capsula di Petri di un incubatore umida a 28,5 ° C con circolazione di aria.
  5. Due ore dopo l'ultima raccolta, ordinamento fecondato, embrioni multicellulari in 10 cm capsule di Petri e ridurre la densità a 50 embrioni per piatto. Selezionare gli embrioni provenienti da una singola, 15finestra temporale min di raccolta per l'applicazione a valle. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C.
    NOTA: Per esempio, raccogliere gli embrioni alle 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Confrontando attraverso punti di tempo, se il maggior numero di embrioni fecondati sono dalle grinfie raccolti alle 9:00, quindi utilizzare solo questi embrioni per applicazioni a valle.

2. Impostare per singola cella Dissociazione

  1. Circa 30 minuti prima del punto di tempo di interesse (18 HPF) rimuovere gli embrioni dalla loro corion manualmente con una pinza sottile.
  2. Raccogliere ed etichettare la seguente per ogni condizione: due 2 ml microprovette, uno di 40 micron colino cella, una 35 millimetri piatto di coltura cellulare, e due tubi FACS sormontato da un colino cella di 35 micron.
  3. Raffreddare i seguenti reagenti su ghiaccio: Uovo acqua contenente 0.21g / L sali Ocean istantanea in 1L di acqua bidistillata; De-yolking Buffer contenente 55 mM NaCl, KCl 1,8 mm e 1,25 mm NaHCO 3; e FACS tampone contenente del Leibovitz L-15 multimediale integrato con siero fetale bovino al 5% inattivato al calore.
  4. Portare 1 ml per campione di cellule dissociazione reagente 1 a RT. Scongelare 1 ml cellulare dissociazione reagente 2 per campione sul ghiaccio. Portare a Rt immediatamente prima dell'uso.

3. La dissociazione Single Cell

  1. Usando una pipetta di vetro un'ampia foro, trasferire 100-300 embrioni in una provetta da 2 ml microcentrifuga in un volume minimo di acqua Egg.
  2. Euthanize embrioni sostituendo l'acqua con 1 ml ghiacciata Egg Acqua e sommergendo tubo in ghiaccio per 20 min.
    ATTENZIONE! E 'fondamentale per ottenere l'approvazione da adeguata comitato di sorveglianza la cura degli animali istituzionale per questo metodo di eutanasia (agghiacciante sul ghiaccio seguito da dissociazione cellulare come l'eutanasia secondaria). l'eutanasia standard in genere richiede che gli embrioni <3 giorni dopo la fecondazione sono sbiancati dopo che sono stati refrigerati, che non è appropriato per l'ottenimento di cellule vitali.
  3. Lavare gli embrioni due volte con 1 ml ghiacciata Egg acqua. Per lavare, utilizzare una vasta pipetta di vetro foro per rimuovere Uovo acqua e un P1000 per aggiungere Egg acqua.
  4. Rimuovere il tuorlo sostituendo l'acqua embrione con 1 ml Deyolking tampone e triturazione 8-12 volte con una punta P1000, o fino a quando il tuorlo è sciolto e solo i corpi degli embrioni sono visibili.
  5. Raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 1 min. Usare una pipetta per rimuovere delicatamente il surnatante senza interrompere il precipitato di tessuto. Risospendere in 1 ml di acqua Egg.
  6. Ripetere il punto 3.5, per un totale di tre lavaggi, ma il lavaggio finale, risospendere in 1 ml di RT cellulare dissociazione reagente 1.
  7. Incubare in cella di dissociazione reagente 1 per 10 minuti a temperatura ambiente con tubi in posizione orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente con una pipetta P1000 per evitare grumi.
    NOTA: Maneggiare campioni delicatamente durante le fasi di triturazione. A volte un unico, grande gruppo si forma nel tubo da un groviglio di corpi embrionali. Questo saràdisperdere con la digestione ulteriore aiutato dalla leggera triturazione. NON FARE VORTEX.
  8. Raccogliere tessuti mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di cellule dissociazione reagente 2.
  9. Incubare per 5-15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente per evitare grumi. Ogni 5 min, valutare i progressi compiuti digestione.
    1. Per valutare i progressi compiuti digestione, diluire 2 ml surnatante in 18 microlitri FACS tampone e pipetta come una goccia su un piatto di coltura cellulare.
    2. Mettere un vetrino sul campione ed osservare sotto una cultura al microscopio del tessuto a 10X e 20X ingrandimenti.
      NOTA: La preparazione dovrebbe apparire come un insieme di celle singole, piccoli gruppi, grandi gruppi, e occasionali corpo dell'embrione per lo più intatto.
    3. Visivamente valutare la proporzione della preparazione che è singole cellule e piccoli cluster.
      NOTA: Over-digestione sarà ridurre la vitalità; sotto-digestione ridurrà singolo rendimento delle cellule.
  10. Raccogliere il preparato cellulare mediante centrifugazione a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 ml freddo FACS tampone.
  11. Inumidire un colino cella di 40 micron con FACS tampone. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro cella 40 micron su un piatto di coltura cellulare da 35 mm. Lavare il filtro delle cellule una volta con 1 ml FACS ordinamento buffer.
  12. Trasferire il flusso continuo in una provetta 2 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e risospendere in 100 ml FACS tampone.
  13. Conte rendimento delle cellule utilizzando un emocitometro. Ulteriori diluire i campioni di 5x10 6 cellule per ml, o la concentrazione ottimale consigliati per FACS macchina di scelta. Opzionale-Quando il conteggio delle cellule rendimento sul emocitometro, le cellule morte di contrasto con trypan blu per confermare la vitalità della preparazione cellulare prima di FACS ordinamento.
    NOTA: I preparativi che sono troppo diluito avrà eccesso quantità di tempo per ordinare. I preparativi che sono troppo concentrated tendono a raggrupparsi in multimeri e sono ottimali per l'ordinamento di una popolazione pura.
  14. Riserva il 10-20% di ciascun campione da utilizzare come controlli non colorati. Per i campioni rimanenti, le cellule morte macchia aggiungendo un guasto (L / D) discriminazione / live colorante fluorescente in ciascun campione. Non lavare.
    NOTA: Qualsiasi colorante fluorescente che penetra cellule con membrane cellulari compromesse e macchie acidi nucleici possono essere utilizzati come colorante L / D, a condizione che gli spettri di fluorescenza è compatibile con la macchina FACS di cellule scelta ed etichettatura fluoroforo di interesse.
    1. Non lavare la preparazione dopo aver aggiunto il colorante come alcune cellule moriranno in transito alla purificazione FACS e dovrebbero essere esclusi dalla popolazione ordinata.
  15. Inumidire il filtro 35 micron cella ricoperto tubo FACS con 20 microlitri di buffer FACS. Aggiungere cellule per il filtro e raccogliere per gravità. Conservare su ghiaccio.

