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Articolo metodologico

Un Tessuto 3D combinata Engineered

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⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

6 aprile 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un modello tridimensionale (3D) di cancro del polmone basato su un'impalcatura biologica di collagene per studiare la sensibilità verso terapie mirate al cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC). Dimostriamo diverse tecniche di lettura per determinare l'indice di proliferazione, l'apoptosi e lo stato di transizione epitelio-mesenchimale (EMT). I dati raccolti sono integrati in un modello in silico per la previsione della sensibilità ai farmaci.

Abstract

Nel presente studio, abbiamo combinato un 3D polmone modello in vitro tumore con un modello in silico per ottimizzare le previsioni di risposta ai farmaci sulla base di uno specifico background mutazionale. Il modello è generato su un ponteggio suina decellularized che riproduce le caratteristiche tessuto-specifici per quanto riguarda la composizione della matrice extracellulare e l'architettura tra cui la membrana basale. Abbiamo standardizzato un protocollo che permette la generazione di tessuto tumorale artificiale entro 14 giorni di cui tre giorni di trattamento farmacologico. Il nostro articolo fornisce diversi descrizioni dettagliate di 3D lettura le tecniche di screening, come la determinazione del indice di proliferazione Ki67 colorazione, l'apoptosi da surnatanti da M30-ELISA e la valutazione dei epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), che sono strumenti utili per valutare l'efficacia delle composti terapeutici. Abbiamo potuto dimostrare rispetto alla cultura 2D una riduzione della proliferazione nel nostro modello di tumore in 3D che è relatcato alla situazione clinica. Nonostante questa proliferazione più bassa, il modello previsto EGFR risposte farmacologiche -targeted correttamente in base allo stato biomarker come dimostra il confronto delle linee cellulari di carcinoma del polmone HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) e A549 (EGFR wild-type, KRAS - mutato) trattati con il gefitinib inibitore della tirosin-chinasi (TKI). Per studiare le risposte farmacologiche di cellule tumorali più avanzate, abbiamo indotto EMT da un trattamento a lungo termine con TGF-beta-1 come valutato dal vimentina / immunofluorescenza pan-citocheratina. Un flusso-bioreattore è stato impiegato per regolare la cultura a condizioni fisiologiche, che ha migliorato la generazione dei tessuti. Inoltre, mostriamo l'integrazione di risposta ai farmaci in seguito al trattamento con Gefitinib o TGF-beta-1 stimolazione - apoptosi, indice di proliferazione e EMT - in un valore booleano nel modello di silico. Inoltre, spieghiamo le risposte come farmaco di cellule tumorali con uno specifico background mutazionale e conteggioerstrategies contro la resistenza possono essere previsti. Siamo sicuri che il nostro 3D nell'approccio vitro in particolare con la sua espansione in silico fornisce un valore aggiunto per il test anti-droga preclinica in condizioni più realistiche che in coltura cellulare 2D.

Introduzione

L'industria farmaceutica sta affrontando alti tassi di attrito fino al 95% nel campo del trattamento del cancro in fase clinica causando costi enormi 1-5. Una ragione di questo deficit è il fatto che attualmente efficacia di potenziali nuovi composti è valutata in screening su larga scala su colture cellulari 2D su linee cellulari di cancro o in modelli animali. I modelli animali hanno una maggiore complessità, ma ci sono differenze cruciali tra i topi e gli uomini 6,7. Negli ultimi dieci anni, modelli di cancro 3D utilizzando diversi approcci sono stati generati per colmare il divario tra la cultura 2D delle linee di cellule di cancro e di un complesso 6,8,9 vivo del tumore. L'impatto ambientale 3D sulla differenziazione cellulare e anche sul segnale è stato dimostrato in diversi studi anni fa (ad es., Da Mina Bissell) 10,11. Oggi, molti modelli di coltura cellulare 3D sono disponibili, come le culture sferoide, idrogeli o chip microfluidica 12-16. Anche se These modelli migliorano la complessità rispetto ai sistemi di coltura convenzionale 2D, la maggior parte essi mancano di un microambiente tessuto che è noto per avere effetti tumorali di supporto e anche gli impatti efficacia del farmaco.

