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Articolo metodologico

Sviluppo di un

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DOI:

10.3791/53907

⸱

6 aprile 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Medella Health

In questo articolo

Sommario

I modelli attuali in vitro per valutare le lenti a contatto (CLS) e altre applicazioni oculari legate sono molto limitate. La piattaforma oculare presentato simula il flusso fisiologico lacrimale, volume lacrimale, l'esposizione all'aria e l'usura meccanica. Questo sistema è molto versatile e può essere applicato a varie analisi in vitro con CL.

Abstract

Attualmente, le valutazioni in vitro delle lenti a contatto (CL) per la somministrazione di farmaci vengono generalmente eseguite in fiale di grande volume,1-6 che non riescono a imitare i volumi lacrimali fisiologici. 7 Il modello tradizionale manca anche della componente naturale del flusso lacrimale e del riflesso dell'ammiccamento, entrambi fattori che definiscono l'ambiente oculare. Lo sviluppo di un nuovo modello è descritto in questo studio, che consiste in un design unico in 2 pezzi, bulbo oculare e palpebra, in grado di imitare il volume lacrimale fisiologico. I modelli sono creati da stampi stampati in 3D (stampi in politetrafluoroetilene o teflon), che possono essere utilizzati per generare modelli oculari da vari polimeri, come il polidimetilsilossano (PDMS) e l'agar. Ulteriori modifiche agli oculari, come l'integrazione di una cornea umana o animale espiantata o di un costrutto corneale umano, consentiranno studi oculari in vitro più complessi. Una pompa a siringa microfluidica commerciale è integrata con la piattaforma per emulare la secrezione lacrimale fisiologica. L'esposizione all'aria e l'usura meccanica si ottengono utilizzando due attuatori meccanici, di cui uno muove lateralmente l'oculare e l'altro muove l'oculare circolarmente. Il modello è stato utilizzato per valutare le CL per la somministrazione di farmaci e la deposizione di componenti lacrimali sulle CL.

Introduzione

Due significative aree di interesse all'interno dell'arena di lenti a contatto (CL) comprendono il disagio e lo sviluppo di applicazioni innovative CL. Chiarire i meccanismi alla base CL disagio è un problema che ha eluso il campo per decenni. 8 Lo sviluppo del romanzo, CL funzionali, come i dispositivi di consegna di droga 1,3,9 e biosensori, 10-12 è un'area di crescente interesse, con i mercati potenziali sostanziali. In entrambi i casi, un sofisticato modello in vitro potrebbe fornire informazioni utili per aiutare con la selezione appropriata materiali per lenti o caratteristiche di progettazione durante la fase di sviluppo. Purtroppo, corrente in modelli in vitro per la valutazione CL e altre applicazioni relative oculari sono relativamente grezzo e sofisticato. Tradizionalmente, studi in vitro CL valutare la deposizione di film lacrimale o la consegna di droga sono eseguite in, grandi fiale di volume statiche contenenti un volume di fluido fisso, che Greasupera tly quantità fisiologiche. Inoltre, questo semplice modello manca il componente flusso lacrimale naturale e il riflesso lampeggiante, entrambi i quali sono definendo fattori dell'ambiente oculare.

Lo sviluppo di un fisiologicamente rilevanti "modello" sofisticato, occhio richiederà un approccio multi-disciplinare e richiedono sostanziale validazione vivo. Per queste ragioni, il quadro fondamentale per il nostro modello in vitro occhio è altamente versatile, tale che il modello può essere continuamente migliorata attraverso aggiornamenti e modulazioni futuri. Fino ad oggi, il modello è in grado di simulare volume lacrimale, lacrimazione, usura meccanica e l'esposizione all'aria. Lo scopo è quello di creare un modello in vitro che fornirà risultati significativi, che è predittiva e gratuito per in vivo ed ex vivo osservazioni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità e il rispetto di tutti gli orientamenti pertinenti delineate dalla University of Waterloo del comitato etico ricerca sugli animali. Gli occhi bovini sono generosamente donati da un mattatoio locale.

