Method Article

Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

DOI:

10.3791/53924

⸱

May 17th, 2016

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1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD è un fattore di trascrizione miogenico con una forte capacità di indurre la transdifferenziazione miogenica di molte linee cellulari non muscolari completamente differenziate. I meccanismi epigenetici coinvolti in questa transdifferenziazione sono in gran parte sconosciuti. Qui descriviamo un metodo di purificazione a doppia affinità seguito da spettrometria di massa per caratterizzare in modo esaustivo i partner MyoD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scheletrico differenziazione terminale muscolare inizia con l'impegno di cellule precursori mesodermiche pluripotenti a mioblasti. Queste cellule hanno ancora la capacità di proliferare o possono differenziarsi e si fondono in miotubi multinucleati, che maturare ulteriormente per formare fibre muscolari. Scheletrico differenziazione terminale muscolare è orchestrata con l'azione coordinata di diversi fattori di trascrizione, in particolare i membri dei fattori regolatori muscolari o MRF (MyoD, Myogenin, Myf5, e MRF4), chiamato anche il miogena bHLH fattori di trascrizione della famiglia. Questi fattori cooperano con i complessi della cromatina-rimodellamento all'interno della rete regolamentare trascrizionale elaborato per raggiungere miogenesi scheletrico. In questo, MyoD è considerato il maestro miogenico fattore di trascrizione nello scatenare differenziamento terminale muscolare. Questa nozione è rafforzata dalla capacità di MyoD convertire cellule non muscolari in cellule muscolari scheletriche. Qui si descrive un metodo utilizzato per identificare MyoDpartner proteici in modo esaustivo, al fine di chiarire i diversi fattori coinvolti nella scheletrico differenziazione terminale muscolare. L'obiettivo a lungo termine è quello di comprendere i meccanismi epigenetici coinvolti nella regolazione dei geni muscolo scheletrico, vale a dire., Obiettivi MyoD. partner MyoD sono identificati utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) da un sistema eterologo accoppiato alla caratterizzazione spettrometria di massa (MS), seguito dalla validazione del ruolo delle parti interessate durante scheletrico differenziamento terminale muscolare. forme aberranti di fattori miogenici, o la loro regolamentazione aberranti, sono associati con una serie di disturbi muscolari: miastenia congenita, distrofia miotonica, rabdomiosarcoma e difetti nella rigenerazione muscolare. Come tale, i fattori miogenici forniscono un pool di potenziali bersagli terapeutici nei disturbi muscolari, sia per quanto riguarda i meccanismi che causano la malattia stessa e meccanismi rigenerativi che possono migliorare il trattamento della malattia. Così, il understan dettagliatading delle interazioni intermolecolari ei programmi genetici controllate dai fattori miogenici è essenziale per la progettazione razionale di terapie efficaci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

organismi pluricellulari eucarioti sono composti da diversi organi e tessuti. Ogni tessuto funzionale ha un pattern di espressione genica specifica, che è determinato ad ogni passo differenziazione. differenziazione cellulare coinvolge l'attivazione di geni specifici, manutenzione della loro espressione e, in generale, il silenziamento di una serie di geni come quelli coinvolti nella proliferazione cellulare. Scheletrico differenziamento muscolare, o miogenesi, è quindi un processo a più fasi, che inizia con la determinazione delle cellule staminali mesodermiche in mioblasti, e poi porta alla differenziazione terminale di questi mioblasti in primo mono-nucleate, e quindi multi-nucleate, miotubi . Così, i mioblasti vengono "determinate" Le cellule, che sono ancora in grado di proliferare, ma si sono impegnati a lignaggio muscolo scheletrico, e quindi in grado di differenziarsi solo in cellule del muscolo scheletrico sia durante lo sviluppo embrionale o nella rigenerazione del muscolo adulto. Il processo di terminale muscolo scheletrico differireziazione è orchestrato da uno specifico programma genetico che inizia con l'uscita permanente dal ciclo cellulare delle cellule precursori mioblasti che conduce ad un silenziamento definitiva di proliferazione associati geni, come E2F geni target 1. Infatti, durante il processo di differenziazione terminale, arresto mioblasti proliferazione è un passo cruciale che precede l'espressione di geni specifici muscolo scheletrico e la fusione dei mioblasti in miotubi 2. Tale programma permette cellule staminali muscolari adulte, dette anche cellule satelliti, per differenziare durante il processo di rigenerazione dopo un trauma del muscolo scheletrico.