4. FACS arricchimento

  1. Utilizzare FACS per arricchire per singolo, Cellule vive che esprimono il marcatore fluorescente.
    1. Impostare una porta per distinguere le cellule dai detriti su un grafico a dispersione di forward scatter (FSC-A) di ampiezza vs ampiezza lato scatter (SSC-A), entrambi con scala lineare.
      Attenzione cellule Zebrafish sono in genere più piccolo del mouse o cellule umane. Ciò si riflette in una separazione basale minore tra cellule e detriti.
    2. Dal cancello impostato in 4.1.1, impostare una porta per arricchire per singole cellule ed escludere multimeri utilizzando un grafico a dispersione di altezza avanti scatter (FSC-H) e bassa altezza laterale scatter (SSC-H), entrambi con scala lineare.
      NOTA: Celle con sproporzionatamente alta FSC-H e basso SSC-H sono probabili multimeri e sono esclusi dalla selezione.
    3. Dal set porta al punto 4.1.2, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive usando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l'ampiezza del canale utilizzato per rilevare L / D macchia con scala log. Includere cellule negative L / D.
    4. Da parte diil cancello situato in 4.1.3, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive con fluorescenza positiva utilizzando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l'ampiezza del canale utilizzato per rilevare marker delle cellule proteina fluorescente con scala di registro . Includi cellule positive.
    5. Regolare tutti i controlli di compensazione, se necessario, per tenere conto di interferenza tra la L / D macchia e spettri proteina fluorescente.
  2. logica sorta Set per le cellule che rientrano in tutte le porte impostati nella fase 4.1.
    1. Utilizzando cellule doppio etichettati, verificare gating per l'ordinamento delle cellule.
      NOTA: Le cellule per l'ordinamento sarà cellule piuttosto che detriti, singole cellule piuttosto che multimeri, L / D cellule positive negative e fluorescenza.
  3. Ordina 2000-4000 cellule dalla popolazione di interesse in 5 ml di freddo FACS tampone in una provetta su ghiaccio. Per minimizzare tranciatura e deformazione su cellule di cernita, utilizzare le pressioni più basse possibili per la cellasorter.
    NOTA: La gocciolina 5 microlitri di tampone FACS funge da ammortizzatore per le cellule in uscita della macchina FACS. Raccolta 2000-4000 cellule direttamente nel FACS Buffer elimina la necessità di centrifugazione prima di caricare sui chip IFC. Questa strategia è raccomandato perché centrifugazione può portare alla formazione di multimeri se le cellule aderiscono l'uno all'altro nel pellet.
  4. Valutare la fattibilità analisi post-specie.
    1. Trasferire 1 ml cellule ordinati ad un tubo FACS fresco con 100 ml FACS ordinamento tampone e 1: 1000 diluizione L / D macchia. Far passare le cellule attraverso il sorter FACS con la strategia di gating al punto 4.1. Utilizzare la proporzione di L / D negativo a positivo stimare vitalità delle cellule ordinati.

