Articolo metodologico

Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

DOI:

10.3791/53917

⸱

19 aprile 2016

 , 
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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I neuroni sensoriali specifici per organo sono difficili da identificare. Il tracciamento Fast Blue viene utilizzato per identificare i neuroni nodosi che innervano le vie aeree per lo smistamento cellulare. I neuroni nodose ordinati vengono utilizzati per estrarre acido ribonucleico (RNA) di alta qualità per il sequenziamento. Utilizzando questo protocollo, viene determinata l'espressione genica dei neuroni specifici delle vie aeree.

Abstract

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nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi neuroni afferenti si trovano all'interno dei gangli sensoriali. gangli sensoriale innervano un organo specifico o porzione del corpo. Per esempio, i gangli della radice dorsale (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere processi in tutto il corpo e degli arti. I gangli del trigemino si trovano nel cranio e innervano la faccia, e le vie respiratorie superiori. afferenze vagali dei gangli nodose si estendono per tutto l'intestino, cuore e polmoni. I neuroni nodose controllano una gamma diversificata di funzioni quali: frequenza respiratoria, irritazione delle vie respiratorie, tosse e riflessi. Così, per capire e manipolare la loro funzione, è fondamentale per identificare e isolare vie aeree specifiche sotto-popolazioni neuronali. Nel topo, le vie aeree sono esposti a un colorante tracciante fluorescente, Fast Blue, per il tracciamento retrograda di specifiche vie aeree nodose neuroneS. I gangli nodose sono dissociate e la fluorescenza delle cellule attivate (FAC) l'ordinamento viene utilizzato per raccogliere le cellule positive colorante. Successivamente, l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) viene estratto dalle cellule positive dye per la prossima generazione di sequenziamento. Utilizzando questo metodo vie aeree specifica espressione genica neuronale è determinata.

Introduzione

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nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi nervi afferenti si trovano nei gangli sensoriali, come la radice dorsale, trigemino, o gangli nodoso. Ogni ganglion sensoriale innerva regioni specifiche del corpo e contiene cellule che innervano organi e tessuti separati all'interno di tale regione. Per esempio, i gangli delle radici dorsali (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere i processi in tutto il corpo e gli arti, mentre i gangli del trigemino si trova nel cranio, che contiene neuroni che innervano il viso, gli occhi, le meningi e vie aeree superiori 1, 2. Il gangli nodose del nervo vago è situata nel collo sotto il cranio e contiene corpi cellulari che si estendono fibre nervose in tutto il tratto gastrointestinale, cuore e basse vie aeree e dei polmoni 3. Nell'uomo il ganglio nodoso sta da solo, tuttavia, nel topo è fusacon il ganglio giugulare, che innerva anche i polmoni 4. Questo ganglio fuso viene spesso chiamata la giugulare / nodoso complesso, ganglio vagale, o semplicemente nodoso ganglio 5. Qui, viene indicato come il ganglio nodoso.

fibre afferenti del nodosi passano informazioni dai visceri al nucleo del tratto solitario (NTS) nel tronco cerebrale. Input sensoriale a questo ganglio unico controlla una gamma diversificata di funzioni, come la motilità intestinale 6, frequenza cardiaca 7, la respirazione 8,9, e le risposte respiratorie irritanti attivato 10,11. Con questa diversità di funzioni e organi innervati, è fondamentale per indirizzare e isolare sottopopolazioni organo-specifiche del ganglio nodoso al fine di studiare percorsi neuronali individuali. Tuttavia, date le dimensioni del nodose e il numero limitato di neuroni che contiene questo non è un compito banale. Ogni topo nodose ganglio contiene circa 5.000 neuroni 12oltre a una vasta popolazione di cellule di supporto satellite. Dei 5.000 neuroni nodose, solo 3-5% innervano le vie respiratorie. Pertanto, eventuali modifiche funzionali, morfologiche o molecolari all'interno dei neuroni delle vie aeree-innervano, grazie alla stimolazione delle vie respiratorie o patologie, andranno perduti nel ganglio nodoso densamente.

Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un metodo per identificare e isolare i neuroni che innervano le vie respiratorie. Le vie aeree sono stati esposti a un colorante tracciante fluorescente per identificare le successive neuroni innervano nodoso. Fast Blue è stato preso dai neuroni e viaggia rapidamente alle loro corpi cellulari dove viene conservata per un massimo di otto settimane 13 - 15. Una volta identificato, un dolce, ma efficace, il protocollo di dissociazione è stato utilizzato per preservare l'etichettatura tintura e la vitalità delle cellule per cellulare attivato fluorescente (FAC) di smistamento. Cellule separate vengono utilizzati per estrarre l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) per determinare l'espressione genica o Fo altra analisi molecolare valle. Questo protocollo fornisce una tecnica utile e robusto per isolare i neuroni sensoriali che innervano un tessuto di interesse.

