Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.
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Articolo metodologico
Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il follicolo pilifero (HF) è un sistema ideale per studiare la biologia e la regolazione delle cellule staminali adulte (SC). Questo mini organo dinamico è rifornito da pool distinti di SC, che si trovano nella parte permanente dell'HF, una regione nota come rigonfiamento. Queste SC multipotenti sono state inizialmente identificate come cellule di ritenzione dell'etichetta a ciclo lento; tuttavia, il loro isolamento è stato reso possibile dopo l'identificazione di specifici marcatori cellulari, come il CD34 e la cheratina 15 (K15). Qui, descriviamo un metodo robusto per isolare le SC di rigonfiamento e i cheratinociti epidermici dagli HF di topo utilizzando la tecnologia di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Le SC isolate del follicolo pilifero (HFSC) possono essere utilizzate in vari modelli di innesto in vivo e sono un prezioso modello in vitro per studiare i meccanismi che regolano la multipotenza, la quiescenza e l'attivazione.
Introduzione
Le cellule staminali adulte (SCS) sono essenziali per mantenere l'omeostasi tissutale, sostituendo le cellule che muoiono e riparare tessuti danneggiati su lesioni. Questi SC sono definite dalla loro capacità di subire un continuo auto-rinnovamento e di differenziarsi in varie linee cellulari 1-3. I sistemi più studiati, che dipendono SCs adulti per il rifornimento, includono il sistema ematopoietico, l'intestino ed il 1,2,4 pelle.
Durante l'embriogenesi, la pelle inizia come un singolo strato di cellule epidermiche. Morfogenesi del follicolo pilifero (HF) inizia quando le cellule mesenchimali popolano la....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio di Ministero della Salute di Israele. Tutti gli animali sono stati trattati secondo il protocollo approvato istituzionale cura degli animali IL-02.302-2015 del Technion Israel Institute of Technology.
1. Preparazione sperimentale
- Preparazione del chelato siero fetale bovino
Nota: Le cellule epiteliali sono molto sensibili al calcio quindi è fondamentale per controllare l'esposizione di queste cellule al calcio. Al fine di garantire che le cellule non sono esposti al calci....
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Risultati
Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento e l'isolamento di due tipi di popolazioni:. Rigonfiamento SC e cheratinociti epidermici Figura 2 illustra le principali fasi del protocollo. Utilizzando pelle rimossa dalla dorsale posteriore di 8 settimane di età topi, abbiamo arricchito SC rigonfiamento utilizzando il marcatore CD34, che si esprime solo in HFSCs; e Sca-1, che le etichette cheratinociti epidermici. La figura 3 mostra divers.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è ben consolidata per isolare HFSCs dalla pelle dorsale di topi adulti, ma può essere ugualmente applicata per l'isolamento di altre popolazioni all'interno della struttura HF, basato sulla selezione dei marcatori 2,16,23,28,29. Questo metodo è notevolmente vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento cellulare, come la dissociazione dei tessuti, dal fatto che un tipo di cellula specifico può essere selezionato e raccolto da una miscela di popolazioni cellulari eterog.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla sovvenzione NIH RO1GM60124 (a H.S.). H.S. è un ricercatore presso l'Howard Hughes Medical Institute. Y.F. è supportato dalla Deloro Career Advancement Chair e dalla German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. è supportato dalla borsa di studio post-dottorato Coleman-Cohen.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
2
di dissezione Gli 352235352063 seccoO distillato in pirex
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Isoflurano | Terapia intensiva primordiale | 66794-017-10 | |
| Anidride carbonica | - | - | |
| Rasoio elettrico | Oster | Golden A5 | Shaver di qualsiasi altra azienda potrebbe essere utilizzato |
| al 70% di etanolo | Gadot Lab | 830000051 | al 96% di ehtanol diluito con acqua distillata. |
| Tappetino | strumenti di dissezione di qualsiasi fornitore possono essere utilizzati | ||
| Pinze | Dumont | 11251-10 | Foreceps di qualsiasi altra azienda possono essere utilizzati |
| Forbici | Dumont | 14094-11 | Si potrebbero usare forbici di qualsiasi altra azienda |
| Aghi/Perni | - | - | |
| Bisturi | Albion | 10 | Assicurarsi che il bisturi abbia un'estremità smussata |
| Piatto di coltura tissutale 60 mm x 15 mm | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| PBS-In | house PBS senza calcio e magnesio | ||
| 0,25% tripsina/EDTA | Biological Industries | 03-050-1A | La tripsina ottenuta da un'azienda diversa potrebbe avere un'attività diversa e la durata del digestato della tripsina deve essere regolata di conseguenza |
| Pipette 10 ml | Sigma-Aldrich | Corning, 4488 | |
| Ice | - | - | |
| 50 ml provette da centrifuga sterili | Minplast Ein-shemer | 35050-43 | |
| 70 &; m Filtro cellulare | Fisher | 22362548 | |
| 40 µ m Filtro cellulare | Fisher | 22362549 | |
| Tampone di colorazione-Centrifuga | |||
| Eppendorf 5804 R | 5805 000.017 | ||
| Provette FACS con tappi filtro cellulare | Falco | ||
| tubi FACS | Falco | ||
| Integrina & beta; 1 | eBioscience | 25-0291 | 1:400 |
| Integrina &alfa; 6 | eBioscience | 15-0495 | 1:600 |
| Sca I | eBioscience | 11-5981 | 1:200 |
| CD34 | eBioscience | 9011-0349 | 1:300 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 50 ng/ml |
| Bicchiere Chelex | BioRad | 142-2842 | |
| H | |||
| . | - | - | |
| Stir bar | - | - | |
| NHCl | BioLab | 1903059 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Beit Haemek Biological Industries | 400718 | FBS ottenuto da un'altra azienda può essere utilizzato |
| Flacone di vetro da 1 litro | Ilmabor | Boro 3.3 | |
| Filtro per flacone | Autofil | 1102-RLS |
Riferimenti
- Wagers, A. J., Weissman, I. L. Plasticity of adult stem cells. Cell. 116, 639-648 (2004).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118<....
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Ristampe e permessi
