Articolo metodologico

Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2

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DOI:

10.3791/53919

⸱

10 marzo 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

La generazione di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti in vitro consente l'accesso a grandi quantità di tessuto cardiaco in vitro per la scienza di base e le applicazioni cliniche. Questo protocollo utilizza il fattore atrializzante Grem2 sia per aumentare il numero di cardiomiociti ottenuti sia per generare cardiomiociti con un fenotipo atriale.

Abstract

Protocolli per la generazione di popolazioni di cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti sono state sviluppate, ma questi in genere produrre cellule di fenotipi misti. I ricercatori interessati a perseguire studi condotti su specifici sottotipi miociti richiedono un approccio più diretto differenziazione. Trattando staminali embrionali (ES) cellule di topo con Grem2, un antagonista BMP secreta che è necessario per la formazione camera atriale in vivo, un gran numero di cellule cardiache con un fenotipo atriale può essere generato. L'utilizzo della linea di cellule staminali pluripotenti Myh6-DsRed-Nuc ingegnerizzato permette l'identificazione, la selezione e la purificazione dei cardiomiociti. In questo protocollo corpi embrionali sono generati dalle cellule Myh6-DsRed-Nuc utilizzando il metodo goccia e mantenute in sospensione fino differenziazione giorno 4 (D4). A cellule d4 sono trattati con Grem2 e placcato su piastre rivestite di gelatina. Tra D8-D10 grandi aree contraenti si osservano nelle culture e continuano ad espandersi e mtura attraverso d14. Molecolare, analisi istologiche e electrophysiogical indicano le cellule in cellule Grem2-trattati acquisiscono caratteristiche atriale-like che forniscono un modello in vitro per studiare la biologia dei cardiomiociti atriali e la loro risposta a vari agenti farmacologici.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti sono un potente strumento per la generazione e lo studio delle cellule da una miriade di difficoltà ai tessuti di accesso per ricerche e studi pre-clinici di base, in particolare negli esseri umani 1-5. Una corretta modulazione delle vie di segnalazione di sviluppo in grado di dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti al destino fenotipica desiderata. Molti protocolli sono stati sviluppati per generare cardiomiociti (CMS) a partire da cellule staminali pluripotenti 6-14. Questi protocolli comportano generalmente la modulazione di TFGβ superfamiglia (Activin, BMP e TGFβ) e percorsi attraverso temporizzata aggiunta di fattori di crescita esogeni e / o piccole molecole Wnt 10,12-15. Questi protocolli sono generalmente efficace ad aumentare la percentuale di cellule che diventano CMs, ma mancano di specificità, generando una popolazione mista di cellule che rappresentano linee atriale, ventricolare e sistema nodale / conduzione. Al fine di studiare cardiaco specifico sottotipi A appro differenziazione più direttoè necessario ach.

Gremlin2 (Grem2, chiamato anche proteine ​​correlate a Dan e Cerberus o PRDC in breve) è un antagonista BMP secreto che è necessario per una corretta differenziazione cardiaca e la formazione da camera atriale durante lo sviluppo cardiaco in zebrafish 16. Trattare differenziazione delle cellule staminali embrionali con Grem2 alla differenziazione giorno 4, subito dopo picco di espressione di marcatori mesodermici T-brachyury e Cerberus come 1, aumenta la resa della CM e genera un pool di cellule prevalentemente del lignaggio atriale 14.

Ricombinante Grem2 viene usato per trattare le cellule differenziazione e può essere realizzato con proteine ​​standard di tecniche di produzione 17 o possono essere acquistati commercialmente. È altamente solubile in soluzioni acquose e possono essere aggiunte esogenamente per culture al punto di tempo desiderato.

La differenziazione può essere rintracciato tramite RT-qPCR per quantificare l'espressione di marcatori di rappresentantedei progenitori cardiovascolari, i progenitori cardiaci, e impegnato CMS. Immunofluorescenza può anche essere usato per identificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei tipi di cellule cardiache.