5. Le cellule caricare sul microfluidica Chip

  1. Utilizzando un emocitometro, misurare sia la concentrazione e la dimensione delle cellule ordinati.
    1. Diluire le cellule ordinati ad almeno 10 ml. Diluire un'aliquota del 5 μ; Celle l con 5 ml trypan blu. Caricare sul emocitometro e applicare vetrino.
    2. Raccogliere le immagini in campo chiaro di tutte le cellule in 4 x 4 griglie di emocitometro. Contare il numero di cellule vive e calcolare vivi cellule / ml. cellule vive non occupano trypan blu.
      NOTA: utilizzare qualsiasi software di analisi delle immagini standard per misurare il diametro di tutte le cellule vive. Calcolare la deviazione media e standard della dimensione della cella, e selezionare una piastra IFC adatto al calibro cella di interesse. Se gamma dimensione della cella si trova a cavallo di dimensione celle piatto IFC, utilizzare più piatti per catturare l'intera gamma di cellule di interesse.
  2. Le celle di carico su di IFC piatto secondo le istruzioni del produttore (vedi Materiali).
    1. Diluire le cellule a 1x10 6 cellule / ml e di eseguire l'ottimizzazione dell'assetto secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: ottimizzazione galleggiabilità assicura che le cellule non si depositano sul fondo né a galla della WEL caricol per il carico ottimale su chip di IFC. Il rapporto di tampone di cellule può variare secondo il tipo cellulare, ma varia tipicamente 6: 4-7: 3 di celle: buffer.
    2. Aggiungere cellule per piastra-IFC innescato. Piatto di carico in macchina fluidica compatibile, ed eseguire uno script di carico delle cellule di spingere le cellule attraverso il circuito microfluidica e in corsie di cattura.
  3. Verificare che le cellule sono alloggiati in siti di cattura sulla piastra IFC.
    1. Rimuovere IFC piatto dalla macchina fluidica. Montare la piastra di IFC su un microscopio dotato di una piastra di adattamento.
    2. Raccogliere istantanee di campo chiaro e fluorescenza per ogni sito di cattura a 10X di ingrandimento.
      NOTA: Campo chiaro volte di acquisizione possono variare da 10-50 ms, a seconda della intensità della lampada. i tempi di acquisizione fluorescenza possono variare da 250-750 ms, a seconda della luminosità fluoroforo. Evitare di sovraesposizione cellule per prevenire fotodanneggiamento.