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Protocollo

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Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Duke University.

1. intranasale Amministrazione di Fast Blue

Per Fast Blue, amministrare il colorante almeno 2 giorni prima eutanasia il mouse. Il colorante persisterà fino a otto settimane.

  1. Anestetizzare il mouse con l'anestesia per inalazione di luce (2,5% sevoflurano) fino a quando inizia a rallentare la respirazione.
  2. Utilizzare una pipetta 200 ml con punte filtrati per infondere lentamente 40 ml di soluzione colorante (0.4 mm Fast Blue, 1% dimetilsolfossido, saline DMSO, in tampone fosfato, PBS) nella narice, fermandosi di tanto in tanto per garantire il mouse è aspirando la soluzione (Figura 1A).
  3. Tenere il mouse verticalmente, testa alta, e massaggiare delicatamente il petto per garantire il colorante si diffonde in tutto i polmoni.

2. Preparati sulla dissezione e analisi Giorno

  1. Preparare 10 ml0; gangli dissociazione Solution (GADS) mediante la combinazione di ingredienti come specificato nella tabella 1.
  2. Eseguire l'estrazione di RNA in una zona laboratorio dedicato. Prima di iniziare l'esperimento, superfici pulite con etanolo al 70%, 10% di candeggina, e RNasi reagente decontaminazione. Questo include la centrifuga RNA, eventuali portaprovette e pipette. Assicurarsi che ci sono scatole di punta filtro dedicato per solo uso di RNA. Non utilizzare questa apparecchiatura e l'area per la preparazione del DNA, in modo da contaminare i campioni.
  3. Mescolare fresco 70%, e l'80% di etanolo con acqua RNase-free. Preparare 1 ml per campione da utilizzare per l'estrazione di RNA.
Ingrediente Quantità
Avanzate DMEM / F12 9,5 ml
glutammina 100 pl
HEPES (10 mM) 100 pl
supplemento N2 100 pl
B27 (senza vitamina A) 200 ml
NGF (50 ug / ml) 10 microlitri

Tabella 1. Miscela reagente per gangli dissociazione Solution (GADS).

3. Procedura Dissection

  1. Riempire provette da 1,5 ml con 500 microlitri GADS, uno per ciascun campione sperimentale, uno per un controllo di smistamento positivo, ed uno per un controllo di smistamento negativo. conservare le provette su ghiaccio durante la dissezione.
  2. Sezionare il ganglio nodoso e fare due tagli parziali per facilitare la dissociazione, poi metterlo nel tubo campione sperimentale. Si prega di fare riferimento al seguente protocollo di Giove per la dissezione dei gangli nodose 16 e 17 DRG.
  3. Sezionare e parzialmente tagliato gangli-etichettato, come il gangli spinali (DRG), per i controlli di ordinamento. Utilizzare due gangli per il controllo positivo e due gangliuna per il controllo negativo.
  4. Per ottenere neuroni nodose sufficienti per l'ordinamento di successo, unire gangli da 5 topi in un tubo campione sperimentale contenenti GADS.