Per risolvere questo problema, abbiamo generato un modello di tumore 3D basata su una impalcatura biologica chiamato SISmuc (piccolo intestino-sottomucosa + mucosa) che è derivato da un digiuno suina decellularized. In tal modo, l'architettura dei tessuti e importanti componenti della ECM come diversi collageni nonché la struttura membrana basale sono conservati 17. Questa caratteristica unica è fondamentale per la generazione modello di tumore di carcinomi che derivano da epiteli e costituiscono circa l'80% dei tumori solidi. Inoltre, il tasso di proliferazione nel nostro modello di tumore tissutale è ridotta rispetto ai tassi artificialmente elevati raggiunti nella cultura 2D. Come proliferazione è un parametro importante per valutare l'efficacia dei farmaci, droga test è abilitato nel nostro modello più similecondizioni per in vivo Tumori 17.

Al fine di valutare il potenziale del nostro modello per prevedere biomarcatore-dipendente efficacia dei farmaci correttamente, i dati qui presenti per due diverse linee di cellule di cancro al polmone che si differenziano per il loro stato di EGFR -biomarker. Questo stato mutazionale ha iniziato ad essere determinato di routine in pazienti con NSCLC. Trattamenti mirati con TKIs come l'EGFR, inibitore della gefitinib contro i tumori recanti un attivando mutazione dell'EGFR mostrano risultati superiori rispetto a quelli con la chemioterapia a base di platino 18-21.

Abbiamo stabilito diverse tecniche di read-out che sono rilevanti per la valutazione dell'efficacia composto. Inoltre, dopo il TGF-beta-1 stimolazione siamo in grado di indagare le azioni composti nelle cellule tumorali che hanno iniziato il processo di EMT, che è pensato per essere un passo importante nella trasformazione maligna 22,23 e che è collegato a resistan di drogace 24.

Il modello di tumore 3D consentire il monitoraggio delle risposte specifiche delle celle a trattamenti mirati, la chemioterapia, o combinazioni di farmaci con buoni contrasti. Per migliorare ulteriormente e velocizzare droga screening e ad incontrare resistenza, è completato da una simulazione in silico. Sulla base di alcuni esperimenti, la risposta tumorale può essere previsto in silico per quanto riguarda il risultato per una gamma completa di farmaci e loro combinazioni.

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Protocollo

1. bidimensionale (2D) Cell Culture

  1. Commercialmente ottenere linea di cellule tumorali HCC827 (DSMZ). Cultura della linea di cellule di adenocarcinoma polmonare HCC827 (EGFR mutato, KRAS wild-type) in RPMI-1640 integrato con 20% FCS. Cambiare media ogni 2 - 3 giorni. Dividere le cellule due volte a settimana. Le cellule sono utilizzati fino a raggiungere passaggio 20.
  2. Commercialmente ottenere tumore linea cellulare A549 (DSMZ). Cultura del carcinoma del polmone linea cellulare A549 (EGFR wild-type, KRAS mutato) in RPMI-1640 supplementato con 10% FCS. Eseguire la cultura come sopra indicato. Le cellule sono utilizzati fino a raggiungere passaggio 20.
  3. Testare le cellule regolarmente (ogni 4 - 6 settimane) per le contaminazioni, come contaminazioni micoplasma.
  4. Coltura di cellule A549 o HCC827 su vetrini
    1. Mettere 1 sterile vetrino di vetro in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti utilizzando una pinzetta.
    2. Seme 50.000 cellule tumorali di entrambe le linee di cellule in un volume di 500 microlitri nei pozzetti coni coprioggetti di vetro, rispettivamente.
    3. Culture cellule fino a raggiungere una confluenza del 70% in condizioni di coltura standard (37 ° C; 5% CO 2). Durante questo tempo, aspirare il terreno vecchio con una pipetta Pasteur e aggiungere 500 microlitri mezzo fresco ogni 2 - 3 giorni di coltura.