1. Modello Eye

  1. Progettazione e produzione di stampi 13
    1. Progettare modelli occhio secondo le dimensioni medie fisiologiche di occhi umani adulti. 13
    2. Lasciare uno spazio di 250 micron tra il bulbo oculare ed i pezzi palpebra del modello dell'occhio. Progettare i rispettivi stampi usando software per computer-aided design (CAD).
    3. Creare un nuovo file o di un file .cad .sldprt con AutoCAD o SolidWorks. Creazione di modelli 3D del globo oculare / palpebra umana. Creare stampi dei modelli e salvare gli stampi come file .stl.
    4. Importare file .stl in software per la stampante 3D (ad esempio, per makeware replicator2). Specificare i parametri di stampa (posizione, essenzialità, la scala, l'orientamento, la scorrevolezza, ecc ) 13.
    5. Salvare il file come file di G-code per stampanti 3D a leggere. Selezionare i materiali come il PLA (acido polilattico), ABS (acrilonitrile butadiene stirene), PC (policarbonato), o una loro combinazione, per stampare gli stampi 13.
    6. Installare filamento desiderato del materiale di scelta. Importare il file G-code nella stampante 3D da leggere. Stampa lo stampo.
      NOTA: In alternativa, produrre stampi oculari utilizzando un computer controllato numerico (CNC) della macchina, se una superficie più liscia sul modello dell'occhio è desiderato. Per la produzione di stampi CNC, materiali per stampi non si limitano più alla plastica termici, ma si estendono a metallo, ceramica e polimeri resistivi, come politetrafluoroetilene.
    7. Aprire l'interfaccia software CNC che è collegato ad un trapano taglio. Costruire stampi 3D in base alla parte anteriore, superiore, laterale e viste prospettiche degli stampi modello bulbo oculare / palpebra precedentemente costruite in interfaccia software di controllo. Selezionare i parametri appropriati per lalavorazione (formato bit, materiale del substrato, spessore del materiale) e procedere al taglio dello stampo.
  2. Sintesi di Oculari Uso PDMS
    1. Utilizzando una siringa, misurare 10 ml volume di PDMS (polidimetilsilossano) base e riempire in una provetta da centrifuga 15-50 ml. Aggiungere 10% w / v della soluzione di elastomero in peso totale di PDMS. Con una bacchetta, mescolare bene le soluzioni.
    2. Versare la soluzione PDMS nel bulbo oculare e la palpebra stampi. Lasciare le PDMS a stabilirsi a RT O / N (o per almeno 12 ore) per avviare la polimerizzazione e per consentire bolle per sciogliere fuori del polimero.
      NOTA: assicuratevi che non vi siano bolle rimaste nel PDMS che potrebbe salire o espandere.
    3. Successivamente, mettere gli stampi in forno a 75 ° C (167 ° F) per 1 ora o 150 ° C (302 ° F) per 5 min. Per un gel morbido, lasciare che i PDMS siedono a temperatura ambiente per almeno 48 ore per polimerizzare completamente.
    4. Mettere i campioni in un congelatore per alcuni minuti; questo si ridurrà le PDMS e semplificarela rimozione dei campioni dagli stampi. Estrarre i oculari dagli stampi usando una spatola sottile.
    5. Per la consegna della soluzione nello spazio tra il bulbo oculare e pezzi palpebra, collegare un tubo di politetrafluoroetilene 1/16 "x 1/8" con un connettore tubo accoppiatore uguale gamba 1/16 "e fissarlo al pezzo palpebra al foro tubazione .