Le applicazioni che richiedono popolazioni pure vengono più facilmente effettuate quando si utilizza un sistema reporter per identificare e isolare CM. A questo scopo, abbiamo introdotto il αMHC-DsRedNuc costrutto nella linea di cellule del mouse CGR8 ES 14. Cellule CGR8 crescono e restano pluripotenti senza cellule di alimentazione, facilitando saggi di espansione e differenziazione 18. La linea di cellule ES contiene una proteina fluorescente DsRed sequenza codificante con un segnale di localizzazione nucleare sotto l'alfa cardiaca-specifico miosina catena pesante (alfa Mhc o Myh6) promotore del gene. Utilizzando queste cellule, CMS può essere facilmente identificato e isolato per la quantificazione, l'ordinamento delle cellule, elettrofisiologia, schermi di droga, e lo studio dei meccanismi di differenziazione atriale.

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Protocollo

1. Preparazione di cellule di coltura, soluzioni e reagenti.

  1. Preparare 500 ml di mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) mezzi di miscelazione e filtrazione sterile (0,2 micron dimensione dei pori) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml di calore inattivato siero fetale bovino (FBS), 5 ml 100X concentrato L- sostituzione di glutammina, 5 ml ricombinante del mouse leucemia inibitorio Factor (LIF) a 1 x 10 7 unità per ml e 1,43 microlitri ß-mercaptoetanolo (concentrazione finale è di 50 micron). Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Preparare 500 ml di embrioidi corpo (EB) mezzi di differenziazione per miscelazione e sterile filtraggio 391 ml di Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM), 100 ml inattivati ​​al calore FBS, 5 ml 100X concentrato sostituzione L-Glutammina, 5 ml 100X concentrato aminoacidi non essenziali (NEAA), e 2,86 ml ß-Mercaptoethanol (concentrazione finale è 100 micron). Conservare a 4˚ C fino al momento dell'uso.
  3. Preparare 0,2% w/ v di gelatina mescolando 1 g suina gelatina in polvere pelle con 500 ml di filtrato, H 2 O distillata O. Sterilizzare in autoclave. Si noti che la gelatina non sia completamente solubile in acqua a temperatura ambiente. Dopo autoclave la gelatina deve essere completamente sciolto. Conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
  4. Preparare Grem2 aliquote proteina ricombinante sciogliendo 50 mg di pellet di liofilizzato Grem2 in 100 ml tampone fosfato (PBS) integrato con 0,1% BSA per fare un / ml di soluzione 0,5 mg. Aliquota 20 ml di questa soluzione in cinque sterili provette da 1,5 ml centrifuga e conservare a -80˚ C fino al momento dell'uso.
  5. Preparare PBS secondo i protocolli pubblicati o acquisto come uno stock 10X e diluire 1:10 con filtrato, H 2 O distillata per fare un 1X di diluizione 19 di lavoro. Sterilizzare PBS in autoclave prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. In alcuni passaggi, DPBS senza Ca 2+ e Mg 2+ utilizzato. Questo è purchased come una soluzione 1X. Informazioni per l'ordine è incluso nella tabella dei reagenti.

2. Preparazione di gelatina rivestito 10 cm Tissue Culture Piatti

  1. In una cappa coltura tissutale sterilizzato aggiungere 5 ml di soluzione di gelatina 0,2% per ogni 10 centimetri piatto di coltura tissutale per il rivestimento. Le stoviglie in incubatore a 37 ° C per almeno 30 minuti o fino a 4 giorni.

3. Preparazione di gelatina rivestito da 6 pozzetti tessuto piastre di coltura

  1. In una cappa coltura tissutale sterilizzato aggiungere 1 ml di 0,2% di gelatina a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura tissutale. piastre posto in incubatore a 37 ° C per almeno 30 minuti o fino a 4 giorni.