2. generazione di sistemi di tumore prova su un biologica Collagene Ponteggio

  1. Statici condizioni di coltura
    1. Generare il decellularized piccolo intestino-sottomucosa + mucosa (SISmuc) e fissarlo tra due anelli di metallo, le cosiddette corone di cellule, come descritto in una precedente pubblicazione 25.
    2. Seed 100.000 cellule sia HCC827 o cellule A549 in un volume totale di 500 microlitri sul lato degli ex lume dell'intestino fisso in corone cellulari.
    3. Consentono alle cellule tumorali di aderire per 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2. Aggiungere 1 ml di mezzo all'interno della corona cellulare e 1 ml di fuori.
    4. Culture del tumoremodello in condizioni statiche a 37 ° C, 5% CO 2 in incubatrice per 14 giorni. Cambiare terreno di coltura ogni 2 - 3 giorni. Pertanto, aspirare il terreno con una pipetta Pasteur e pipettare 1 ml fresco RPMI con la quantità appropriata di FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) all'interno della corona cellulare e 1,5 ml dello stesso terreno esterno.
  2. Condizioni di coltura dinamici
    1. Impostare il sistema di test tumore con la matrice decellularized all'interno delle corone cellulari e semina delle cellule, come descritto ai sensi del comma 2.1.1 a 2.1.3.
    2. Culture del modello di tumore in condizioni statiche 37 ° C, 5% CO 2 in incubatrice per 3 giorni.
    3. Montare il bioreattore autoclavato e inserire la testa di serie SISmuc come pubblicato in precedenza 25.
    4. Pipettare 45 ml RPMI con la giusta quantità di FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) nel pallone e collegare il dispositivo di campionamento senza ago per il sistema di tubazione tra il bioreattore e ilboccetta di media.
    5. Posizionare il bioreattore nell'incubatrice, collegarlo alla pompa e cultura modello di tumore per altri 14 giorni, con un costante flusso medio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Cambiare l'intero terreno di coltura dopo 7 giorni. Per questo, spostare il bioreattore dal termostato sotto una cappa a flusso laminare. Aspirare il medium nel pallone multimediale utilizzando una pipetta Pasteur. Sollevare il bioreattore mentre aspirazione per sbarazzarsi del mezzo nel sistema di tubi. Pipettare 45 ml di mezzo fresco nel pallone. Posizionare il bioreattore posteriore nell'incubatrice e collegarlo alla pompa.

3. Il trattamento del tumore Modello statico con Gefitinib

  1. Cultura del modello di tumore come descritto nella sezione 2.1.
  2. Al giorno 11 di cultura, preparare RPMI / FCS con 1 mM gefitinib (2,5 ml per ogni corona cella). Aspirare il vecchio supporto dai pozzi usando una pipetta Pasteur e aggiungere 1 ml di preparato RPMI / FCS / gefitinib all'interno tegli corona cellulare e 1,5 ml dello stesso terreno esterno.
    NOTA: La soluzione gefitinib magazzino scongelato può essere conservato a 4 ° C per una settimana.
  3. Cambiare il medium al giorno 13, come descritto ai sensi del comma 3.2.

4. La stimolazione del modello di tumore statica con TGF-beta-1 per EMT induzione

  1. Cultura del modello di tumore come descritto nella sezione 2.1.
  2. Al giorno 3 della cultura, preparare RPMI / FCS con 2 ng / ml TGF-beta-1 con supporto (2,5 ml per ogni corona cella). Aspirare il vecchio mezzo dai pozzetti usando una pipetta Pasteur e aggiungere 1 ml di preparati RPMI / FCS / TGF-beta-1 all'interno della corona cellulare e 1,5 ml dello stesso terreno esterno. Cambiamento medio integrato con TGF-beta-1 ogni 2 - 3 giorni fino al giorno 14, come descritto in 4.2.