Miogenesi mammiferi è criticamente dipendente da una famiglia di miogenico elica-ansa-elica (bHLH) fattori di trascrizione MyoD, Myf5, MRF4 e Myogenin, spesso indicato come la famiglia di fattori scheletrico determinazione muscolare o MRF (muscolo fattori normativi) 3. Ciascuno di essi ha un ruolo essenziale nella specifica e differenziazione delle cellule del muscolo scheletrico e ha uno specifico modello di espressione 4 5-7. L'attivazione di Myf5 e MyoD costituisce il passo determinante che impegna le cellule al lignaggio miogenico, e la successiva espressione di Myogenin innesca miogenesi con l'attivazione di geni specifici del muscolo scheletrico, come MCK (muscolo creatina chinasi). Myogenic fattori di trascrizione bHLH collaborano con i membri della famiglia MEF2 nel attivazione di geni muscolari da loci precedentemente silenziosa 8. Essi hanno inoltre stimolare scheletrico trascrizione genica muscolare eterodimeri con le proteine ​​onnipresente bHLH, E12 e E47, note come proteine ​​E, che legano i cosiddetti E-box in varie regioni del gene-normativo 8. Twist, Id (inibitore di differenziazione) e di altri fattori regolano negativamente questo processo, competendo con MyoD per le proteine ​​di legame E 8.

MyoD è considerato come il giocatore importante nello scatenare muscolare terminale differenziazione 9 poiché ha la capacità di indurre un programma determinazione miogenico / differenziazione (trans-differenziazione) in molti sistemi non-muscolari completamente differenziate 10-13. In effetti, l'espressione forzata di MyoD induce la trans-differenziazione dei diversi tipi cellulari, anche quelli derivati ​​da un'altra origine embryologic 12. Ad esempio, MyoD in grado di convertire gli epatociti, fibroblasti, melanociti, neuroblasti, e adipociti in cellule muscolari-like. L'azione trans-differenziativo di MyoD comporta un'attivazione anomala del programma genetico miogenico (in particolare i suoi geni bersaglio) in un ambiente non-muscolare, concomitante al silenziamento del programma genetico originale (in particolare, i geni della proliferazione).

In proliferanti mioblasti, MyoD è espressa, ma non è in grado di attivare i suoi geni bersaglio anche quando si lega ai loro promotori 14-16. Pertanto, il requisito di MyoD siano continuamente espressi in mioblasti indifferenziati rimane abbastanza elusive. MyoD potrebbe reprimere i suoi geni bersaglio dovuto all'assunzione di enzimi cromatina modificanti repressive in proliferanti mioblasti prima del carico di attivare il rimodellamento della cromatina enzimi 14,17. Per esempio, in proliferanti mioblasti, MyoD è associata a trascrizionale co-repressori KAP-1, istone deacetilasi (HDAC) e metiltransferasi lisina repressive (km in linea), tra cui l'istone H3 lisina 9 o H3K9 e H3K27 km in linea, e sopprimere attivamente la sua espressione di geni bersaglio attraverso la definizione di un locale repressiva struttura della cromatina 14,17. È importante sottolineare che un recente rapporto ha indicato che MyoD è essa stessa direttamente metilato dalle H3K9 il KMT G9a con conseguente inibizione della sua attività transattivante 16.

I meccanismi epigenetici coinvolti in questa trans-differenziazione delle cellule non muscolari di MyoD sono largamente sconosciuti. In particolare, alcune linee cellulari sono resistenti a MyoD indotta trans-differenziazione. Così, in cellule HeLa, MyoD è inattivo oaddirittura potrebbe funzionare come repressore piuttosto che attivatore della trascrizione a causa della mancanza di espressione della subunità BAF60C del rimodellamento della cromatina complesso SWI / SNF 18. Questo modello può quindi essere di scelta per caratterizzare meglio i meccanismi di MyoD indotta repressione gene. E 'adatto anche per saggiare la capacità di MyoD di indurre ambiente cromatina repressiva alla sua loci bersaglio con i suoi partner associati e quindi scoprire i meccanismi repressivi MyoD-dipendente della proliferazione mioblasti per mettere a punto la differenziazione terminale.

Qui si descrive il protocollo per l'identificazione dei partner MyoD utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) accoppiata alla spettrometria di massa caratterizzazione (MS). L'uso di cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente Flag-HA-MyoD consentito di ottenere abbastanza materiale per purificare i complessi MyoD da estratti nucleari frazionati. L'identificazione di partner MyoD nel sistema eterologo è seguito validation in un sistema di riferimento.