4. embrionali cultura cellule staminali

  1. mESCs scongelamento
    1. Preparare supporti Mesc riscaldando a RT in una cappa di coltura di tessuti sterilizzati. Aggiungere 10 ml di mezzi RT ad un 10 centimetri piatto di gelatina rivestite.
    2. Rimuovere 1 fiala di mESCs contenente circa 1 x 10 6 cellule provenienti dacrioconservazione. Tenendo esageratamente con le molle, posto in un bagno d'acqua a 37 ° C. Agitare delicatamente fino sospensione cellulare è stato scongelato e solo un piccolo cristallo di ghiaccio rimane nel centro della fiala. Asciugare flaconcino con una usa e getta privo di lanugine pulire e sterilizzare con il 70% EtOH.
    3. In una cappa coltura di tessuti sterili rimuovere le cellule scongelate usando una punta P1000 da esageratamente e trasferimento a 10 centimetri piatto preparato in 4.1.1).
    4. Mettere 10 centimetri piatto in 37 ˚C coltura cellulare umidificata incubatore con 5% di CO 2 e di distribuire uniformemente le cellule muovendo delicatamente la parte anteriore piatto a quella posteriore, poi un lato all'altro. Consentono alle cellule di allegare al piatto O / N o almeno 6 ore.
    5. Per prima cosa i prossimi cellule di controllo mattina per il fissaggio usando un microscopio a campo chiaro. Alcuni detriti cellulari e cellule morte saranno osservati nei media. E 'normale. supporti Aspirare da piatti e sostituire con 10 ml supporti Mesc freschi.
    6. Continuare a cambiare i media sulle cellule ogni giorno per prevenire la differenziazione.
  2. mESCs passaging
    1. cellule Passage quando il 60-70% confluenti. Preparare cellule per passaging aspirando media e risciacquo con 5 ml di sterile 1X DPBS senza MgCl 2 e CaCl 2. Aggiungere 2 ml di soluzione di 0,05% tripsina-EDTA. Mettere in incubatrice a 37 ° C per 5 minuti.
    2. Mentre le cellule sono incubazione preparare nuovo piatto 10 centimetri aspirando soluzione di gelatina e l'aggiunta di 10 ml di RT Mesc media. Dopo 5 minuti controllare le cellule per il distacco. Se le cellule rimangono attaccate, continuare a incubare a 37 ° C per 2 minuti alla volta fino completamente staccato.
    3. Quench tripsina-EDTA con l'aggiunta di 3 ml di Mesc media. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min a pellet. supporti Aspirare dal pellet e risospendere in 10 ml di mezzi Mesc.
    4. A seconda del rapporto di divisione desiderato, aggiungere 0,5-1,0 ml di sospensione cellulare per ogni piatto preparato in fase 4.2.2). Mettere piatto in incubatrice e distribuire uniformemente le cellule spostando leggermente posteriore a quella anteriore, allora una parte all'altra. Tutticellule ow per attaccare O / N o per almeno 12 ore.
      NOTA: Un rapporto di divisione di 1:10-01:20 è comune per la maggior parte delle linee Mesc. Questo rapporto può variare a seconda della linea utilizzato, il numero di passaggio, e confluenza desiderato sul nuovo piatto. Per un frazionamento 1:10 trasferimento rapporto 1 ml di sospensione cellulare in 9 ml mezzi Mesc e piatto in un preparato fresco di gelatina rivestita 10 centimetri piatto.

5. Preparazione di corpi embrionali

NOTA: Tutte le fasi tranne centrifugazione sono eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti.