5. Leggere-out

  1. Il prelievo di campioni per Elisa Misure
    1. Prendere campioni dai surnatanti di statico (sezione 2.1) e dinamica (sezione 2.2) cultura durantetrattamento con gefitinib (punto 3) a giorni 11-14 della cultura come indicato in figura 2. Inoltre, prendere un campione prima del trattamento (T0).
    2. In condizioni di coltura statiche, prendere 100 campioni microlitri dall'interno della corona cella. In condizioni di coltura dinamici, avvitare la siringa sul dispositivo di campionamento e prendere 1 ml di mezzo dal sistema di bioreattore. Conservare tutti surnatanti raccolti a -80 ° C fino a quando viene eseguita l'ELISA.
  2. M30-ELISA per apoptosi quantificazione
    1. Per quantificare l'apoptosi nei supernatanti eseguire il saggio morte cellulare secondo le istruzioni del produttore. Portare tutti i reagenti di raggiungere RT prima di eseguire il test.
    2. Vortex tutti i reagenti. Sciogliere la compressa di lavaggio in 500 ml di acqua fresca deionizzata. Diluire HRP Coniugato con 9,2 ml di coniugato tampone di diluizione e mescolare. Pipettare 25 ml di standard o campione per pozzetto.
    3. Aggiungere 75 ml di diluito HRP conjusoluzione cancello per pozzetto. Coprire la piastra e incubare su un agitatore per 4 ore a temperatura ambiente. Lavare la piastra manualmente, 5 volte con 250 ml di soluzione di lavaggio preparata.
    4. Aggiungere 200 ml di 3,3 ', substrato 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) in ogni pozzetto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungere 50 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto. Agitare la micropiastra per 10 secondi e lasciare la micropiastra per 5 minuti prima di leggere l'assorbanza. Determinare l'assorbanza a 450 nm in un lettore di micropiastre. Calcolare la curva standard e le concentrazioni nei campioni utilizzando un programma adatto per la gestione di dati di tipo ELISA quali l'origine.
  3. La colorazione del campione
    1. Fissaggio, paraffina-embedding e la sezione Preparazione del modello 3D
      1. Fissare il SISmuc testa di serie con 2,5 ml 4% paraformaldeide (PFA) per corona cella per 2 ore e integrarlo in paraffina
      2. Preparare 3 micron sezioni di tessuto per la colorazione come pubblicato in precedenza25.
    2. Fissaggio di cellule in coltura 2D Condizioni
      1. Quando viene raggiunto il 70% di confluenza, lavare le cellule coltivate su vetrini a 24-pozzetti una volta con PBS e fissarli con 500 microlitri 4% PFA / pozzetto per 10 min.
      2. Rimuovere PFA e memorizzare i vetrini nel pozzo-piastra coperta con PBS a 4 ° C fino al momento colorazione.
    3. Colorazione H & E
      1. Macchiare le sezioni reidratati con ematossilina / eosina come colorazione panoramica secondo protocolli standard.
    4. Immunofluorescenza colorazione del modello 3D
      1. Per immunofluorescenza, eseguire un recupero dell'antigene ponendo i vetrini deparaffinate e reidratati in una pentola a vapore con tampone citrato preriscaldata (pH 6,0) per 20 min.
        NOTA: Vedere tabella di materiali e attrezzature per la preparazione di di tampone citrato.
      2. Trasferire i vetriniil tampone di lavaggio (0,5 M tampone PBS + 0,5% Tween), sezioni di cerchio con una penna PAP per minimizzare il volume richiesto per soluzioni coloranti e posizionare i vetrini in una camera umida.
      3. Bloccare le sezioni di tessuto con il 5% di siero dalle specie ospite degli anticorpi secondari utilizzati alla lettera 5.3.4.6 per 20 minuti a temperatura ambiente.
      4. Rimuovere il blocco siero picchiettando delicatamente le diapositive per un fazzoletto di carta e applicare l'anticorpo primario alle sezioni circondati in una diluizione in base alle istruzioni del produttore (coniglio anti Ki67 1: 100, coniglio anti vimentina 1: 100, topo anti pan-citocheratina 1 : 100). Incubare O / N a 4 ° C. Per doppia colorazione, anticorpi primari provenienti da diverse specie ospiti devono essere utilizzati.
