Articolo metodologico

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 marzo 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo smontaggio dei nuclei del virus dell'influenza A durante l'ingresso del virus nelle cellule ospiti è un processo a più fasi. Descriviamo un metodo in vitro per analizzare le prime fasi dell'uncoating virale. In questo approccio, la centrifugazione in gradiente di velocità viene utilizzata per sezionare biochimicamente le fasi che avviano l'uncoating in condizioni definite.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I processi molecolari innescati dall'acido controllano da vicino l'ingresso cellulare di molti virus che entrano attraverso il sistema endocitico. Nel caso del virus dell'influenza A (IAV), la fusione del virus con la membrana endosomiale e il successivo disassemblaggio del capside virale, chiamato uncoating, è governato dalle condizioni ioniche all'interno delle vescicole endocitiche. Le prime fasi del ciclo di vita del virus sono difficili da studiare perché non è possibile accedere direttamente agli endosomi in via sperimentale, creando la necessità di un approccio in vitro. Qui, descriviamo un metodo basato sulla centrifugazione in gradiente di velocità di virioni purificati attraverso un gradiente di glicerolo a due strati, che consente l'analisi del nucleo IAV e della sua stabilità. Il gradiente contiene un detergente non ionico (NP-40) nel suo strato inferiore per rimuovere la membrana virale mediante solubilizzazione mentre il virus sedimenta verso il fondo. A pH neutro, i nuclei virali vengono pellettati come strutture stabili. I principali componenti principali, la proteina della matrice (M1) e le ribonucleoproteine virali (vRNP), possono essere chiaramente identificati nella frazione del pellet mediante SDS-PAGE. Diminuendo il pH a 6,0 o inferiore nello strato inferiore, si rimuove selettivamente M1 dal pellet, seguito dal rilascio di vRNP in condizioni più acide. Le bande proteiche virali su gel colorati con Coomassie possono essere sottoposte a quantificazione densitometrica per monitorare gli stati intermedi di disassemblaggio dell'IAV. Oltre al pH, è possibile valutare altri fattori che influenzano la stabilità del nucleo virale, come la concentrazione di sale e i fattori di scopertura virale putativi, semplicemente modificando di conseguenza lo strato di glicerolo contenente detergente. Nel complesso, la tecnica presentata consente un'analisi altamente riproducibile e quantitativa dell'uncoating virale in vitro. Può essere applicato ad altri virus avvolti che subiscono complessi processi di srivestimento.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali 1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite 2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti 3-8. L'acido ambiente (pH <5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV pi....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di Tamponi e soluzioni madre

  1. Preparare tampone MNT (20 mm MES, 30 mM Tris e 100 mm NaCl) sciogliendo 470 mg Tris cloridrato, 390 mg MES idratare e 580 mg di NaCl in 80 ml ​​di DDH 2 O. Regolare il buffer a pH 7,4 e portarlo ad un volume finale di 100 ml con DDH 2 O.
  2. Preparare tre soluzioni identiche di 500 tampone mM MES sciogliendo 9,76 g MES idrato in 80 ml ​​di dH 2 O ciascuno. Regolare i buffer a pH 5.8, 5.4 e 5.0, rispettivamente per titolazione con NaOH concentrato. Portare ogni buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O.
  3. Preparare due soluzioni identiche di 500 tamp....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come già discusso, adescamento in endosomi è necessario per rendere il nucleo IAV uncoating competente. Protonazione del nucleo indebolisce interazione di M1 e vRNPs (composto di RNA virale, NP, e la polimerasi PB1 complesso / PB2 / PA). è iniziato questo processo quando il virus in arrivo è esposto ad un pH di 6,5 (o inferiore) in endosomi precoci (SEO) e continua fino a quando i fusibili virus in giro pH 5.0 a Les.

Per simul.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

capsids virali sono metastabili complessi macromolecolari. Durante il montaggio del virioni richiede l'incapsidamento e condensazione del genoma del virus, l'inizio del prossimo ciclo di infezione dipende lo smontaggio di tale struttura capside compatta. I virus sono evoluti per sfruttare vari meccanismi cellulari per controllare il ciclo di verniciatura-uncoating, inclusi recettori cellulari, accompagnatori, enzimi proteolitici, forze fisiche fornite da proteine ​​motrici o helicases nonché pH e interruttori io.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Yohei Yamauchi e Roberta Mancini per averci fornito i reagenti. Il laboratorio AH è stato sostenuto dalle reti di formazione iniziale Marie Curie (ITN), il Consiglio europeo della ricerca (CER), e dal Fondo Nazionale Svizzero (Sinergia).

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
compresse per inibitori della proteasi senza EDTASigma-Aldrich11873580001La soluzione madre può essere conservata a 2-8 gradi C per 1 o 2 settimane
Acido acetico glacialeMerck Millipore100063
Glicerolo anidro BioChemicaAppliChemA1123
Acido cloridricoMerck Millipore100317
Ago per iniezione lunga (21  G, 9 cm, smussato o smussato)
MES idratoSigma-AldrichM8250
MetanoloMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Ora disponibile in commercio come IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% mini gel Bis-Tris, 10  pozzetti, 1,0 mmLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS tampone per campioni (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS tampone di funzionamento (20x)Life TechnologiesNP0001
Strisce indicatrici di pH, pH 4,0-7,0Merck Millipore109542
QC Colorazione colloidale per coomassieBIO RAD1610803
Sodio cloruroMerck Millipore106406
idrossido di sodioMerck Millipore106498
unità filtrante SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, set di rotori per ultracentrifugaBeckman Coulter331336
Thinwall, provette per centrifuga ultratrasparenti, 13.2  ml, 14 mm x 89 mmColtro di Beckman344059
Tris cloridrato AppliChemA1087
X31 Virus dell'influenza A (H3N2), uovo cresciuto, liquido allantoideo chiarificatoVirapurAppena scongelato il 4 ° E

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Centrifugazione a gradiente di velocitdisassemblaggio del capside viralegradiente di glicerolosolubilizzazione con NP 40scapsidamento pH dipendenteanalisi SDS PAGEstabilit del core viraleproteina di matrice M1ribonucleoproteine virali

Articoli correlati