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Protocol

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1. Preparazione delle frazioni HeLa-S3 nucleare Salt-estraibili e cromatina-bound

  1. Raccolta delle cellule
    1. Grow HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA (linea cellulare di controllo) in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (crescita medium) a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido.
      Nota: le cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente cellule trasdotte con il vettore vuoto (HeLa-S3 Flag-HA) Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 potrebbe essere o stabiliti utilizzando il protocollo descritto in: 19,20, o forniti dagli autori.
    2. Amplifica le cellule fino a 10 completamente confluenti piatti 150 mm di ciascuna linea cellulare (cellule HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA).
    3. Raccogliere il surnatante (contenere sottopopolazione non aderente) in 5 L filatrice.
    4. Lavare la sottopopolazione aderenti con 10 ml di PBS per piatto 150 mm, trypsinize cellule per 1 min a temtemperatura (0,05% soluzione di tripsina-EDTA, 2 ml per un piatto 15 cm).
    5. Aggiungere 4 ml del mezzo a piatto 150 mm e raccogliere le cellule in 50 ml provette.
    6. Unire il surnatante dal punto 1.1.3 (in 5 L filatore) e le cellule dal punto 1.1.5, aggiungere 500 ml di terreno di crescita pre-riscaldato fresco per ciascuna linea cellulare.
    7. Trasferire sospensione cellulare in 5 L filatore e crescere cellule per almeno 60 ore a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido.
    8. Aggiungere 500 ml di terreno di coltura fresco e far crescere le cellule per 24 ore.
    9. Aggiungere 1 litro di terreno di coltura fresco e far crescere le cellule per 24 ore.
    10. Estrarre 1 ml di sospensione cellulare per contare le cellule e controllare la vitalità cellulare. Colore 30 ml di sospensione cellulare con 30 ml di 0,4% trypan blu e contare cellule vive (non blu) al microscopio utilizzando emocitometro.
    11. Tenere la densità cellulare a 2 - 6 x 10 5 cellule / ml con l'aggiunta di terreno di coltura fresco tutti i giorni; non superiore ad 1 x 10 6 cellule / ml. Il massimodel volume per un 5 L filatore è 2,5 L.
      Nota: Per le seguenti operazioni, procedere per lotti di 2 - 2,5 L di coltura ad una densità 1 x 10 6 cellule / ml. Ripetere i punti 1.1.12 - 1.1.14 a raccogliere circa 20 L (≈ 20 g di pellet secco) di ciascuna linea cellulare prima di procedere al passo successivo.
    12. Cellule pellet per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
    13. Risospendere le cellule in 100 ml di PBS ghiacciato pipettando e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C per lavare il pellet.
    14. Ripetere il lavaggio risospendendo le cellule con 25 ml di PBS ghiacciato, trasferendo la sospensione in 50 ml di tubo e centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      Nota: I pellet cellulari possono essere utilizzati sia immediatamente o congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C per diversi giorni.
  2. Isolamento del Nuclei
    Nota: Eseguire i punti 1.2.1 - 1.4.3 nella stanza fredda.
    1. Pre-freddo BuffeRS e omogeneizzatori.
    2. Se si utilizza materiale congelato, scongelare rapidamente il pellet di cellule in bagno d'acqua a 37 ° C.
    3. Risospendere 20 g (≈ 20 ml) di cellule in 20 ml (un volume uguale alla dimensione del pellet) di tampone ipotonico A (Tabella 3) utilizzando 10 ml di tampone a prima, poi aggiungendo 5 ml, quindi aggiungendo altri 5 ml. Lavare le pipette bene con tampone fresco per ottenere il massimo delle cellule.
    4. Trasferimento sospensione cellulare 40 ml in omogeneizzatore pre-raffreddata con un pestello aderente.
    5. Omogeneizzare le cellule con 20 colpi in un omogeneizzatore (20 dentro e fuori dei movimenti) e trasferire sospensione cellulare in tubo da 50 ml.
    6. Lavare l'omogeneizzatore con 7 ml di tampone saccarosio (1/3 del volume cellulare iniziale, Tabella 3) per recuperare il massimo di celle. Trasferire la sospensione rapidamente nel tubo 50 ml dal punto 1.2.5 per preservare i nuclei e limitare la perdita.
    7. Macchia un'aliquota di 30 ml con 30 ml di 0,4% trypan blue, analizzare al microscopio per controllare l'efficienza di lisi (se la lisi ha successo, tutti i nuclei dovrebbero essere blu). Se necessario, ripetere il passaggio omogeneizzazione.
    8. Centrifugare per 7 min a 10.000 xg e 4 ° C per far sedimentare i nuclei. Salvare il surnatante come frazione citoplasmatica.
  3. Preparazione del nucleare Salt-estraibile (SE) Frazione
    1. Risospendere il pellet nuclei in 8 ml di tampone saccarosio (un volume uguale alla dimensione del pellet nuclei). Aggiungere goccia a goccia sotto agitazione completamente ad un vortice 8 ml di tampone di sale (volume pellet 1 nuclei, Tabella 3) per ottenere una concentrazione finale di 300 mM NaCl. Incubare per 30 min in ghiaccio e mescolare ogni 5 min.
    2. Diminuire concentrazione di NaCl a 150 mm con l'aggiunta di 8 ml (1/3 del volume totale) di tampone di saccarosio. Centrifugare per 10 min a 13.000 xg e 4 ° C. Raccogliere il surnatante (frazione nucleare sale estraibile, SE).
      Nota: o procedere al punto 1.3.3 o lasciare il SEfrazione sul ghiaccio durante la preparazione della frazione cromatina-bound e quindi ultra-centrifuga entrambe le frazioni contemporaneamente.
    3. Ultra-centrifuga SE per 30 minuti a 85.000 xga 4 ° C. Prendere surnatante (≈ 26 ml).
    4. Congelare 100 un'aliquota ul in azoto liquido. Procedere al punto 2 "proteina complessa purificazione", utilizzando il resto dell'estratto.
      Nota: L'aliquota deve essere usato come un controllo di input durante la fase 5.1.1.
  4. Preparazione della frazione cromatina-bound
    1. Risospendere il pellet (dal punto 1.3.5.) Meticolosamente in 7 ml (un volume uguale alla dimensione del pellet) di tampone saccarosio.
    2. Aggiungere CaCl 2 ad una concentrazione finale di 1 mM (28 ml di 0,5 M CaCl 2 per 14 ml di sospensione) per attivare MNase (passo 1.4.4) e miscelare.
    3. sospensione preriscaldamento per 1 min a 37 ° C.
    4. Aggiungere 70 ml nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere la concentrazione finale di 0,0025 U / ml (1/200 di diluizione da 0,5U / ml magazzino) e mescolare.
    5. Incubare esattamente 12 minuti a 37 ° C. Mescolare ogni 4 min.
    6. Immediatamente posto la reazione in ghiaccio.
    7. Per interrompere l'attività MNase, aggiungere 112 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 diluizione) ad una concentrazione finale di 4 mM. Incubare per 5 minuti in ghiaccio.
    8. Sonicare 5 volte per 1 minuto con ampiezza alta, tra due sonications consentire una pausa di 1 minuto (10 min in totale).
    9. Ultracentrifuga per 30 min a 85.000 xg e 4 ° C.
    10. Raccogliere il surnatante (nucleosoma arricchito frazione, NE, ≈ 12 ml).
    11. Congelare 50 un'aliquota microlitri in azoto liquido. Procedere al punto 2 "proteina complessa purificazione", utilizzando il resto dell'estratto.
      Nota: L'aliquota deve essere usato come un controllo di input durante la fase 5.1.1.