      5. Lavare accuratamente fuori anticorpo non legato con tampone di lavaggio tre volte per 5 min.
      6. Per il rilevamento di specifici attacchi antigene-anticorpo, applicare anticorpi secondari in diluizione 1: 400 di sezioni e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
      7. Lavare UNBanticorpo ound con tampone di lavaggio tre volte per 5 min.
      8. Montare le diapositive con un mezzo acquoso contenente DAPI di colorazione di contrasto nuclei e lasciarli asciugare O / N.
    5. Immunofluorescenza colorazione di cellule in coltura 2D
      1. Rimuovere PBS e coprire le teste di serie scivola copertura in vetro con 0,2% Triton-X100 in PBS per 5 minuti per permeabilizzazione. Lavare i vetrini coprioggetto di vetro con tampone di lavaggio (0,5 M tampone PBS + 0,5% Tween) per 5 min.
      2. Eseguire le operazioni da 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Eseguire tutti i passaggi della piastra a pozzetti su una piattaforma oscillante e rimuovere i reagenti capovolgendo la piastra.
      3. Per il montaggio, individuare una goccia di mezzo acquoso contenente DAPI di colorazione di contrasto nuclei su un vetrino non rivestito e trasferire la polizza di copertura ad esso con le cellule di fronte al mezzo di montaggio con pinze. Lasciare asciugare prima di imaging.
  4. Determinazione dell'indice di proliferazione
    1. eseguire immunofluorescenzamacchiare contro Ki67 secondo la sezione 5.3.4. o 5,3 5.
    2. Prendere immagini fluorescenti delle sezioni di tessuto o cellule in coltura 2D con un microscopio invertito. Utilizzare filtri diversi per scattare immagini di colorazioni DAPI e di colorazioni Ki67. Per la quantificazione, utilizzare 10 immagini di sezioni 3D o 5 immagini di 2D culture (20X di ingrandimento) di ogni condizione da parte non sovrapposti del campione.
    3. Determinare il numero di nuclei e il numero di nuclei positivi per Ki67 in 2D
      1. Conte Ki67 nuclei positivi manualmente utilizzando il contatore delle cellule plug-in del software Fiji 26. Pertanto, aprire l'immagine e fare clic su "Plugins" → "Analizza" → "Cell Counter". Premere il tasto "inizializzare" e selezionare un tipo di contatore. Clicca su ogni nucleo positivo Ki67. Il numero di clic viene visualizzato accanto al tipo di contatore selezionato.
      2. Per il conteggio delle cellule automatico del numero totale di nuclei creare una macro utilizzando Fiji 27,28. AdjUst la macro per ogni linea di colorazione e di cellule. In seguito, un esempio come creare una macro.
        1. Inizia registratore di macro. Aprire un DAPI-immagine e convertirla in formato a 8 bit cliccando su "Immagine" → "Tipo" → "8-bit". Fai clic su "Migliorare il contrasto", impostare 'saturi' come "1" e "normalizzare".
        2. Impostare "maschera di contrasto" per renderla più nitida. Utilizzare un 'raggio' di "1" e 'maschera' di "0.60". Fai clic su "soglia auto", scegliere il metodo di "RenyiEntropy" con "oggetti bianchi su sfondo nero 'per binarise l'immagine.
        3. Fai clic su "Plugins" → "BioVoxxel" → "caratteristiche irregolari spartiacque" con un raggio di erosione del "5" per separare le cellule. Fare clic su "Analizza" → "Analisi Particelle" e impostare la 'dimensione' a "0,02-Infinito".
          NOTA: il numero di particelle / cellule èindicato nella tabella di riepilogo come conteggi.
        4. Fai clic su "Crea" per salvare macro per l'analisi di altre immagini.
    4. Determinare il numero di nuclei e il numero di nuclei positivi per Ki67 in 3D manualmente come descritto nel paragrafo 5.4.3.1.
    5. Calcolare l'indice medio di proliferazione (PI) secondo la seguente formula:
      figure-protocol-1
      n = numero di immagini (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico tumore modello di generazione e simulazione di Anti-EGFR terapia nelle celle HCC827