  1. Preparazione di cellule di sospensione in EB media
    1. Al 70% di confluenza (di solito 24-48 ore post-passaggio), utilizzare le cellule per la formazione EB. Preparare cellule per la formazione EB staccando e pellet in base alle sezioni 4.2.1) - 4.2.3).
      Nota: (es., Molto poco la morte delle cellule, nessuna contaminazione, la corretta morfologia) E 'meglio per le cellule di passaggio almeno un tempo di post-disgelo e verificare la salute e la crescita robusta (e.g., raddoppi di popolazione che si verificano ogni 24-48 ore) prima dell'uso per fare EBS.
    2. Risospendere pellet in 5 ml di EB media. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
    3. Diluire sospensione cellulare in volume richiesto di supporti EB per rendere una concentrazione finale di 25 cellule / microlitro (o 2,5 x 10 3 cellule / ml). Si noti che ogni coperchio di una capsula di Petri contiene circa 60 EBs e richiede circa 1,3 ml di sospensione cellulare. A questo punto, preparare un volume sufficiente di sospensione cellulare per generare il numero desiderato di EBS. Ad esempio, se sono necessari 240 EBs per l'esperimento, preparare 5,2 ml di 2,5 x 10 3 cellule / ml.
      NOTA: mESCs che non vengono utilizzati per la formazione EB possono essere utilizzati per esperimenti futuri riducendo la velocità, ri-sospensione in mezzi Mesc e placcatura come descritto nel paragrafo 4.2.
  2. Creazione di corpi embrionali
    1. Preparare sterili 10 cm Petri-piatti batteriche per appendere formazione delle gocce aggiungendo 2 ml di 1X PBS al fondo each.
    2. Trasferire la sospensione EB dal punto 5.1) ad un lavandino soluzione sterile.
    3. Togliere il coperchio dal preparato capsula di Petri e depositare con cura sessanta, 20 gocce microlitri di sospensione EB sulla superficie interna. Realizzare questo efficiente utilizzando una pipetta multicanale dotato di 6 punte. Ogni goccia 20 ml ora ha 500 cellule.
    4. sostituire delicatamente coperchio sulla metà inferiore del batterica Petri-piatto, facendo attenzione a non staccare appeso gocce. Posizionare i piatti nella cultura incubatore cellulare a 37˚ C. Dopo 2 giorni, le cellule sono pronte per lavare come descritto in 5.3).
  3. Wash-down di corpi embrionali
    Nota: Tutte le fasi di lavaggio-down vengono eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti.
    1. Dopo 2 giorni di EB sono pronti per il lavaggio giù e trasferire a 6 cm piastre di Petri batteriche. Pre-caldo 3 ml di EB mezzi per capsula di Petri a RT. Ogni capsula di Petri 6 cm batterica può contenere efficacemente 2 coperchi per un valore di appendere gocce.
      Nota: Assicurarsi di utilizzare un non-rivestito capsula di Petri fo questo passo (vedi tabella materiali). Non usare un piatto di coltura di tessuti o qualsiasi altra superficie che favorisce l'adesione delle cellule. EBs dovrebbero rimanere sospese nei media fino al momento di essere placcato come descritto nella sezione 6.
    2. Rimuovere 10 cm piastre di Petri da incubatore e riporre in cappa di coltura tissutale sterile. Rimuovere con cautela il coperchio con EBS e inclinare ad un angolo di 45 gradi.
    3. Usando una pipetta 5 ml sierologico contenente 3 ml di mezzi RT EB, lavare delicatamente EBs in una piscina in fondo del coperchio. Ispezionare con cura il coperchio per EBs che sono bloccati in superficie e ri-sciacquare, se necessario.
    4. Dopo aver lavato tutti i trasferimenti EBS a una piastra di Petri 6 centimetri.
    5. Ripetere i punti 5.3.2) -5.3.4) per tutte le EBS. Ogni sei centimetri di Petri deve contenere EBs da due coperchi 10 CM. Mettere tutti i piatti di nuovo in incubatore a 37 ° C per altri due giorni.
      NOTA: EBs che sono troppo vicini tra loro in sospensione possono stare insieme e formare grandi aggregati. Questo può avere un impatto negativo cardiaco efficienza differenziazioneoltre a ridurre in modo significativo il numero di disponibili EBS. Per prevenire l'aggregazione, EBS dovrebbe essere controllato ogni giorno e separati muovendo delicatamente avanti e indietro, poi un lato all'altro. L'uso di piatti batteriche nei passaggi differenziazione primi è necessaria per evitare allegato EB al piatto e permettere EBS di crescere in sospensione.

