Articolo metodologico

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

DOI:

10.3791/53936

⸱

14 aprile 2016

 ,  , 
1Department of Urology, Johns Hopkins University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per la dissezione delle ossa lunghe degli arti posteriori (femori e tibie) dal topo di laboratorio. Descriviamo inoltre una tecnica rapida per l'isolamento del midollo osseo da queste ossa che utilizza la centrifugazione per la rimozione del midollo osseo dallo spazio del midollo osseo.

Abstract

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L'indagine sull'osso e sul midollo osseo è fondamentale in molti campi di ricerca, tra cui la biologia ossea di base, l'immunologia, l'ematologia, le metastasi del cancro, la biomeccanica e la biologia delle cellule staminali. Nonostante l'importanza dell'osso negli stati sani e patologici, tuttavia, è un organo in gran parte poco studiato a causa della mancanza di conoscenze specialistiche sulla dissezione ossea e sull'isolamento del midollo osseo. I topi sono un organismo modello comune per studiare gli effetti sull'osso e sul midollo osseo, richiedendo un metodo standardizzato ed efficiente per la dissezione dell'osso lungo e l'isolamento del midollo osseo per l'elaborazione di grandi coorti sperimentali. Descriviamo una procedura di dissezione semplice per la rimozione del femore e della tibia adatta per applicazioni a valle, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'analisi istomorfologica e il test di resistenza. Inoltre, descriviamo una procedura rapida per l'isolamento del midollo osseo dalle ossa lunghe tramite centrifugazione con tempo di manipolazione limitato, ideale per la selezione cellulare, la coltura cellulare primaria o l'estrazione di DNA, RNA e proteine. Il protocollo è semplificato per l'elaborazione rapida dei campioni per limitare l'errore sperimentale ed è standardizzato per ridurre al minimo la variabilità da utente a utente.

Introduzione

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Lo studio delle ossa lunghe e delle cellule del midollo osseo è fondamentale per una miriade di discipline di ricerca, tra cui, ma non solo, la biologia ossea, la biologia del cancro, l'immunologia, l'ematologia e la biomeccanica. L'osso è un organo altamente dinamico che, insieme alla cartilagine, forma lo scheletro per fornire supporto meccanico contro il carico e protezione degli organi interni. Inoltre, i componenti minerali dell'osso sono un pozzo di stoccaggio per le molecole di segnalazione critiche calcio e fosforo, così come per altri fattori1. Infine, le ossa ospitano il midollo osseo e, insieme agli osteoblasti che formano l'osso metabolicamente attivi e agli osteoclasti che riassorbono l'osso, forniscono la nicchia di cellule staminali necessaria per il mantenimento delle popolazioni di cellule ematopoietiche e linfoidi.

L'osso e il midollo osseo sono colpiti da molti disturbi, che spesso portano a disfunzione del midollo osseo, forte dolore osseo e frattura patologica. L'osso è un sito comune di metastasi in molti tumori solidi, in particolare il cancro al seno e il cancro alla prostata, in cui le cellule tumorali coinvolgono direttamente la nicchia del midollo osseo per avviare il circolo vizioso delle metastasi ossee e spostare le cellule staminali ematopoietiche2,3. Le neoplasie ematopoietiche, tra cui il mieloma e la leucemia, sono caratterizzate da disfunzione del midollo osseo e da deregolazione del rimodellamento osseo sano1. Anche altri disturbi scheletrici non maligni sono aree di ricerca attive, come l'osteoartrite, l'osteoporosi, la scoliosi e il rachitismo. Anche in un individuo altrimenti sano, il fallimento biomeccanico in un osso porta a una frattura dolorosa. Tutti questi disturbi rappresentano aree di ricerca attive con l'obiettivo di identificare nuove misure preventive e regimi di trattamento per ridurre la morbilità e la mortalità.

Per ricercare la pletora di ruoli dell'osso e del midollo osseo, sia in condizioni fisiologiche che patologiche, è fondamentale per i ricercatori avere un metodo standardizzato semplice ed efficiente per la dissezione delle ossa lunghe del topo per una rapida elaborazione di grandi esperimenti in vivo. Il protocollo di dissezione qui descritto è adatto a tutte le analisi delle ossa lunghe, tra cui l'imaging ex vivo, l'istologia, l'istomorfometria e i test di forza. Allo stesso modo, un metodo standardizzato di isolamento del midollo osseo con un elevato recupero delle cellule del midollo osseo e una bassa variabilità tra gli utenti è importante per analisi sperimentali come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) o la PCR quantitativa (qPCR), nonché per applicazioni a valle come la coltura cellulare primaria di cellule del midollo osseo.

