Articolo metodologico

La conversione epigenetico come un metodo semplice e sicuro per ottenere cellule che secernono insulina da adulti fibroblasti cutanei

DOI:

10.3791/53880

⸱

18 marzo 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In questo articolo

Sommario

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Qui, viene presentato un nuovo metodo che consente la conversione di fibroblasti cutanei adulti in cellule secernenti insulina. Questa tecnica si basa sulla conversione epigenetica, non prevede l'utilizzo di vettori retrovirali né l'acquisizione di uno stato pluripotente stabile. È quindi molto promettente per le applicazioni della medicina traslazionale.

Abstract

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La medicina rigenerativa richiede nuove cellule completamente funzionali che vengono consegnate ai pazienti per riparare tessuti degenerati o danneggiati. Quando tali cellule non sono prontamente disponibili, possono essere ottenute utilizzando diversi approcci che includono, tra i tanti, la riprogrammazione e la trans-differenziazione, con vantaggi e limiti specifici delle diverse tecniche. Qui viene descritta una nuova strategia per la conversione di un fibroblasto adulto maturo in una cellula secernente insulina, arbitrariamente designata come cellule convertite epigenetiche (EpiCC). Il metodo è stato sviluppato sulla base della crescente comprensione dei meccanismi che controllano la regolazione epigenetica del destino cellulare e del differenziamento. In particolare, la prima fase utilizza un modificatore epigenetico, vale a dire la 5-aza-citidina, per portare le cellule adulte in uno stato "altamente permissivo". Sfrutta quindi questa breve e reversibile finestra di plasticità epigenetica, per reindirizzare le cellule verso un lignaggio diverso. L'approccio è denominato "conversione cellulare epigenetica". È un modo semplice e robusto per ottenere un interruttore di interlinea cellulare efficiente, controllato e stabile. Poiché il protocollo non prevede l'uso di alcuna trasfezione genica, è privo di vettori virali e non comporta uno stato pluripotente stabile, è molto promettente per le applicazioni di medicina traslazionale.

Introduzione

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Un obiettivo fondamentale della medicina rigenerativa è la generazione di nuove cellule funzionali che possono essere utilizzati per riparare o sostituire danneggiato, degenerata tessuti. Rifare cellule adulte facilmente disponibili in nuovi, convertendoli da un tipo di cellula all'altra, è un approccio particolarmente interessante, soprattutto quando la popolazione di cellule richiesta non è abbondante o di difficile accesso. Tuttavia, le cellule adulte sono molto stabili. Acquisiscono il loro stato differenziato attraverso una restrizione graduale nelle loro opzioni e, una volta raggiunta la specializzazione terminale maturo, hanno stabilmente conservarlo 1.

Negli ultimi anni sono state sviluppate una serie di protocolli, che consentono la riprogrammazione di pluripotenza di una cellula somatica (IPS) ottenuta attraverso l'espressione forzata di una serie di fattori di trascrizione 2,3. In alternativa, la conversione cella può essere ottenuto transdifferenziazione discendenza diretta, introducendo un unico 4 o una combinazione di fattori di trascrizione 5-7. Questa strategia non comporta il passaggio attraverso uno stato de-differenziati ma richiede elevata espressione della trascrizione specifici fattori 8.

Abbiamo recentemente sviluppato un protocollo di conversione basato sulla breve esposizione di cellule adulte alle proprietà demetilanti della citidina analogico 5-azacitidina (5-aza-CR), un inibitore della DNA metiltransferasi ben caratterizzato. Il passo demetilazione è immediatamente seguito da uno specifico protocollo di differenziazione 9-11 che permette di ottenere il fenotipo morsetto desiderato. Questo metodo è in grado di convertire maturi, cellule differenziate in cellule di diversa stirpe e presenta il notevole vantaggio di evitare sia l'uso di vettori virali e la trasfezione di eventuali fattori di trascrizione esogeni. L'acquisizione di uno stato pluripotente stabile, e il relativo aumento della suscettibilità alle cella instabilità è anche evitato.

Il protocollo dettagliato che permette la conversione di adulti fibroblasti cutanei umani in cellule che secernono insulina completamente funzionale qui viene presentato. Tuttavia, è opportuno notare che la tecnica è stata applicata a diversi tipi di cellule ed ha generato risultati positivi, rivolgendosi cellule verso diverse vie di differenziazione. Inoltre, la conversione epigenetica è stato usato con successo nella specie umana e suina 9-13 e nel cane (manoscritto presentato) suggerendo un'ampia efficacia e la robustezza del metodo.