6. placcatura e trattamento di EBs Con Grem2

  1. Preparare terreno di trattamento Grem2 con l'aggiunta di un volume sufficiente di magazzino (0,5 mg / mL) Grem2 medio RT EB per una diluizione finale di 1-5 mg / ml.
    NOTA: La concentrazione efficace per il trattamento di EBs varia a seconda della linea cellulare e l'attività specifica del lotto corrente di Grem2. Si raccomanda che prima di utilizzare la dose viene titolata per trovare la massima efficacia. Per la linea CGR8 Mesc che abitualmente uso di 3-5 mg / ml di Grem2. concentrazioni efficaci di Grem2 per la generazione dei miociti atriale produrrà cellule in rapida contraenti tragiorni 7-8 che sono diffuse nel corso di ogni bene. Se amministrazione fenotipo non si osserva in colture trattate si raccomanda che la dose di Grem2 essere titolata nel range indicato.
  2. Preparare piastre di coltura tissutale 6 pozzetti aspirando soluzione di rivestimento di gelatina da ciascun pozzetto e aggiungendo 2 ml di mezzi di trattamento RT Grem2. Rimuovere EBs da incubatore e riporre in cappa di coltura tissutale sterile.
  3. Utilizzando un P1000 impostato a 100 l di trasferimento 30 EBs da 6 cm capsule di Petri a ciascun pozzetto. Luogo EBs in incubatrice e in modo uniforme disperdono delicatamente spostando piastra posteriore a quella anteriore, allora una parte all'altra.
    1. Dopo EB hanno attaccato al pozzi rivestiti di gelatina, sostituire il supporto Grem2 ogni due giorni fino al giorno 10. Dopo il giorno 10, interrompere il trattamento Grem2 e aggiungere media EB freschi ogni due giorni per mantenere le cellule sane.
      NOTA: Dopo aver fissato, EBS appiattirsi lungo la superficie della piastra rivestita.

7. La dissociazione delle cellule per RT-qPCR Analysis

  1. La dissociazione delle cellule con tripsina-EDTA
    1. Supporti Aspirare da ogni pozzetto e lavare due volte con 1 ml per pozzetto di DPBS sterile meno Ca 2+ e Mg 2+.
    2. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA sterile in ciascun pozzetto da cui verranno raccolti cellule.
    3. Mettere piatto in incubatrice a 37 ° C per 5 minuti.
    4. Dopo 5 minuti le cellule di controllo per la dissociazione. Se le cellule ancora rimangono attaccati al fondo del rubinetto ben delicatamente per allentare. Se intercettazioni non si allenta le cellule, mettere di nuovo in incubatrice e monitorare ogni 2 minuti fino a quando le cellule sono completamente staccati.
    5. Neutralizzare soluzione tripsina-EDTA con l'aggiunta di 0,5 ml di mezzi EB in ogni pozzetto.
    6. Trasferire intere 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 ml micro.
    7. Cellule pellet di filatura in una centrifuga da tavolo per 5 min a 300 x g.
    8. Aspirare i media da pellet e passare alla lisi immediatamente o conservare a pellet a -70 C fino al momento per lisi. Lungo-term stoccaggio di pellet non è raccomandato come questo può portare alla degradazione dell'RNA.
  2. Cellulare Lysis e analisi molecolare
    1. A questo punto le cellule sono pronte per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di estrazione colonna commerciale oppure usando il reagente di estrazione dell'RNA secondo i protocolli forniti dai produttori (vedi tabella dei materiali). Una volta isolato, invertire RNA trascritto e utilizzare cDNA per l'analisi RT-qPCR utilizzando tecniche standard di 20, 21.
      NOTA: Primer utilizzati da questo laboratorio per RT-qPCR sono elencati nella tabella 1. atriale identità è confermata utilizzando una combinazione di RT-qPCR a guardare l'espressione di geni atriale e ventricolare e elettrofisiologia per azione di registrazione durata del potenziale (vedi paragrafo 8). Una lista di geni è incluso in questo protocollo come esempio di marcatori atriali e ventricolari affidabili. Ulteriori informazioni riguardanti atriale e ventricolare espressione genica nel contesto della differenziazione delle cellule staminali pluripotenti è situato in riferimento 14.