4. sensoriale gangli Dissociazione

  1. Pipetta fuori 500 GADS microlitri, lasciando gangli nel tubo. Lavare gangli volta aggiungendo 1 ml di PBS, attendere gangli di depositarsi sul fondo del tubo, poi pipetta su PBS.
  2. Aggiungere 1 ml GADS e 22 pl di digestione enzimatica (collagenasi I / II e mix proteasi, 2,5 mg / ml in H 2 O) ad ogni provetta.
  3. Aggiungere 20 ml Fast Blue (5,26 mm) per la provetta di controllo positivo.
  4. Mettere le provette a bagnomaria o riscaldamento blocco già a 37 ° C.
    Nota: Il tempo di digestione gangli dipende dall'età della digestione enzimatica. Entro 1 mese di dissolvere l'enzima digestione, digerire per 30 minuti, entro 2 - 6 mesi digerire per 45 min. Se l'enzima è più di 6 mesi di età, digerire gangli fo 60 min.
  5. Ogni 15 min tubi Agitare brevemente e flick loro per garantire gangli sono coperti dalla soluzione.
  6. Mentre gangli vengono digeriti, preparare gradienti di densità utilizzando una soluzione di particelle (particelle di silice colloidale rivestite con polivinilpirrolidone).
    1. Mescolare soluzione particella% 12 in GADS, 500 microlitri per campione.
    2. Mescolare soluzione particella% 28 in GADS, 500 microlitri per campione.
    3. Lentamente e con attenzione aggiungere 400 microlitri soluzione di densità 12% sulla sommità della soluzione densità 400 microlitri 28% in una provetta da 1,5 ml fresco per ciascun campione. Non permettere che i due strati per mescolare. Due strati distinti devono essere visibili nel tubo; uno più scura dell'altra.
  7. Mentre gangli vengono digeriti, etichettare nuovi tubi da 1,5 ml di raccolta per l'ordinamento (un tubo Fast Blue positivo e uno negativo Fast Blue per campione di ordinamento). A seconda dei requisiti di smistamento impianto, questi tubi devono avere coperchi amovibili in modo da non interferireE Con ​​il cell sorter.
  8. Dopo il tempo di digestione appropriata, rimuovere GADS con l'enzima digestione e lavare gangli due volte con 1 ml di PBS. Aggiungere 200 ml di GADS freschi ad ogni provetta.
  9. Utilizzare una pipetta 200 microlitri, impostato a 100 volumi microlitri, e pipetta gangli su e giù parecchie volte per rompere le cellule a parte. Ripetere l'operazione fino a quando si vede nessun pezzo di tessuto intatto. Evitare di creare bolle nella soluzione.
  10. Passare cellule dissociate attraverso un colino cella di 70 micron.
  11. Aggiungere altri 100 microlitri GADS al tubo di dissociazione originale per raccogliere tutte le cellule rimanenti randagi a sinistra e passare la soluzione aggiuntiva attraverso il filtro delle cellule. Utilizzando un nuovo puntale, raccogliere qualsiasi liquido cellule contenenti residuo che è passata attraverso il filtro e aggrappato alla maglia. Il volume finale di cellule sospese in GADS è di 300 microlitri.
  12. strato attentamente le 300 microlitri di cellule sulla parte superiore del gradiente di densità fatta in precedenza. Evitare di bolle e la miscelazione di cells con gli strati densità.
  13. Centrifugare per 10 minuti a 2.900 xg a temperatura ambiente.
  14. Mentre le cellule sono nella centrifuga, miscela tampone di lisi (1 ml per campione sperimentale) come segue: 10 microlitri 2-mercaptoetanolo in 1 ml Buffer RLT (dal kit di estrazione di RNA).
    1. Aggiungere 300 ml di tampone di lisi tubo di raccolta positivo Blu Veloce e 600 ml di tubo Fast Blue negativo di raccolta (tubi etichettati dal punto 4.7). Questo volume dipende dal numero di celle previste da raccogliere. Per <2.000 cellule, aggiungere 300 ml, per> 7.000 cellule aggiungono 600 ml. Ciò garantirà la selezione fluido di trasporto non diluire in modo significativo il tampone di lisi.
  15. Una volta che la centrifugazione, rimuovere con cautela ed eliminare lo strato superiore ml 700. Questo livello contiene la maggior parte dei detriti cellulari che altrimenti interferire con l'ordinamento delle cellule.
  16. Aggiungere 700 microlitri GADS freschi alla cella rimanente contenente soluzione e pipettaTE su e giù più volte per mescolare.
  17. Centrifugare per 15 minuti a 2.900 xg per far sedimentare le cellule.
  18. Mentre le cellule sono nella centrifuga, mescolare classificare GADS (500 microlitri per campione) aggiungendo 5 microlitri DNasi (10 mg / ml) per 1 ml GADS.
  19. Una volta che la centrifugazione è fatto, rimuovere con attenzione e scartare il surnatante, lasciando il pellet.
  20. Risospendere pellet cellulare in 200 - 300 ml di smistamento GADS pipettando su e giù con una pipetta 1000 ml impostata su 200 ml più volte. Mettere i campioni in ghiaccio. Le cellule sono ora pronti per essere ordinati.

5. fluorescenza cellulare attivato (FAC) Ordinamento

Nota: questa sezione richiede la conoscenza operativa di un sorter FACS o l'assistenza di personale specializzato.