  1. Generation Network utilizzando un software per l'analisi di rete
    1. Utilizzare diversi database noti per generare la rete del tumore in base ai più importanti parametri sperimentali di read-out e lo sfondo mutazionale della linea cellulare HCC827.
    2. Aprire il software di analisi di rete 21 per visualizzare laRete.
      1. Clicca → "Nuovo" → tipo "modelli JoVE_tumor '" File "→ fare clic su" OK "per generare una nuova rete. Fai clic su "Piazza Primo piano del Nord" → "OK" per visualizzare il ricevitore in una doppia membrana. Fai clic su "Proteine ​​generico" per visualizzare i nodi (= proteine) come rettangoli → tipo 'EGFR' → fare clic su "OK"; ripetere questo per ogni nodo della rete.
      2. Etichettare i nodi della rete: Fare clic destro → "Colore & Forma cambiamento ..." → selezionare per i nodi EGFR e (EGF-EGFR) codice di colore "255,0,0" (colore rosso); Per i nodi c-MET e il codice colore (c-MET) "0,255,0" (colore verde); per il codice colore gefitinib "255,255,0" (colore giallo); per il codice colore PI3K-INH "204.204.204" (colore grigio chiaro); per il codice colore MEK-INH "102.102.102" (colore grigio scuro); per tutti gli altri nodi del codice seleziona il colore della rete4; 255,255,255 "(colore bianco).
      3. Fai clic su "fenotipo" per visualizzare i parametri di read-out come esagoni → tipo 'proliferazione' → fare clic su "OK" → Fare clic destro → "Cambia colore e forma ..." → selezionare il codice colore "255.204.204" (colore salmone); ripetere questo per il parametro apoptosi → selezionare il colore del codice "255,51,204" (colore viola).
      4. Visualizza Bordi (= interazioni): Fai clic su "Stato di transizione" per le attivazioni (frecce), fare clic su "inibizione" per inibizioni (frecce spuntate); ripetere questo per ogni interazione in rete.
    3. Fai clic su "File" → "Salva con nome ..." → tipo 'JoVE_tumor models.xml' → fare clic su "Salva" per salvare la rete di segnalazione generato come .xml formato.
  2. In Silico simulazione con SQUAD
    NOTA: SQUAD rappresenta °topologia di rete e un sistema discreto logica booleana (AND, OR, NOT) ed esegue un'analisi stato stazionario. L'analisi di stato stazionario riflette l'equilibrio del sistema e la responsabilità su di stimoli di segnalazione (ad es., L'applicazione di droga o mutazione).
    1. Aprire SQUAD 17 software, fare clic il file 'JoVE_tumor models.xml' "carico di rete" → upload. Fai clic su "Esegui analisi":
      NOTA: Avanti, SQUADRA applica funzione esponenziale di interpolare la connettività di rete booleana, che permette la simulazione dinamica del comportamento della rete nel corso del tempo (colorate curve di attività sigma).
    2. Fai clic su "Avanzate" → "perturbatori" per scrivere un protocollo di simulazione. Simulare anti-EGFR resistenza: Fai clic su "Modifica Protocol"
      1. Fai clic su "perturbazione" → utilizzare standard "InitialState = SS-4" (stato stazionario 4) → Fare clic su "Aggiungi" per aggiungere 'nuovo impulso costante' → Senare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "FLIP" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "0,4" → Fare clic su "OK".
      2. Ripetere questo: Fare clic su "Aggiungi" → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "c-MET" → Selezionare il tempo di "0" → Selezionare il valore "0,4" → Fare clic su "OK"; Fai clic su "Aggiungi" → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "gefitinib" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "1" → Fare clic su "OK".
      3. Impostare un valore di stato di nodo attivo (EGF-EGFR): Fare clic su "activenode" → Fare clic su "Modifica" → stato Selezionare "0.8" → Fare clic su "OK"; per tutti gli altri nodi: Fai clic su "Modifica" → Selezionare stato "0" → Fare clic su "OK". Fai clic su "OK" per salvare il protocollo.
      4. Visualizzare le curve specifici: Vai pannello "Opzioni" → Selezionare "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspasi", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptosi", "proliferazione", "MEK-INH" e "PI3K-INH" per la rappresentazione grafica. Fai clic su "Inizializza" → "Run" per avviare una simulazione completa di risposta del sistema. Fare clic su "Reset" per iniziare una nuova simulazione.
    3. Simulare combinato PI3K inibitore MEK e il trattamento: Fai clic su "Modifica Protocol"
      1. Utilizzare stesso parametro nodo come descritto al punto 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Fai clic su "perturbazione" → Fare clic su "Aggiungi" per aggiungere 'nuovo impulso costante' → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "PI3K-INH" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "1" → Fare clic su "OK"; Fai clic su "Aggiungi"per aggiungere 'nuovo impulso costante' → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "MEK-INH" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "1" → Fare clic su "OK".
      2. Fai clic su "OK" per salvare il protocollo. Vai al pannello "Opzioni": Utilizzare stessi nodi per la rappresentazione grafica come descritto al punto 6.2.2.4. Fai clic su "Inizializza" → "Run" per avviare una simulazione completa di risposta del sistema. Fai clic su "Reset" per terminare la simulazione.