8. Analisi elettrofisiologiche

  1. La dissociazione delle cellule con collagenasi
    1. supporti Aspirare da ogni pozzetto e lavare due volte con 1 ml per pozzetto di PBS sterile.
    2. Aggiungere 0,5 ml di 1 mg / ml soluzione di collagenasi in ogni pozzetto.
    3. Mettere piatto in incubatrice a 37 ° C per 10 min.
    4. Dopo 5 minuti le cellule di controllo per la dissociazione. Se le cellule ancora rimangono attaccati tra loro o il fondo del rubinetto ben delicatamente per allentare. Ulteriori dissociare le cellule delicatamente triturazione con un P1000.
      NOTA: per facilitare la patch di registrazioni morsetto cellule deve essere triturato fino ad ottenere una cella singola sospensione.
    5. Aggiungere 0,5 ml supporti EB in ogni pozzetto e mescolare pipettando.
    6. Trasferire intere 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 ml micro.
    7. Cellule pellet di filatura in una centrifuga da tavolo per 5 min a 300 x g.
    8. supporti Aspirare da pellet cellulari.
    9. le cellule in 500 risospenderemicrolitri di PBS con 10% FBS, avendo cura di triturare in una sospensione singola cella.
  2. Caratterizzazione elettrofisiologici.
    NOTA: Molti ottimi protocolli sono stati pubblicati in questa rivista sull'uso singola patch clamp cellule per misurare potenziali di membrana delle cellule. Per informazioni dettagliate su come eseguire la patch di singola cellula morsetto il lettore novizio si riferisce a questi protocolli 21-24. Di seguito sono riportate informazioni specifiche per questo protocollo che aiuterà l'elettrofisiologo esperto preparare e gestire Mesc deriva CMS per la caratterizzazione del sottotipo.
    1. Preparare soluzione di registrazione intracellulare composto dai seguenti: 10 mm tampone HEPES, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mm glutammato di potassio, 10 mM KCl, e 10 mm di NaCl. Regolare soluzione a pH 7,2 con NaOH.
    2. Preparare una soluzione composta di seguenti registrazione extracellulare (vasca): 2 mM HEPES, 10 mM di glucosio, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5.4 mM KCl, e 137mM NaCl. Regolare soluzione a pH 7,4 con NaOH.
    3. Preparare una pipetta di vetro che misura 2-5 resistenza MW quando riempito con soluzione di registrazione utilizzando il vetro borosilicato di serie con filamento.
    4. Trasferire 100 ml di cellule sospese in camera di registrazione contenenti soluzione di registrazione extracellulare con un P200.
      NOTA: Le cellule possono essere combinati in sospensione o, per facilitare la manipolazione e l'uso per il trattamento farmacologico e / o saggi di perfusione, possono essere seminate su un vetrino rivestito di gelatina, come indicato in 8.2.5).
    5. Preparare rivestito gelatina vetrini mettendo un diametro di 10 millimetri vetrino di vetro in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e copertura con soluzione di gelatina, come descritto nella sezione 3.1) di questo protocollo.
      1. Dopo almeno 30 minuti soluzione aspirare gelatina e aggiungere 100 ml di cellule sospese direttamente al coprioggetto e mettere tutta la piastra da 6 pozzetti in incubatrice per almeno 2 ore o fino a quando le cellule hanno attaccato. Dopo che le cellule hanno attaccato, rimuovi vetrino e mettere in registrazione da camera con soluzione di registrazione extracellulare.
        NOTA: Se si utilizza la linea di fluorescenza Mesc giornalista cardiaca αMHC-DsRed, CM può essere identificato con i loro nuclei rosso fluorescente. Se non si utilizza una linea giornalista cardiaco, le cellule spontaneamente contraenti possono essere osservate e isolati per le misurazioni. cellule staminali pluripotenti derivate CMS sono solitamente più piccoli e più arrotondata, manca la morfologia caratteristica rettangolare completamente formata adulti miociti cardiaci.
    6. Fai tutte le registrazioni a 37 ° C. Patch singole cellule utilizzando tutta la fascetta cellulare in modalità di corrente-clamp con una pipetta di vetro borosilicato di 2-5 resistenza MW. Utilizzare una leggera pressione negativa per raggiungere sigillo gigaohm prima di ottenere tutta l'accesso delle cellule. Applicare una rapida pressione negativa alla rottura della membrana e di ottenere tutta l'accesso cella prima di registrare potenziali di membrana.
    7. Evocare potenziali d'azione con 4 msec depolarizzanti iniezioni di corrente.
      NOTA:Per PSC-derivato CM la quantità di corrente necessaria per innescare riproducibile potenziali d'azione possono variare. Al fine di trovare corrente di soglia ottimale, cominciare ad un relativamente bassa ampiezza corrente e aumento innescando in modo graduale fino a potenziali d'azione riproducibili si ottengono.
      NOTA: Azione potenziali durate per miociti atriali Grem2-indotti sono di solito nel range di 20-40 ms e la mancanza di una fase di plateau (Figura 6B).