Protocollo

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Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa in conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health.

La dissezione 1. arto posteriore delle ossa lunghe

  1. Euthanize il mouse in conformità con le linee guida istituzionali.
  2. Posizionare il mouse in posizione supina e apporre da appuntare tutte e quattro le gambe attraverso le pastiglie del mouse zampa sotto l'articolazione della caviglia.
  3. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo, accuratamente dousing le gambe.
  4. Fai una piccola incisione a destra di linea mediana nel basso addome, appena sopra l'anca.
  5. Estendere l'incisione lungo la gamba e oltre la caviglia.
  6. Tirare indietro la pelle e tagliare il muscolo quadricipite ancorato all'estremità prossimale del femore per esporre il lato anteriore del femore e il pin out dalla gamba, posizionando il perno con un angolo di 45 gradi dalla scheda.
  7. Con la fogliae delle forbici contro il lato posteriore del femore, tagliare i femorali dal ginocchio.
  8. Tirare indietro la pelle ed i muscoli adduttori ancorati alla estremità prossimale del femore per esporre il lato posteriore del femore e il pin dalla gamba, mettendo il perno in un angolo di 45 gradi dalla scheda.
  9. Con la pinza, tenere l'estremità distale del femore, appena sopra il ginocchio. Guida lame delle forbici su entrambi i lati del femore verso l'anca, facendo attenzione a non tagliare nel femore stesso.
  10. Dopo aver raggiunto la testa del femore, indicato dalle forbici apertura leggermente, ruotare le forbici con lama superiore delle forbici muovono direttamente sopra la testa femorale di dislocare femore, facendo attenzione a non scattare l'osso sotto della testa femorale.
  11. Afferrare la parte superiore del femore con la pinza, tagliare il tessuto molle dalla testa del femore per liberarla dal dell'acetabolo.
  12. Estrarre l'intero osso della gamba, tra cuifemore, ginocchio e tibia, alto e lontano dal corpo, accuratamente tagliando via il tessuto connettivo e muscolare che collega la gamba alla pelle.
  13. Sovraccaricare l'articolazione della caviglia e di nuovo usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia.
  14. Afferrando l'estremità distale della tibia, facendo attenzione a non recidere i tendini, tirare la tibia alto e lontano dal corpo e la lavagna.
  15. Tagliare qualsiasi tessuto connettivo restante fissaggio del osso lungo al mouse al ginocchio.
  16. Rimuovere qualsiasi muscolo supplementare o tessuto connettivo attaccata al femore e la tibia.
  17. Per tutte le applicazioni che richiedono l'osso di mantenere intatte (istologia, istomorfometria, test biomeccanico, ecc.), Procedere con protocolli standard in-house (come nel 4-7). Per isolare il midollo osseo, passare alla sezione 2.

2. Preparazione delle ossa lunghe per isolamento di midollo osseo

  1. Utilizzando le pinze, afferrare il femore con la rotula rivolto verso unND l'estremità prossimale (testa del femore) verso il basso.
  2. Sovraccaricare l'articolazione del ginocchio e usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia e il femore.
  3. Tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il femore e tibia insieme.
  4. Utilizzando le pinze, afferrare il femore con il lato anteriore rivolto verso e l'estremità prossimale (lato testa del femore) verso il basso.
  5. Guida le forbici la diafisi femorale ai condili.
  6. Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili, rotula, e l'epifisi per esporre metafisi.
  7. Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato al femore usando pinze, forbici, e Kimwipes.
  8. Utilizzando le pinze, afferrare la tibia con il lato anteriore rivolto verso e l'estremità distale (fine caviglia) verso il basso.
  9. Se l'epifisi tibiale è intatto, guidare le forbici il pozzo tibia ai condili.
  10. Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili e dell'epifisi per esporre la MetYsis.
  11. Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato alla tibia usando pinze, forbici, e Kimwipes.