2. Complessi proteina Purificazione

Nota: Procedere in estratti parallele da ciascuna linea cellulare (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e il controllo, Helun-S3 Flag-HA).

  1. Purificazione base della bandierina
    1. Prelavaggio resina Flag. Utilizzare 600 ml di resina Flag (dal commerciale 50% stock) per ogni punto sperimentale (SE e NE frazioni per ogni linea cellulare).
    2. Resin Transfer in 15 ml di tubo, risospendere in 13 ml di Tegn fredda (tabella 3), centrifugare per 2 min a 1000 xg e rimuovere il surnatante. Ripetere 5 volte. Dopo l'ultimo lavaggio resina risospendere Flag in uguale volume di Tegn (300 microlitri per ogni punto sperimentale).
    3. Per ogni punto sperimentale, miscelare 600 ml di resina Flag lavata ed i corrispondenti estratti proteici (in una provetta da 15 ml per la NE 12 ml e in un tubo da 50 ml per le frazioni 26 ml SE, rispettivamente). Incubare su una ruota girevole overnight a 4 ° C.
    4. Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C, messo da parte il surnatante e mantenere a 4 ° C finché il risultato del test di efficienza di purificazione (2.2).
    5. Per i campioni SE, risospendere la resina Flagin 4 ml di Tegn e trasferire in una provetta da 15 ml. Ripetere questo passaggio 3 volte, ogni volta per trasferire lo stesso tubo 15 ml per evitare di perdere perline. Centrifugare 2 min a 1000 xg e 4 ° C e rimuovere il surnatante.
    6. resina lavata Flag 7 volte in una provetta da 15 ml con 13 ml di Tegn e centrifugazione 2 min a 1000 xg e 4 ° C.
    7. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere in 1 ml Tegn e il trasferimento in un tubo di 1,5 ml a basso vincolante. Centrifugare 2 min a 1000 xg e 4 ° C e rimuovere il surnatante.
    8. Risospendere in 200 ml di soluzione di peptide Flag a 4 mg / ml a pH 7,8 per ogni punto sperimentale. Mescolare le perline e peptidi. Aggiungere 200 ml di tampone Tegn e incubare a 4 ° C per almeno 4 ore o durante la notte per eluire le proteine ​​legate.
    9. Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C e trasferire la resina e surnatante (eluato Flag) per una colonna di spin vuoto posto in una provetta 2 ml.
    10. Centrifugare la colonna, raccogli sinistra-over surnatante nel tubo 2 ml.
    11. Raccogliere la resina Flag aggiungendo tampone Tegn alla colonna e procedere alla seconda eluizione bandiera con 200 ml di soluzione Flag peptide (4 mg / ml) per una notte a 4 ° C per ogni punto sperimentale.
    12. Ripetere i punti 2.1.9 - 2.1.10 per raccogliere seconda eluizione. Combinare primo e secondo eluati.
  2. Prova della Purificazione efficienza
    Nota: Durante la fase 2.1.11 - 2.1.12, eseguire SDS-PAGE e colorazione argento (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Prendere 15 ml di eluati, aggiungere 5 ml di tampone 4x carico e 2 ml di 10x agente riducente, far bollire per 5 minuti a 96 ° C ed eseguire un SDS-poliacrilammide 4 - gel al 12% in base alle istruzioni del produttore.
    2. Colorare il gel con kit di colorazione argento (seguire le istruzioni del produttore). Se c'è chiare differenze nei modelli di proteine ​​tra Flag-HA-MyoD e Flag-HA eluiti finto, in particolare la fascia di Flag-HA MyoD (circa 50 kDa, Figura 1A), procedere alla successiva step.
  3. Emoagglutinina (HA) Purificazione basata su
    1. resina lavata HA trasferendo in 15 ml di tubo, risospendere in 13 ml di Tegn e centrifugazione 2 min a 1000 xga 4 ° C. fase di lavaggio ripetere 5 volte. Dopo l'ultimo lavaggio perline risospendere in uguale volume di tampone Tegn.
      Nota: Il volume deve essere regolato secondo l'efficienza della depurazione Flag-based. Inizia con 300 ml dalla commerciale 50% stock per ogni punto sperimentale.
    2. Trasferire la resina HA per ogni punto sperimentale in un tubo da 1,5 ml a basso vincolante. Centrifugare 2 min a 1000 xga 4 ° C, eliminare la massima del tampone di lavaggio (Tabella 3) e aggiungere gli eluati da depurazione Flag-based alla resina HA.
    3. Incubare le provette sulla rotazione overnight ruota a 4 ° C.
    4. Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C, messo da parte il surnatante e mantenere a 4 ° C finché il risultato del test di efficienza di purificazione (2.3.12.).
    5. Risospendere la resina HA in 0,5 ml di Tegn, il trasferimento a un nuovo minimo vincolante 1,5 ml tubo. Ripetere risospensione volta aggiungendo alla stessa provetta da 1,5 ml per evitare di perdere perline e centrifugare 2 min a 1000 xg e 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
    6. Lavare perline 8 volte utilizzando 1 ml di Tegn ogni volta, centrifugazione 2 min a 1000 xg e 4 ° C e rimozione surnatante (evitare perline perdere). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline in 0,5 ml tubi.
    7. Rimuovere il più possibile surnatante. Aggiungere 100 ml di HA soluzione libera peptide (4 mg / ml) a pH 7,8 perline per eluire le proteine ​​legate. Incubare sulla ruota girevole per tutta la notte a 4 ° C.
      Nota: La quantità di HA-peptide deve essere regolata a seconda l'abbondanza dei complessi.
    8. Centrifugare per 2 min a 1000 xga 4 ° C e trasferire la resina e surnatante (HA eluato) ad una colonna di spin vuoto posto in una provetta 2 ml.
    9. Centrifugare la colonna per raccogliere sinistra-over surnatante nel tubo 2 ml.
    10. Eseguire una seconda eluizione con 100 ml di HA peptide (4 mg / ml) per ciascun punto sperimentale. Incubare sulla ruota girevole per tutta la notte a 4 ° C. Ripetere il punto 2.3.8 - 2.3.9 per raccogliere seconda eluizione.
    11. Combinare primo e secondo eluati.
    12. Test di efficienza di purificazione mediante SDS-PAGE e colorazione argento (vedere i passaggi 2.2.) (Figura 1A).
    13. Concentrare l'eluato HA di 30 ml utilizzando unità filtro centrifugo con 10 kDa cut-off (limite di peso molecolare nominale, NMWL) secondo le istruzioni del produttore.
    14. Dividere i campioni sono concentrati in due parti: 22.5 (3/4) e 7.5 (1/4) ul. Snap congelare 1/4 dei campioni in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Utilizzare la parte 3/4 per il passaggio 3.
      Nota: La parte congelata 1/4 deve essere utilizzato per la conferma dei risultati di spettrometria di massa mediante Western blot (vedi passo 5.1).

Analisi 3. Spettrometria di Massa

Nota: Le seguenti operazioni dovrebbero essere discussi con l'impianto spettrometria di massa che eseguirà l'analisi.