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Protocollo

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Nota: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere eseguite sotto cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Assicurarsi che tutte le procedure di coltura vengono effettuate sui palchi termostatiche e le cellule vengono mantenute a 37 ° C in tutta la movimentazione.

Isolamento dei fibroblasti della pelle 1.

  1. Preparare cultura piatto Coating Soluzione
    1. Sciogliere 0.1 g di gelatina porcina in 100 ml di acqua (concentrazione finale 0,1%). Sterilizzare soluzione con autoclave.
    2. Aggiungere 1,5 ml di sterile 0,1% di gelatina suina a 35 mm piastre di Petri. Attendere 2 ore a cappotto, mantenendoli a temperatura ambiente.
      Nota: biopsie di cute umana sono raccolti da escissione in anestesia locale da una zona avascolare della faccia anteriore dell'avambraccio e memorizzati in Dulbecco Phosphate Buffered Saline (PBS) addizionato con 2% di soluzione antimicotico antibiotico a + 4 ° C prima dell'uso.
  2. biopsie essere lavata con nuovo PBS integrato con il 2% antibisoluzione antimicotico otic.
  3. Luogo biopsie in un piatto 100 millimetri di Petri e tagliate a circa 2 mm 3 frammenti con bisturi sterili.
  4. Rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso immediatamente prima placcatura frammenti.
  5. Mettere 5-6 frammenti di pelle nel piatto pre-rivestito 35 millimetri Petri.
  6. Preparare terreno di coltura di fibroblasti: 77% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) alta di glucosio, il 20% siero fetale bovino (FBS), 1% soluzione di L-glutammina e il 2% soluzione antimicotico antibiotico.
  7. Aggiungere una goccia di mezzo di fibroblasti su ciascun frammento (di solito 100 pl per frammento) e coltura a 37 ° C in 5% CO 2.
  8. Dopo 24 ore, aggiungere 500 ml di mezzo di coltura di fibroblasti nei frammenti per tenerli umido a 37 ° C in 5% CO 2.
  9. Cambiare il mezzo con una pipetta, almeno una volta ogni 48 ore.
  10. Dopo 6 giorni di incubazione, rimuovere frammenti di tessuto con attenzione e gettarli.
    Nota: Dopo 6 giorni, dei fibroblastis iniziano a crescere fuori dai frammenti di tessuto e cominciare a formare un monostrato di cellule.
  11. Aggiornare media, aggiungere 2 ml di terreno di coltura di fibroblasti e continuare la cultura monostrato di cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.

2. Cultura fibroblasti

  1. Fibroblasti Culture a 37 ° C in 5% di CO 2 fino all'80% di confluenza
  2. Per passaging, terreno di coltura di fibroblasti aspirato dai piatti di coltura di tessuti. Lavare le cellule tre volte con 4 ml di PBS completato con 1% di soluzione antimicotico antibiotico.
  3. Aggiungere uno strato sottile (10% del volume di coltura) di soluzione di tripsina-EDTA (0,5 g / L porcine tripsina e 0,2 g / L EDTA) e incubare a 37 ° C fino monostrato cellulare comincia a staccarsi dal fondo del tessuto cultura piatto e le cellule si dissociano.
  4. Diluire sospensione cellulare con 9 parti di terreno di coltura di fibroblasti di neutralizzare l'azione tripsina. Centrifugazione non è necessaria.
  5. cellule piastra in nuove piastre di coltura (conout gelatina) e cultura a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Mantenere il rapporto passaggio tra 1: 2 e 1: 4, a seconda del tasso di crescita.
  6. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, loro passaggio (di solito due volte a settimana).

3. fibroblasti placcatura per Epigenetic conversione

  1. Aggiungere 0,26 ml / cm 2 di 0,1% di gelatina porcina (preparare come descritto in 1.1) ai piatti di coltura cellulare. Attendere 2 ore a cappotto.
  2. Rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso 10-30 minuti prima placcatura fibroblasti.
  3. Togliere terreno di coltura di fibroblasti da piatti della cultura. Lavare le cellule tre volte con PBS completato con 1% di soluzione antimicotico antibiotico.
  4. Aggiungere uno strato sottile (10% del volume di coltura) di soluzione di tripsina-EDTA (0,5 g / L porcine tripsina e 0,2 g / L EDTA) e incubare a 37 ° C fino monostrato cellulare comincia a staccarsi dal fondo del tessuto cultura piatto e le cellule si dissociano.
  5. Diluire sospensione cellulare con 9 parti di fibroblast terreno di coltura per neutralizzare l'azione tripsina.
  6. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio al microscopio a temperatura ambiente. Calcolare il volume richiesto di terreno di coltura fibroblasti per risospendere le cellule, per ottenere una concentrazione cellulare di 7,8 x 10 4 fibroblasti / cm 2. Questo dipende dal tipo specifico di camera utilizzata.
    Le cellule / ml = Numero medio di cellule per piccola griglia x 90 (fattore di moltiplicazione) x diluizione
  7. sospensione cellulare Centrifugare a 150 g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con il volume precedentemente calcolato di terreno di coltura di fibroblasti.
  8. Cellule piastra su 0,1% di gelatina piatti e li coltura per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore pre-rivestito.