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Risultati

Prima di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti dovrebbero essere compatto e privo di differenziazione spontanea. Le cellule mostrati nella Figura 1A sono pronti per essere singolarizzati e utilizzato per appendere gocce come descritto in 5.1 della sezione del protocollo. Le cellule illustrati nella Figura 1B sono spontaneamente la differenziazione e non devono essere utilizzati per la preparazione di gocce sospese.

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Discussione

Questo protocollo produce ordinariamente culture con una elevata percentuale di CMS che sono caratteristici della stirpe atriale. Come con qualsiasi protocollo di differenziazione, la qualità delle mESCs prima di differenziazione dovrebbe essere data particolare attenzione. mESCs dovrebbero essere monitorati di routine per una corretta morfologia (Figura 1A). Qualsiasi differenziazione spontanea che si verifica prima della formazione di EB si limitano fortemente l'efficienza del cardiogenesis e deve...

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Dichiarazioni

Gli autori di questo manoscritto non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programmi in meccanismi cardiovascolari: Formazione in Investigation" (JB).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
GMEMLife Technologies11710
FBSLife Technologies10082
GlutamaxLife Technologies35050
LIFEMD MilliporeESG1107
ß-MercaptoetanoloSigmaM3148
IMDMSigmaI3390
Aminoacidi non essenzialiSigmaM7145
Piastre per colture tissutali da 10 cmSarstedt83.3902
Piastre di Petri batteriche da 10 cmVWR25384-342
Piastre di Petri batteriche da 6 cmVWR25384-092
Piastre per colture tissutali a 6 pozzettiSarstedt83.3920
Gremlin 2 proteina ricombinanteR& Amp; D Systems2069-PR-050
Unità filtranti steriliThermo Fisher09-741-02
Gelatina (da pelle suina)SigmaG1890
10X PBS, SterileSigmaP5493
BSA Sigma5470
0,05% Soluzione di tripsina-EDTALife Technologies25300054
DPBS, senza calcio, senza magnesioLife Technologies14200

Riferimenti

  1. Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
  2. Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
  3. Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  4. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  5. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
  6. Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  8. Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
  9. Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).
  10. Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
  11. Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  14. Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
  15. Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  16. Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
  17. Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
  18. Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).
  19. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
  22. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  23. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  24. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  25. Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  26. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
  27. Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
  28. Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  29. Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
  30. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).

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