  1. Supplemento 3/4 (22,5 ml) dei campioni con 7,5 ml di tampone di 4x carico e 3,3 ml di 10x agente riducente e far bollire per 5 min a 96 ° C.
  2. Caricare i campioni su una SDS-poliacrilammide 4 - gel 12%. Eseguire gel a 150 V costante per 5 minuti per consentire tutte le proteine ​​di entrare nel gel senza separazione.
  3. Lavare il gel con acqua; fissare per 20 - 30 min con soluzione fissativa (acido acetico al 10%, 50% metanolo, 40% di acqua ultra-pulita) poi lavare il gel fisso 5 volte in acqua ultra-pulita.
  4. Tagliare le bande contenenti le proteine, conservare in 1 ml di acqua in un tubo da 1,5 ml e invia a spettrometria di massa.

Analisi 4. I dati

Nota: Si tratta di un orientamento generale per l'analisi. I passaggi esatti dipenderanno dalla particolare modalità dei dati forniti da impianto MSutilizzato per eseguire l'analisi (ad esempio, 21,22).

  1. Confrontare l'elenco delle proteine ​​identificate in eluati "MyoD" con l'elenco ottenuto dal corrispondente preparazione controllo negativo. Escludere dalle analisi delle proteine ​​che si trovano in entrambe le liste.
  2. Rimuovere proteine ​​che hanno ≤2 numero totale dei peptidi identificati dalla lista rimanente.
  3. L'accesso annotazione funzionale e la classificazione funzionale della lista ottenuto delle proteine ​​utilizzando le risorse DAVID Bioinformatica (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) e classificare la lista delle proteine ​​23,24.
  4. (Opzionale) Rimuovere dalla lista "autostoppisti", cariche proteine ​​non-nucleari con un forte accidentale vincolanti per carica negativa del DNA 25. Questi contengono proteine ​​del citoscheletro, citoplasmatici, mitocondriale, membrana e recettori (folding delle proteine, citoscheletro e varie proteine ​​di gruppo nelle tabelle 1 e 2).
  5. Confrontare le liste ottenute delle interattori MyoD da SE e NE frazioni per identificare le proteine ​​e proteine ​​comuni specifici per ogni frazione (Figura 2).