4. Aumentare cellulare plasticità Utilizzando il De-metilazione Agente 5-aza-CR

  1. giorno 0
    1. Preparare 5-aza-CR soluzione madre sciogliendo 2,44 mg di 5-aza-CR in 10 ml di DMEM alta medi di glucosioum. Sterilizzare per filtrazione. Preparare 5-aza-CR magazzino immediatamente prima dell'uso.
    2. Diluire 1 ml di 5-aza-CR soluzione madre in 1 ml di terreno di coltura di fibroblasti (concentrazione finale 1 micron).
    3. Per aumentare la plasticità delle cellule, 24 ore dopo la placcatura cella (sottovoce 3.8), togliere terreno di coltura da fibroblasti semi e aggiungere 1 micron 5-aza-CR soluzione di riserva e la cultura per 18 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
  2. Giorno 1
    1. Preparare mezzo fresco umane pluripotenti (HP) come descritto nella Tabella 1.
    2. Dopo l'incubazione con 1 pM 5-aza-CR, rimuovere medie e lavare le cellule tre volte con PBS per garantire che 5-aza-CR viene sciacquato via.
    3. Incubare 5-aza-CR fibroblasti trattati con HP medio per 3 ore (periodo di recupero) a 37 ° C in 5% CO 2.
    4. Dopo il periodo di recupero, rimuovere media, lavare tre volte con PBS.
    5. Per monitorare l'efficienza delle 5-aza-CR trattamento, il check-in questa fase fo la presenza di alterazioni morfologiche (indicato nella sezione Risultati). Le cellule perdono la morfologia tipica forma allungata dei fibroblasti e acquisiscono una forma rotonda o ovale, diventando di dimensioni più piccole, con i nuclei allargati.
    6. Procedere con la differenziazione del pancreas.

5. pancreas Differenziazione protocollo

  1. giorni 1-6
    1. Preparare al pancreas basale medio, come descritto nella tabella 2.
    2. Preparare activina Una soluzione madre: sciogliere 5 mg di activina una proteina umana ricombinante a 166,6 ml di acqua sterile.
    3. Cultura 5-aza-CR fibroblasti trattati in 0,26 ml / cm 2 di pancreas basale medio, integrato con 1 ml / ml activin una soluzione di riserva (vedi 5.1.2) per 6 giorni a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Cambiare media giornaliera.
  2. giorni 7-8
    1. Preparare l'acido retinoico soluzione madre con l'aggiunta di 16,6 ml di dimetilsolfossido (DMSO) a 50 mg di aci retinoicod.
    2. Cellule di coltura a 0,26 ml / cm 2 di pancreas basale medio integrato con 1 ml / ml activina una soluzione di riserva (vedi 5.1.2) e ml di soluzione 1 ml / acido retinoico magazzino (vedi 5.2.1) per 2 giorni a 37 ° C nel 5% di CO 2. Cambiare media giornaliera.
  3. giorni 9-36
    1. Cellule di coltura a 0,26 ml / cm 2 di pancreas basale medio integrato con 1% (v / v) di insulina-transferrina-selenio (ITS), 2% (v / v) B27 e 0,1% (v / v) ricombinante FGF umani fondamentali soluzione madre (bFGF) (vedi tabella 1) a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Cambiare la media giornaliera per i primi 15 giorni.
    2. Dal giorno 16 in poi, aggiornare medio ogni altro giorno, al microscopio, poiché formare celle aggregati possono staccarsi dal fondo del piatto di coltura.

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Risultati

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Istituzione di colture primarie da biopsie cutanee
biopsie cutanee sono stati tagliati in piccoli frammenti e messi in gelatina piatti pre-rivestiti. Dopo 6 giorni, fibroblasti cominciato a crescere fuori dei frammenti di tessuto e ha formato un monostrato di cellule (Figura 1A). Le cellule hanno mostrato una tipica forma allungata e, come previsto, visualizzati un'uniforme immuno-positività per fibroblasto specifico vimentina marcatore (Vim, Figura 1B).

