Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

Ekaterina Boyarchuk; Philippe Robin; Lauriane Fritsch; Véronique Joliot; Slimane Ait-Si-Ali

doi:10.3791/53924

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Articolo metodologico

Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

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DOI:

10.3791/53924

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17 maggio 2016

Ekaterina Boyarchuk¹ , Philippe Robin¹ , Lauriane Fritsch¹ , Véronique Joliot¹ , Slimane Ait-Si-Ali¹

¹Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In questo articolo

Sommario

MyoD è un fattore di trascrizione miogenico con una forte capacità di indurre la transdifferenziazione miogenica di molte linee cellulari non muscolari completamente differenziate. I meccanismi epigenetici coinvolti in questa transdifferenziazione sono in gran parte sconosciuti. Qui descriviamo un metodo di purificazione a doppia affinità seguito da spettrometria di massa per caratterizzare in modo esaustivo i partner MyoD.

Abstract

Scheletrico differenziazione terminale muscolare inizia con l'impegno di cellule precursori mesodermiche pluripotenti a mioblasti. Queste cellule hanno ancora la capacità di proliferare o possono differenziarsi e si fondono in miotubi multinucleati, che maturare ulteriormente per formare fibre muscolari. Scheletrico differenziazione terminale muscolare è orchestrata con l'azione coordinata di diversi fattori di trascrizione, in particolare i membri dei fattori regolatori muscolari o MRF (MyoD, Myogenin, Myf5, e MRF4), chiamato anche il miogena bHLH fattori di trascrizione della famiglia. Questi fattori cooperano con i complessi della cromatina-rimodellamento all'interno della rete regolamentare trascrizionale elaborato per raggiungere miogenesi scheletrico. In questo, MyoD è considerato il maestro miogenico fattore di trascrizione nello scatenare differenziamento terminale muscolare. Questa nozione è rafforzata dalla capacità di MyoD convertire cellule non muscolari in cellule muscolari scheletriche. Qui si descrive un metodo utilizzato per identificare MyoDpartner proteici in modo esaustivo, al fine di chiarire i diversi fattori coinvolti nella scheletrico differenziazione terminale muscolare. L'obiettivo a lungo termine è quello di comprendere i meccanismi epigenetici coinvolti nella regolazione dei geni muscolo scheletrico, vale a dire., Obiettivi MyoD. partner MyoD sono identificati utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) da un sistema eterologo accoppiato alla caratterizzazione spettrometria di massa (MS), seguito dalla validazione del ruolo delle parti interessate durante scheletrico differenziamento terminale muscolare. forme aberranti di fattori miogenici, o la loro regolamentazione aberranti, sono associati con una serie di disturbi muscolari: miastenia congenita, distrofia miotonica, rabdomiosarcoma e difetti nella rigenerazione muscolare. Come tale, i fattori miogenici forniscono un pool di potenziali bersagli terapeutici nei disturbi muscolari, sia per quanto riguarda i meccanismi che causano la malattia stessa e meccanismi rigenerativi che possono migliorare il trattamento della malattia. Così, il understan dettagliatading delle interazioni intermolecolari ei programmi genetici controllate dai fattori miogenici è essenziale per la progettazione razionale di terapie efficaci.

Introduzione

organismi pluricellulari eucarioti sono composti da diversi organi e tessuti. Ogni tessuto funzionale ha un pattern di espressione genica specifica, che è determinato ad ogni passo differenziazione. differenziazione cellulare coinvolge l'attivazione di geni specifici, manutenzione della loro espressione e, in generale, il silenziamento di una serie di geni come quelli coinvolti nella proliferazione cellulare. Scheletrico differenziamento muscolare, o miogenesi, è quindi un processo a più fasi, che inizia con la determinazione delle cellule staminali mesodermiche in mioblasti, e poi porta alla differenziazione terminale di questi mioblasti in primo mono-nucleate, ....