5. Conferma di Interactiani identificato tramite Western Blot

  1. Conferma in HeLa-S3 Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 Flag-HA
    1. campioni di eluato Scongelare ottenuto al passaggio 2.3.14 (7,5 ml) su ghiaccio. Aggiungere 12 ml di tampone Tegn, 10 ml di tampone 4x carico e 3 ml di 10x agente riducente. campioni Far bollire per 5 min a 96 ° C.
    2. Preparare campioni di ingresso per il Western blotting.
      1. Scongelare aliquote dai gradini 1.3.9 e 1.4.11 e misurare la concentrazione di proteine, per esempio utilizzando il kit BCA (seguire le istruzioni del produttore).
      2. Utilizzare 15 mg di proteina per corsia. Misurare la quantità appropriata di estratto e regolare il volume del campione fino a 15 microlitri con tampone Tegn.
      3. Aggiungere 5 microlitri di buffer di carico e 4x1.5 ml 10x agente riducente. campioni Far bollire per 5 min a 96 ° C.
    3. Eseguire un'analisi western blot con anticorpi specifici di interesse (per il candidato socio identificati durante l'analisi MS) con 15 ml di campioni di eluato. Utilizzare estratti ingresso come controllo dei livelli di proteine ​​endogene (Figura 3A).
  2. La conferma nel sistema cellulare Rilevante
    1. Preparazione dell'estratto nucleare totale di C2C12 mioblasti di topo.
      1. Grow C2C12 mioblasti di topo in terreno DMEM supplementato con 15% di siero fetale di vitello, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umido. Non superare mai confluenza cella 80% per mantenere le cellule in stato proliferativa.
      2. Grow almeno due piatti 150 mm di C2C12 per un punto (un anticorpo) di immunoprecipitazione (IP). Aspirare il mezzo, lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS.
      3. Raschiare le cellule e raccogliere in 15 ml di tubo. Centrifuge a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. surnatante degli scarti.
      4. Stima il volume del pellet cellulare (= cellule V). Risospendere delicatamente il pellet in 3 volumi V cella di ipotonica tampone B per interrompere membrana citoplasmatica (Tabella 3).
      5. Aggiungere 0,44 x volume cellulare V del 10% NP-40 per raggiungere la concentrazione finale di 1% (v / v). Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per mescolare.
      6. Aggiungere 0,89 x volume cellulare V SR (tabella 3) per preservare l'integrità nuclei. Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per omogeneizzare la sospensione e centrifugare per 5 min a 2000 xg per pellet nuclei.
      7. Rimuovere il surnatante (frazione citosolica). Stimare il volume di nuclei pellet (= V NUC). Risospendere pellet nuclei in un volume V NUC di tampone saccarosio.
      8. Aggiungere goccia a goccia sotto agitazione a fondo su un vortice un volume V nuc di tampone di sale per ottenere una concentrazione finale di 300 mMNaCl, e incubare per 30 min in ghiaccio. Mescolare ogni 5 minuti.
      9. Aggiungere un volume V nuc di tampone saccarosio (per ridurre la concentrazione di NaCl di 150 mM) e CaCl 2 (concentrazione finale 1 mM). Mescolare.
      10. sospensione pre-calore per 1 min a 37 ° C, aggiungere nucleasi micrococcica per ottenere finale della concentrazione di 0,0025 U / ml (1/200 a magazzino di 0,5 U / ml). Mescolare.
      11. Incubare esattamente 12 minuti a 37 ° C. Mescolare ogni 3 min.
      12. Porre immediatamente la reazione sul ghiaccio e aggiungere EDTA (concentrazione finale 4 mm) per fermare le attività MNase. Incubare per 5 minuti in ghiaccio.
      13. Sonicare 5 volte per 0,5 minuti ciascuno con ampiezza alta. Tra due sonications, consentire una pausa di 0,5 min (5 min in totale).