6. cDNA Synthesis

  1. Eseguire lisi cellulare in situ in base al Ile istruzioni del produttore piatto FC.
    1. Aggiungere i buffer di lisi ai pozzetti sulla piastra IFC. Piatto di carico sulla fluidica compatibili macchina e lo script lisi cellulare corsa secondo le istruzioni del produttore.
  2. Eseguire la trascrizione inversa in base alle istruzioni del produttore piatto IFC.
    1. Aggiungere i reagenti trascrizione inversa alla piastra di IFC. Piatto di carico sulla macchina fluidica compatibili. Eseguire lo script trascrizione inversa. Esempi di condizioni di ciclo: 1 ciclo a 25 ° C per 10 min, 1 ciclo a 42 ° C per 1 ora, poi 1 ciclo a 85 ° C per 5 min.
  3. Eseguire pre-amplificazione con sonde gene-specifici in base alle istruzioni del produttore piatto IFC.
    NOTA: A causa della loro maggiore specificità con i numeri a basso copiare, utilizzare sonde fluorogeniche marcato piuttosto che le sonde ottimizzati per l'uso con coloranti intercalanti.
    1. primer Pool e diluire a finale 180 nm ciascuno. Aggiungere primer in pool al piatto IFC. Piatto di carico su fluidi compatibilimacchina cs. script di preamplificazione Esegui.
  4. Eseguire pre-amplificazione con le seguenti condizioni di ciclo: 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, quindi 18 cicli con denaturazione a 95 ° C per 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 4 min. Conservare pre-amplificato cDNA a 4 ° C fino alla raccolta. Harvest cDNA dalla piastra microfluidica in base alle istruzioni del produttore e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

7. Selezionare cDNA da singole cellule per singolo obiettivo qRT-PCR

  1. Diluire cDNA in 25 reagente di diluizione ml in base alle istruzioni del produttore.
    NOTA: resa finale è di circa 28 ml di cDNA pre-amplificata per cella. Prenotare una aliquota di diluente per uso come controllo non-template in qRT-PCR.
    1. Riferendosi al campo chiaro e le immagini fluorescenti registrate nella fase 5.3.2, segnare ogni sito di cattura. contare manualmente e registrare il numero di cellule. Valutare e registrare se ogni cella è l'influenzaorescent.
      NOTA: Ogni singolo sito può contenere 0, 1, o> 1 cella, dove> 1 cella include siti di cattura che contengono più celle e / o detriti non identificabile. Se le immagini sono qualità sufficiente, un valore di pixel può anche essere assegnata per quantificare l'intensità del segnale di fluorescenza.
  2. Selezionare i campioni per l'analisi qRT-PCR.
    1. Selezionare campioni di cDNA da siti di cattura identificati nella fase 7.2 che contengono esattamente 1 cella con fluorescenza positiva. Pool 1 ml aliquote di cDNA da ciascun campione.
      NOTA: Questo è il controllo positivo "Pool" utilizzato per determinare se i geni di interesse sono espressi in una qualsiasi delle celle selezionate.
    2. Selezionare cDNA da almeno un sito di cattura che contiene esattamente 0 cellule come controllo negativo. Utilizzare diluente dal punto 7.1.2 come un controllo non-modello.
  3. Eseguire test di qRT-PCR.
    1. Utilizzare solo sonde utilizzate per la pre-amplificazione in fase 6.4.1. Caricare tutti i campioni in triplicate. condizioni bicicletta per una reazione di 10 microlitri su 384 pozzetti: 1 ciclo a 50 ° C 2 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, 40 cicli con denaturazione a 95 ° C 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 1 min.

Analisi 8. Dati

  1. Convalida qRT-PCR prodotti mediante elettroforesi su gel standard. Confermare prodotto è una singola banda a peso molecolare atteso (varia per ogni sonda).
    NOTA: Se una sonda produce più bande o una singola banda in una dimensione inadeguato, allora la specificità è discutibile, e questo esclude il gene dall'analisi.
  2. Esaminare tutte le curve di amplificazione e tenere conto di eventuali anomalie 14. Calcolare il valore medio CT per ogni combinazione campione / gene 15.
    NOTA: valori CT per i controlli positivi in ​​genere varia 10-30. valori CT per i controlli negativi in ​​genere varia 35-40 (senza amplificazione). valori CT 30-35 sono considerati molto bassa espressionee dovrebbero essere interpretati con cautela 14.
  3. I dati del rapporto
    1. Se i campioni cadono nel CT = 10-30, i dati possono essere segnalati anche come cambiamento volte trascrizione abbondanza relativa ad un campione di controllo.
      NOTA: Fold cambiamento è uguale a 2 ^ (- ΔΔCT) dove ΔCT è relativa a un gene housekeeping sottraendo la media CT del campione del gene housekeeping e ΔΔCT è le differenze di ΔCT tra il campione e un controllo positivo 15.

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Risultati

Come prova di principio, l'espressione del gene è stata valutata per esplorare le dinamiche di differenziazione durante lo sviluppo cardiaco. In zebrafish, i progenitori cardiaci derivano da una popolazione mesoderma di cellule che migrano verso il mesoderma piastra laterale anteriore dove si fondono per formare il tubo cuore lineare. Prima della fusione, i progenitori cardiaci iniziare ad esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), che è pensato per essere...