  1. Aggiungere 1 ml soluzione madre ioduro di propidio (PI) (50 mg / ml) per ogni campione per verificare la vitalità cellulare. Split controllo negativo in 2 tubi, uno con e uno senza PI. PI lega il DNA solo nelle cellule morte. Sedopo le prime specie non ci sono le cellule morte per etichetta, non è necessario l'uso di PI.
  2. Cellule di trasporto di citometria a flusso strumento, ad es., BD FACS AriaII che esegue il software Diva 8, sul ghiaccio.
  3. Poiché la dimensione della cella è variabile in questa popolazione, utilizzare un ugello grande (100 micron) per l'ordinamento. Per ridurre la quantità di stress dell'esperienza cellule e aumentare la vitalità cellulare utilizzare bassa pressione (20 psi).
  4. Utilizzare il software selezionatrice FACS per impostare le trame analisi, scatter in avanti, lato scatter (SSC), Fast Blue, e PI, se necessario.
  5. Per ri-sospendere le cellule, Agitare delicatamente brevemente il campione prima di caricarla nel sorter.
  6. Iniziare con il controllo negativo, non Fast Blue o PI, per impostare la soglia di gate (Figura 2A). Questo determina la quantità di autofluorescenza nella popolazione di cellule. Opzionale: Eseguire l'esempio negativo con PI per identificare se c'è una popolazione di cellule morte.
  7. Ordina il campione di controllo positivo (incubated con Fast Blu), per impostare i parametri di compensazione.
  8. Una volta che i cancelli ed i parametri sono impostati, iniziare l'ordinamento dei campioni sperimentali. I campioni vengono ordinati nei tubi di raccolta preparati contenenti tampone di lisi RNA.
  9. I campioni ordinati in ghiaccio fino a quando l'ordinamento delle cellule è completa.
  10. Iniziare fase di estrazione di RNA subito dopo che le cellule sono ordinati.

6. RNA Estrazione

  1. Vortex cellule ordinati in tampone di lisi per 1 minuto per omogeneizzare.
  2. Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% e mescolare pipettando su e giù diverse volte.
  3. Trasferire fino a 700 ml di campione in una colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through.
    1. Ripetere finché il volume totale del campione attraverso la colonna di spin.
  4. Aggiungere 350 microlitri Buffer RW1 e continuare il processo di purificazione dell'RNA, comprendente la fase di trattamento DNasi, secondo protoco del produttorel per le cellule.
  5. Una volta RNA è stato estratto, per verificare la qualità RNA utilizzando un sistema di elettroforesi microfluidica secondo le specifiche del costruttore.

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Risultati

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Utilizzando questo metodo, i neuroni delle vie respiratorie-innervano sono etichettati per via intranasale instillando Fast Blue (Figura 1A). Dopo due giorni, veloci cellule blu marcate appaiono nei gangli nodoso (Figura 1C). Queste cellule formano 3 - 5% della popolazione totale neuronale dei gangli nodose. Altri coloranti retrogrado che sono stati usati per questo scopo comprendono DII (1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanin...

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Discussione

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Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare i neuroni delle vie aeree, che innervano nei gangli nodoso del nervo vago. Una volta etichettato, i gangli vengono delicatamente dissociate per conservare in modo ottimale il numero di cellule e la vitalità. Questi neuroni sono poi FAC allineati direttamente nel tampone di lisi e RNA viene estratto. Il significato di questo protocollo è la possibilità di individuare, isolare e preservare la qualità di una specifica popolazione di cellule sensoriali. L'espressione ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Supportato da NIH concedere R01HL105635 a SEJ. Gli autori desiderano ringraziare Diego V. Bohórquez consulenza tecnica. Ringraziamo anche R. Ian Cumming per l'assistenza tecnica e l'esecuzione della citometria a flusso al Duke Vaccine umana Research Institute citometria a flusso Shared Resource Facility (Durham, NC). La citometria a flusso è stato eseguito nel Laboratorio biocontenimento regionale presso la Duke, che ha ricevuto il supporto parziale per la costruzione dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (UC6-AI058607).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Veloce BluPoliscienze, Inc.17740-2stock 2 mg/ml in acqua
NeuroTrace 530/615 rosso Nissle coloranteLife TechnologiesN21482
Dimetil solfossido (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) Ca e Mg freeGibco14190-144
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
glutammina ( Glutamax)Gibco35050-061
HEPESGibco15630-080
N2Gibco17502-048
B27 (senza vitamina A)Gibco12587-010
Nerve Growth Factor (NGF)SigmaN6009stock 50 &; g/ml in PBS/10% FBS
enzima di digestione, Liberase DH Research GradeRoche5401054001stock 2,5 mg/ml in soluzione di particelle d'acqua
(Percoll)SigmaP1644-25ML
Blocco riscaldanteLabNet
70 &; filtro cellulare mFalcon352350
Etanolo assoluto (200 proof)Fisher ScientificBP2818-500
Acqua priva di RNasiFisher ScientificBP2484-100
Reagente di decontaminazione con RNasi, RNase AWAYinvitrogen10328-011
2-mercaptoetanoloVWREM-6010
Kit di estrazione dell'RNA, RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Kit DNasi, senza RNasi DNase SetQiagen79254
DNasiSigmaD5025-15KUstock 10 mg/ml in 0,15 M NaCl
Propidio IoduroSigmaP4170-10MGstock 10 &; g/ml in PBS
Sistema di elettroforesi microfluidica (TapeStation 2200)Agilent

Riferimenti

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