      14. Ultra-centrifuga per 30 minuti a 85.000 xg e 4 ° C. Raccogliere il surnatante (estratto nucleare totale).
      15. Misurare la concentrazione di proteine ​​dell'estratto nucleare totale, ad esempio utilizzando il kit BCA (seguire le istruzioni del produttore) e procedere immediately al punto 5.2.2.
    2. Immunoprecipitazione (IP) di MyoD endogena.
      1. Per pre-chiaro gli estratti, lavare 10 ml di proteine ​​G agarosio per ogni punto IP.
        1. Trasferire il volume necessario di proteine ​​G agarosio in una provetta da 1,5 ml, risospendere in 1,4 ml di Tegn freddo, centrifugare per 2 min a 1.800 xg e rimuovere il surnatante. Ripetere 3 volte.
      2. Mescolare pre-lavati perline proteina G agarosio con il volume appropriato di estratto nucleare totale. Utilizzare 500 mg di proteine ​​totali estratto nucleare per punto IP.
      3. Incubare su una ruota girevole a 4 ° C per 2 ore a pre-cancellare gli estratti.
      4. Centrifugare per 5 min a 1800 xga 4 ° C. Mantenere il surnatante.
      5. Mescolare 5 mg di MyoD Ab o 5 mg di IgG di coniglio con 500 mcg estratti nucleari totali pre-liquidati in 1,5 ml bassi tubi vincolanti. Aggiungi Tegn tampone fino a 1 ml. Incubare su una ruota girevole a 4 ° C durante la notte.
        Nota: Eseguire la fopo passi durante la fase 5.2.2.3.
      6. Prelavaggio 7,5 microlitri proteina A / G soluzione madre perline per punto IP.
        1. Trasferire il volume necessario di perline in una provetta da 1,5 ml, perline risospendere in 1 ml di Tegn e centrifugare a 1800 xga 4 ° C per 2 min. Rimuovere il surnatante. Ripetere 3 volte.
      7. Risospendere proteina A / G perline in 1,5 ml soluzione bloccante (Tabella 3) e incubare su una ruota girevole notte a 4 ° C.
      8. estratti centrifuga totale nucleari incubate con Abs (punto 5.2.2.5) a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Mantenere il surnatante.
      9. Centrifuga bloccato proteina A / G resina (passo 5.2.2.7) a 1.800 xg per 2 minuti a 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere in 1 ml di tampone Tegn. Re-centrifugare a 1800 xg per 2 minuti a 4 ° C per lavare tampone di bloccaggio.
      10. Risospendere bloccato proteina A / G resina in 1 ml di tampone Tegn e aliquota in nuovi tubi a basso contenuto proteico vincolante per ottenere 7,5 microlitri blocked proteina A resina / G per punto IP. Centrifugare a 1.800 xg a 4 ° C per 2 min ed eliminare quanto più possibile del supernatante.
      11. Aggiungere gli estratti nucleari totali incubate con l'Abs (o controllare IgG) alla Una resina / G. Mescolare e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT) su una ruota girevole.
      12. sospensione Centrifugare 1.800 xg a temperatura ambiente per 2 min. Gettare il surnatante, risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio e la sospensione di trasferimento in nuovi tubi bassi vincolanti. Incubare a temperatura ambiente su una ruota girevole per 5 min.
      13. sospensione Centrifugare a 1.800 xg a temperatura ambiente per 2 min, risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio e incubare a RT su una ruota girevole per 5 min. Ripeti 4 volte. Per l'ultimo trasferimento di lavaggio in una nuova provetta basso vincolante.
      14. Rimuovere massima del surnatante. Aggiungere 7 ml di tampone di lavaggio, 7 ml di tampone 4x carico e 3 ml di 10x agente riducente ai talloni, mescolare e far bollire per 5 minuti a 96 ° C.
      15. Eseguire un'analisi Western Blot con anticorpi di interest (specifica per il candidato partner per il sistema immunitario precipitato proteine). Utilizzare 1% (5 mg) di estratti di ingresso come controllo dei livelli di proteine ​​endogene (Figura 3B).