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Risultati

Sulla base del ponteggio SISmuc (Figura 2A a C), abbiamo stabilito un protocollo operativo standardizzato per la generazione, la stimolazione e il trattamento di un sistema di test tumorale 3D (Figura 2D). Questo modello permette la determinazione dell'indice di proliferazione e la quantificazione dell'apoptosi usando M30-ELISA come mostrato in Figura 1 e Figura 3, rispettivamente. Figura 3 mostr...

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Discussione

Abbiamo stabilito un combinato in vitro / in sistema di prova del tumore silico per le previsioni di trattamento biomarker-guidata. Il modello in vitro valuta diversi aspetti importanti azioni composti come cambiamenti di proliferazione delle cellule tumorali e apoptosi su una determinata sfondo mutazionale che possono anche essere simulati in silico 17. Qui, vi presentiamo il protocollo standardizzato per la generazione di modello di tumore 3D e test composti compresa la q...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sponsorizzata dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF, concessione BD247) dell'Ospedale dell'Università di Wuerzburg e il programma Bayern Fit (concesso a Heike Walles).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cattedra di Bioreattoridi Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa, Wü rzburg (GER)Configurazione del bioreattore
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Corone cellulariCattedra di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, Wü rzburg (GER)per la coltura 3D statica
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Questo software è stato utilizzato per disegnare la rete.
Soluzione madre tampone di citrato (10x)produzione interna42 g/L di acido citrico monoidrato, 17,6 g/L di pellet di idrossido di sodio in acqua deionizzata, pH 6,0, conservati a RT. 
Soluzione di lavoro tampone citratoin produzioneSoluzione madre tampone citrato al 10% in acqua demineralizzata, conservata presso RT.
Acido citrico monoidratoVWR, Darmstadt (GER)1002441000utilizzato per il tampone citrato
Vetrini coprituttoVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (USA)SBA-0100-20
Banche dati come KEGG, HPRD e QIAGEN (Genes & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Per generare la topologia di rete sono stati utilizzati diversi database di letteratura conosciuta.
Femmina Luer Lug Style Tee Mednet, Mü nster (GER)FTLT-1Configurazione del bioreattore
Femmina Luer Thread Style con 5/16" Hex a 1/4-28 UNF ThreadMednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A Configurazione del bioreattore
Siero Fetale di Vitello Bio& SELL, Feucht (GER)FCS. ADD.0500Gefitinib non inattivato a caldo
Absource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 mg100 mM soluzione madre con
pallone di vetro DMSO (Schott, GER) fornito con raccordo per tubo flessibile in vetroWeckert, Kitzingen (GER)su misura
Histofix 4% (Paraformaldehyd)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Raccordo per tubo flessibileMednet, Mü nster (GER)CC-9
Incubatore per bioreattoriCattedra di Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa, Wü rzburg (GER)Configurazione del bioreattore
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Maschio Luer Integral Lock RingMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1AConfigurazione del bioreattore
Camera di umiditàsu misura
Topo anti Pan-CitocheratinaSigma-Aldrich, Monaco di Baviera (GER)   C2562-2MLClone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, usato 1/100 per immunofluorescenza
Valvola tamponabile senza ago Femmina LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCConfigurazione del bioreattore, per il campionamento, sterilizzato a raggi gamma
O-Ring MVQ 10 rosso 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444O-ring grande, Configurazione del bioreattore
O-Ring MVQ 70 rosso 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170O-ring piccolo, Configurazione del bioreattore
PAP penDako, Amburgo (GER)S002
ParaffinaCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Pompa peristalticaIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)del bioreattore
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma-Aldrich, Monaco di Baviera (GER)   D8537-6x500ml
Cassetta per tubi pompaIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Configurazione del bioreattore
Rabbit anti Ki67Abcam, Cambridge (UK)ab16667Clone SP6, utilizzato per 1/100 per IF
Rabbit anti VimentinAbcam, Cambridge (UK)ab92547utilizzato 1/100 per IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
Tubo in siliconeCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Configurazione del bioreattore
Idrossido di sodioSigma-Aldrich, Mü nchen (GER)30620-1KG-Rutilizzato per il tampone citrato
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Questosoftware è stato utilizzato per eseguire le simulazioni semiquantitative.
Filtro dell'aria sterile, pori 0,2 e micro; mSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYKInstallazione del bioreattore
Siringa Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649per il campionamento del bioreattore
Piastre per test di coltura tissutale: 6-,          12, 24, 96 pozzettiTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
Il fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF-β 1) concarrier Cell Signaling, Francoforte (GER)8915LCsoluzione madre in tampone sterile citrato pH 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mlper il lavaggio del tampone di colorazione immunofluorescente
propria Configurazione

Riferimenti

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

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