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Discussione

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La presente manoscritto descrive un metodo che permette la conversione dei fibroblasti della pelle umana in cellule che producono insulina, attraverso una esposizione transitoria e breve a 5-aza-CR, seguito da uno specifico protocollo di induzione tessuto. Questo approccio consente il passaggio da mesoderma alle cellule legate endoderma, senza l'espressione forzata di fattori di trascrizione o microRNAs né l'acquisizione di uno stato stabile pluripotenti, che rende le cellule più instabile e soggetto a errori

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carraresi e Fondazione Europea per lo Studio del Diabete (EFSD). GP è supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'Università degli Studi di Milano. Gli autori sono membri del COST FA1201 Epiconcept: ambiente epigenetica e Periconception e l'azione COST BM1308 condivisione avanza su grandi modelli animali (SALAAM). TALB è membro del COST CM1406 epigenetica Chemical Biology (EPICHEM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoSigmaD5652PBS; per il lavaggio cellulare e la preparazione di soluzioni
Soluzione antibiotica antimicoticaSigmaA5955Componente di fibroblasti, HP e terreni pancreatici
Piastra di Petri da 100 mmSarstedt83.3902Per l'isolamento dei fibroblasti
Gelatina suinaSigmaG1890Per il rivestimento delle stoviglie
AcquaSigmaW3500Per la preparazione di soluzioni
Piastre di Petri da 35 mmSarstedt83.39Per l'isolamento di fibroblasti
DMEM, alto glucosio, piruvatoLife Technologies41966052Per terreno di coltura di fibroblasti
Siero fetale bovinoLife Technologies10500064FBS; Componente di fibroblasti e mezzi HP
Soluzione di L-glutamminaSigmaG7513Componente di fibroblasti, HP e terreni pancreatici
Soluzione di tripsina-EDTASigmaT3924Per la dissociazione dei fibroblasti
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 CON GRIGLIEHycor Biomedical87144Conteggio delle cellule
5-AzacitidinaSigmaA23855-aza-CR, per cellule increrasi plasticità nei fibroblasti
Miscela di nutrienti F-10 di Ham'sLife Technologies31550031Per HP
medio DMEM, basso glucosio, piruvatoLife Technologies31885023Per HP medium
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828028Componente di HP medium
MEM Soluzione di aminoacidi non essenzialiLife Technologies11140035Componente di HP e terreno basale pancreatico
2-MercaptoetanoloSigmaM7522Componente di HP e terreno basale pancreatico
GuanosinaSigmaG6264Componente stock della miscela nucleosidica del medio HP
AdenosinaSigmaA4036Componente stock della miscela nucleosidica del medio
HP CitidinaSigmaC4654Componente stock della miscela nucleosidica del medio HP
UridinaSigmaU3003Componente madre della miscela nucleosidica di HP medio
TimidinaSigmaT1895Componente madre della miscela nucleosidica di HP medio
Millex-GS 0,22 &; mMilliporeSLGS033SBPer la sterilizzazione della soluzione
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human ProteinLife TechnologiesPHG0261bFGF; Componente dell'HP e del medio basale pancreatico
Albumina bovinaSigmaA3311BSA; Componente del terreno basale pancreatico
DMEM/F-12Life Technologies11320074Per il mezzo basale pancreatico
Integratore B-27 Meno vitamina ALife Technologies12587010Componente del mezzo pancreatico
Integratore N-2 LifeTechnologies17502048Componente del mezzo basale pancreatico
Activina A Proteina umana ricombinanteLife TechnologiesPHG9014per il terreno pancreatico
Acido retinoicoSigmaR2625Per il mezzo pancreatico
Dimetil solfossidoSigmaD2650DMSO; per la preparazione di pasta per acido retinoico
Insulin-Transferrina-SelenioLife Technologies41400045ITS; per il terreno finale pancreatico
Anticorpo anti-Vimentina Abcamab8069Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:100
4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridratoSigma32670DAPI. Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro  1 µ g/ml
5-metilcitidinaEurogentecMMS-900P-BPer analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:500
Anti-C Peptide anticorpo Abcamab14181Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:100
Anticorpo Anti-PDX1 Abcamab47267Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:500
Mercodia Insulina ELISAMercodia10-1113-10Per il rilevamento del rilascio di insulina

Riferimenti

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  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

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