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Results

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Per comprendere la regolazione dell'attività MyoD, abbiamo intrapreso la caratterizzazione esaustivo dei complessi MyoD utilizzando purificazione biochimica, basato sulla immunopurificazione di una forma doppia targhetta di MyoD seguita da spettrometria di massa (MS). L'uso della linea di cellule HeLa-S3 esprime MyoD Flag-HA-tag e una linea cellulare di controllo che esprime permessi Flag-HA per ottenere abbastanza materiale per purificare il complesso MyoD eseguendo doppio affinità puri...

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Discussion

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Il metodo presentato consenta l'identificazione esaustivo di partner di un fattore di trascrizione, MyoD. Ha rivelato partner MyoD in un sistema eterologo resistente alla differenziazione MyoD indotta, ovvero cellule HeLa-S3. Così, per definizione, i partner MyoD identificati sono ubiquitariamente espressi. Questi includono fattori generali e specifici di sequenza di trascrizione, enzimi cromatina modificanti, proteine ​​di elaborazione RNA, chinasi (Tabelle 1 e 2). Dato che le cell...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro nel laboratorio di Ait-Si-Ali è stato sostenuto dall'Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot e il concorso "Chi sono io?" Laboratorio di Eccellenza #ANR-11- LABX-0071 finanziato dal governo francese attraverso il suo programma "Investimenti per il futuro" gestito dall'ANR nell'ambito della sovvenzione #ANR-11-IDEX-0005-01. EB è stato sostenuto da una sovvenzione INCa.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linee cellulari
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipment
Corning
:  Omogeneizzatore a dounce Wheaton432-1273 e 432-1271
Dispositivo di agitazione per spinnerBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
EmocitometroMarienfeld Superior 640610
Provette a basso legameSorenson27210
Colonna di centrifuga vuotaBio-Rad7326204
Reagents
SDS-poliacrilammide 4-12%  gelLife technologiesNP0336BOX
4x tampone di caricamento Life technologiesNP0007
Agente riducente 10xLife technologiesNP0004
Kit di colorazione dell'argentoLife technologiesA8592
Unità filtranti centrifughe, 10KMilliporeUFC501024
Proteine G perline di agarosioSigma-AldrichP4691
Protein A/G  ResinaThermo Scientific53132
Flag resin (gel di affinità anti-agarosio M2-Flag)Resina Sigma-AldrichA2220
HA (agarosio monoclonale anti-HA)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Flag free peptide (DYKDDDDK)Ansynth Service BVSintesi personalizzataRisospensione fino a 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
peptide libero da HA (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVSintesi personalizzataRisospensione fino a 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Kit per il dosaggio delle proteine a base di acido bicinconinico : Kit BCAThermo Scientific23225
Inibitori della proteasiSigma-AldrichS8830
Substrato HRP a chemiluminescenza potenziata (ECL) a base di luminolTecnologie per la vita34075
BSASigma-AldrichA9647
DNA spermatico di salmone tosato (acido desossiribonucleico, sale sodico dai testicoli di salmone)Sigma-AldrichD1626
Spermina tetracloridratoSigma-AldrichS1141
SpermidinaSigma-AldrichS0266
GliceroloSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS tampone di corsaLife technologiesNP0001
DMEM (alto glucosio)Sigma-AldrichD0822Pre-riscaldamento  a 37 gradi; C prima dell'uso
Tripsina-EDTA (0,05% rosso fenolotechnologies25300-054
SieroGE sanità scienze della vita PAA A15-102Ogni lotto di siero deve essere prima testato per le cellule.
Penicillina e streptomicinaLife technologies15140-122
Soluzione di Trypan Blue, 0,4%Life technologies15250-061
Acqua (filtrata sterile)Sigma-AldrichW3500
Antibodies
HA da ratto (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Da utilizzare per il western blotting
MyoDSanta CruzSC-760Da utilizzare per l'immunoprecipitazione e il western blotting
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Tecnologia di segnalazione cellulare8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinaSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG TopoSanta CruzSC-2025
IgG ConiglioSanta CruzSC-2027
Capra anti-ratto -HRPSigma-AldrichA9037
Capra anti-coniglio -HRPSigma-AldrichA6154 
Anti-topo di capra -HRPSigma-AldrichA4416
Spinner Omogeneizzatore per 778531 Life

References

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