  3. Sintesi del bulbo oculare brano nel formato Agarosio
    NOTA: Il pezzo bulbo oculare può essere sintetizzato utilizzando altri polimeri quali agarosio. La seguente procedura può anche essere modificato per produrre oculari da una varietà di tipi di agar, come PDA (patata destrosio agar) o SDA (Sabouraud Dextrose agar).
    1. Per produrre un gel 2% (2 g / 100 ml), misura 2 g di agarosio e mescolare con 100 ml di acqua ultrapura. Portare la soluzione ad ebollizione (100 ° C) in modo che l'agarosio si scioglie completamente. Lasciate che la soluzione raffreddare per 5 min.
    2. Versare la soluzione nello stampo bulbo oculare e lasciare che la soluzione si raffreddi per 30 minuti a temperatura ambiente. Togliere i pezzi bulbo oculare con una spatola. Conservare l'agar bulbo oculare in un -20 ° C freezer per un uso successivo. Per gli studi di microbiologia, sterilizzare gli stampi bulbo oculare in autoclave e / o UV-irradiazione.
  4. Incorporazione di bovino Cornea su PDMS Eyeball
    NOTA:. Questo protocollo è stato adattato da Parekh et al 14
    1. Eseguire la dissezione e incorporazione delle cornee bovini in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare. Acquisire gli occhi e sezionare lo stesso giorno.
    2. Ruotare la cappa a flusso su per 10 minuti prima dell'uso e sanificare con il 70% di alcol etanolo. Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti sono sterili in autoclave a 273 ° F / 133 ° C per 45 minuti, e posizionati non meno di 4 pollici dall'ingresso cappa a flusso.
    3. Immergere l'occhio bovina in un becher contenente una soluzione di iodio-povidone diluito per 2 min. Lavare l'occhio in un bicchiere contenente tampone fosfato (PBS) pH 7.4. Uso di pinze posto delicatamente l'occhio su una capsula di Petri di vetro, corneale a faccia in su.
    4. Rimuovere il muscolo e tessuto adiposo in eccesso tagliando in corrispondenza dei punti di fissaggio sclerali con le forbici fine scollamento. Smaltire il tessuto in eccesso in un bicchiere sterile designato per rifiuti di origine animale.
    5. Utilizzando micro-forbici, rimuovere la congiuntiva dall'occhio. Avvolgere l'occhio con garza sterile, mantenendo una distanza di almeno 1 cm dal limbo.
    6. Usando un bisturi, incidere la sclera circa 2 mm dalla regione limbus e superficialmente in modo da evitare la penetrazione della coroide sottostante e corpo vitreo. estendere con attenzione l'incisione di 360 ° con un bisturi o forbici dissezione senza deformare la cornea dalla sua curvatura naturale.
    7. Con pinza sottile, rimuovere la cornea dall'occhio. Utilizzando pinze, rimuovere con attenzione qualsiasi tessuto uveale aderente e risciacquare cornea con PBS.
    8. Conservare la cornea a 31ºC in un contenitore sterile con la culturamedio (come ad esempio Medium 199) contenente 3% siero fetale bovino per mantenere l'umidità dei tessuti e nutrimento delle cellule.
    9. Prima della sperimentazione, riposare la cornea asportata sul bulbo oculare PDMS, e fissare i due pezzi insieme con una clip-on specializzato.