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Discussione

Il metodo qui descritto utilizza espressione di una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico tipo cellulare per arricchire una popolazione di cellule progenitrici cardiache da embrioni di zebrafish per l'uso nel sistema di assistita acquisizione singola cella microfluidica per valutare l'espressione di un sottogruppo di geni cardiaci nei singola cellule. A condizione che le capacità FACS eccitazione laser e di emissione sono compatibili con il fluoroforo (s) di scelta, questo metodo può...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. C. Geoffrey Burns per il pesce. Gli autori sono grati all'UNC Flow Cytometry Core Facility, all'UNC-CGIBD AAC core per le risorse che hanno reso possibile questo progetto e alla struttura ZAC per la cura degli animali. L.S. è supportato dalla sovvenzione NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. è supportato dalla NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. Questo studio è stato supportato da NIH P30DK034987 grant (a UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 e Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (al Dr. Qian) e NIH R00 HL109079 grant (al Dr. Liu).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Supplies
Dumont #5 pinzeFine Science Tools11254-20Per rimuovere il corion dagli embrioni Provetta
microcentrifuga 2 mlGeneMateC-3261-1
Filtro cellulare da 40 umBiobasicSP104151
piatto di coltura da 35 mmFalcon351008
I tubi FACS sormontati da un filtro cellulare da 35 umFalcon352235
P1000 e punteRainin17005089
P20 e punteRainin17005091
protocollo del produttore di chip IFCFluidigm100-6117Versione 100-6117 E1 è stato utilizzato in un esperimento rappresentativo
Pippette in vetro pastuer a foro largoVWR14673-010per trasferimento di embrioni
Pesce zebra adulto di tipo selvaticoN/AAbbiamo usato la linea AB
Pesce zebra transgenico adultoN/AAbbiamo usato Tg(nkx2.5:ZsYellow)
NameCompanyNumero di catalogoComments
Reagenti per la dissociazione cellulare
Acqua distillata doppiaN/A
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
NaClFisherScientificS271-3fare brodo in acqua e utilizzare per il tampone de-yolking
KClSigmaAldrich P5405fare stock in acqua e utilizzare per il de-yolking buffer
NaHCO3Sigma AldrichS6014fare brodo in acqua e utilizzare per il tampone di de-yolking
Leibovitz's L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511Inattivare il calore; qualsiasi marca di FBS dovrebbe andare bene
Reagente di dissociazione cellulare 1 -TrypLELife Technologies12605-010Conservare a temperatura ambiente.
Reagente per dissociazione cellulare 2 - FACSmaxGenlantisT200100Store -20; scongelare con ghiaccio; portare a temperatura ambiente prima dell'uso
pronasi (opzionale)Colorante SigmaP5147
L/D - Sytox BlueLife TechnologiesS34857Qualsiasi colorante vivo/morto adatto alla citometria a flusso funzionerà
Trypan BlueGibco15250-061
Nome AziendaNumero di catalogoComments
Reagenti per l'uso su piastre IFC e qRT-PCR
Sonde specifiche perLe sonde variano in base all'esperimento
TaqMan Probe ef1aLife TechnologiesDr03432748_m1
TaqMan Probe gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
TaqMan Probe myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
TaqMan Probe vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
TaqMan Probe isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master MixLife Technologies4369016
Reagenti elencati nel protocollo
Kit di reagenti C1Fluidigm100-5319Reagenti per il caricamento di cellule su piastra IFC
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237 Reagenti per fasi di trascrizione inversa e pre-amplificazione
Biologia molecolare Acqua di qualitàCorning46-000CM
C1 IFC per PreAmp (5-10 um)Fluidigm100-5757Piastra IFC per piccole cellule
NameCompanyNumero di catalogoComments
>Equipment
Macchina C1 AutoPrepFluidigm100-5477Per l'emocitometro per uso su piastra IFC
 Sigma AldrichZ359629Per il conteggio delle cellule e la valutazione delle dimensioni delle cellule
MicroscopioPer la rimozione di embrioni dal chorion
colture tissutaliPer la valutazione della digestione di singole cellule
MacchinaPer l'isolamento di cellule di interesse
per gene IFC del produttore da dissezione Microscopio per FACS

Riferimenti

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