2. Blink-piattaforma

  1. Progettazione e produzione della Blink-platform
    NOTA: Il lampeggio piattaforma si compone di tre parti funzionali: modello dell'occhio (descritto nella sezione 1), sistema di ingranaggi e sistema elettronico.
    1. Progettazione e produzione della piattaforma di batter l'utilizzo di CAD e stampa 3D, simile a quella descritta per il modello oculare (punto 1.1). Progettare il sistema di ingranaggi in modo tale che traduce semplice rotazione dei motori nei movimenti laterali e rotativi delle oculari. 15
    2. Utilizzando il pignone e ingranaggio, tradurre moto di rotazione di un motore passo-passo nel movimento laterale di un pignone, che è collegato ai pezzi palpebra.
    3. Usando ilsistema di ingranaggi coniugato, amplificare un moto di rotazione da un motore passo-passo in tre (o più) dei moti rotatori per tre diversi pezzi bulbo oculare.
    4. Allineare i due sistemi di ingranaggi, uno per la palpebra e uno per bulbo oculare, in modo che la distanza tra i due sono costanti. Assemblare il sistema elettronico con un microcontrollore, scudo motore, e due motori.
      NOTA: utilizzare due motori passo-passo per fornire i motori di rotazione, che si traduce dal sistema di ingranaggi in un movimento lampeggiante.
    5. Collegare i due motori passo-passo con un sistema costituito da un scudo motore impilati sul microcontrollore. Collegare e configurare i componenti elettronici a lavorare con i prodotti software open source.
    6. Programmare il sistema per controllare i parametri del motore quali giri al minuto (RPM), numero di round in avanti, il numero di giri a rovescio, e lo stile di svolta.
      NOTA: fare riferimento al "file di codice Arduino" supplementare per i dettagli.
    7. Scaricare il software di sistema dal masito nufacturers '.
    8. Installare il software e aprirlo. Scrivere il codice per il controllo di motori passo passo nella configurazione desiderata. Collegare il sistema con una sorgente per alimentare il sistema elettronico in modo che i motori si muovono nella maniera desiderata come definito dal ricercatore.
      NOTA: fare riferimento al "file di codice Arduino" supplementare.
  2. Montaggio con microfluidica (Artificial strappo Solution)
    1. Prendere il bulbo oculare sintetizzato e pezzi delle palpebre e li scivolare sui loro corrispondenti clip-on per il modello dell'occhio. Collegare il tubo che si unisce con una siringa e posizionato sulla pompa microfluidica con il pezzo palpebra (sezione 1.2.5). Prova di funzionamento la piattaforma e verificare per il movimento costante.
    2. Primo il tubo e verificare la presenza di un flusso costante di soluzione di lacrime artificiali (ATS). La ricetta per ATS è stato riportato in precedenza. 16
    3. spostare manualmente le parti eye-modello insieme in piano, in modo che il bulbo oculare e l'occhiocoperchio sono in contatto. Impostare la portata della pompa microfluidi ai valori desiderati. Impostare portate fisiologici a 1-1,5 ml / min. 17
    4. Avviare la pompa e gli attuatori per iniziare esperimento. Per gli esperimenti di consegna della droga, posizionare la lente a contatto farmaci contenenti sul pezzo bulbo oculare.
    5. Lasciare che il fluido flusso continuo a goccia a goccia in 12-pozzetti. Ad intervalli di tempo stabiliti desiderati, quantificare la concentrazione dell'analita o di droga utilizzando metodi di rilevamento comuni come la spettroscopia UV-Vis o fluorescenza. 1,4,18
    6. Per gli studi che valutano la deposizione di componenti lacrimali su lenti a contatto, posizionare la lente a contatto sul pezzo "bulbo oculare". Raccogliere il fluido a flusso continuo, che può essere scartata.
    7. Dopo gli intervalli di tempo desiderati, rimuovere la lente a contatto dal pezzo bulbo oculare e preparare la lente per ulteriore analisi come la microscopia confocale.

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Risultati

Gli stampi occhio sintetizzati ottenute dalla officina e dalla stampa 3-D sono riportati nella Figura 1. Questi stampi possono essere utilizzati con una varietà di polimeri, come PDMS e agarosio, per produrre oculari con le proprietà desiderate. L'assemblaggio cenno della piattaforma modello occhio con una pompa a siringa microfluidica è mostrato in Figura 2. La piattaforma simula usura meccanica tramite la rotazione del pezzo bulbo oculare, e l'...

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Discussione

Ci sono tre fasi critiche all'interno del protocollo che richiedono particolare attenzione: la progettazione e produzione di stampi (punto 1.1), il montaggio piattaforma (sezione 2.2.1-2.2.3), e monitorare il percorso sperimentale (sezione 2.2.4-2.2.7 ). In termini di progettazione e produzione di stampi (sezione 1.1), il pezzo bulbo oculare dovrebbe essere progettato in funzione delle dimensioni di una cornea umana. Tuttavia, può richiedere più prototipi dello stampo prima che un pezzo bulbo oculare può essere crea...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere la nostra fonte di finanziamento NSERC 20/20 di rete per lo sviluppo della avanzati oftalmici materiali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assemblato)Motore
passo-passoMotore Adafruit324e schermo motore
Accoppiatore a gamba uguale 1,6 mm 1/16 "VWRCA11009-28050 pezzi di connettore per tubi
Tubo PT / SIL 1/16 "x1/8"VWR16211-316Custodia da 50 piedi
PDMSDow CorningSylgard 184 Agarosio per incapsulamento
, tipo 1-A, basso EEOSigma-AldrichA0169-25G
PHD UltraTMHarvard Apparatus703006MicroFluidic
Pump Cornea bovinaCargill, Guelph/ON
SoldidworksDassault SystèmesSoftware
Stampa 3DUniversità di Waterloo - Centro di stampa 3D
Strumenti di dissezioneStrumenti di scienzefini Strumenti di dissezione generale
Terreno 199Sigma-AldrichConservazione del terreno per cornea
Siero fetale bovinoThermo FisherAggiungi al terreno di coltura, 3% del volume totale
Adafruit 50 Board di celle solari Terreno di coltura

Riferimenti

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