Isolamento 3. midollo osseo

  1. Inserire un ago G 18 attraverso il fondo di un tubo di 0,5 ml microcentrifuga.
  2. Posizionare le ossa lunghe (massimo 2 femori e tibie 2) nel tubo, ginocchio-end verso il basso end verso il basso e chiudere il coperchio.
  3. Nest il tubo di 0,5 ml microcentrifuga in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  4. Centrifugare le provette annidati a ≥10,000 xg in una microcentrifuga per 15 sec.
  5. Verificare che il midollo osseo è stata filata su ossa mediante ispezione visiva. Le ossa dovrebbero apparire bianco e ci dovrebbe essere una grande pellet visivo nel tubo più grande.
  6. Scartare il tubo di 0,5 ml microcentrifuga con le ossa.
  7. Sospendere il midollo osseo in soluzione appropriata (ad esempio, PBS, terreni di coltura, di buffer FACS) e procedere con il protocollo sperimentale (DNA, RNA, o isolamento delle proteine,analisi FACS, o colture cellulari primarie).

Risultati

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Il protocollo qui descritto è ottimizzato per una rapida dissezione del femore e della tibia del mouse con un minimo di danni al tessuto osseo. Questa tecnica è adatta per un numero di analisi a valle, compresi gli studi biomeccanica, istomorfometria (Figura 1A - B), e l'istologia (Figura 1C) 4,7. Il histomophometric rappresentante ricostruzione micoCT 3D (Figura 1A - B) dimostra che sia l'osso spongioso e corticale guscio sono mantenuti che consente la precisa quantificazione dei parametri strutturali standardizzate per Istomorfometria ossa, compreso il numero trabecolare, lo spessore e la spaziatura; volume osseo; e lo spessore corticale, tra le altre misure 8. La sezione istologica mostra un rappresentante fissati in formalina e decalcificata tibia H & E macchiato (Figura 1C). L'immagine dimostra l'integrità sia del calcificata buno e del midollo osseo cellulari per l'analisi istologica.

La procedura di midollo osseo isolamento conserva la sterilità dello spazio midollare, ha bassa movimentazione per ridurre la contaminazione, e non richiede il taglio del osso lungo, riducendo così la perdita di resa midollo osseo. Questo midollo osseo è adatta a molte applicazioni a valle, tra cui citometria a flusso 5 e PCR analisi. Inoltre, questa procedura può essere utilizzata per isolare midollo osseo per colture primarie di cellule di midollo osseo, tra osteoclasti e osteoblasti (Figura 2A - B) 4,6.

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Figura 1. istomorfologiche e analisi istologiche di mouse osso lungo. Ricostruzione microCT tridimensionale di una tibia del mouse mostrando (A) il guscio corticale esterno e (B Trong>) dell'osso trabecolare (scala bar = 0,5 mm). (C) istologico H & E macchia di una tibia decalcificata e sezionato (4x). Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d'America. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. primaria midollo osseo coltura cellulare per la differenziazione degli osteoclasti e gli osteoblasti. Colorazione (A) trappola per osteoclasti multinucleate dopo 7 giorni in mezzi osteoclastogenico (4x). (B) La fosfatasi alcalina (colore viola) per osteoblasti e alizarin rosso (colore rosso) della macchia per la mineralizzazione dopo 21 giorni di mezzi osteogenico. Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d'America.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Presentiamo un metodo semplice ed efficiente per la rimozione delle ossa lunghe posteriori del topo e il successivo isolamento del midollo osseo. Questo metodo mantiene l'elevata integrità strutturale e cellulare delle ossa e del midollo osseo e ha un basso tempo di manipolazione, riducendo al minimo la probabilità di fratture indotte dall'utente o di punteggi ossei che possono influenzare le analisi a valle. Inoltre, il metodo di centrifugazione per isolare il midollo osseo non richiede il taglio dell'osso per esporre lo spazio del midollo osseo o il fluido per lavare il midollo osseo, riducendo i potenziali punti di contaminazione. Inoltre, la tecnica della centrifuga ha una produttività relativamente elevata con un tempo di utilizzo inferiore rispetto ad altri metodi, riducendo così i tempi di lavorazione.

L'elevata variazione è inerente agli studi sui topi in vivo a causa dell'elevata variazione fenotipica da topo a topo. Al fine di massimizzare l'impatto della ricerca di studi sui topi costosi e laboriosi, è fondamentale ridurre al minimo l'errore tecnico sperimentale9,10. Il tempo che intercorre tra il sacrificio animale e l'analisi a valle o la fissazione dei tessuti introduce variazioni sperimentali che possono superare sottili cambiamenti e ridurre grandi differenze tra i gruppi. Pertanto, l'elaborazione rapida dei campioni è essenziale per un'analisi accurata dei dati. Le tecniche di dissezione delle ossa lunghe e di isolamento del midollo osseo qui descritte sono ottimizzate per l'elaborazione rapida di animali e campioni per ridurre le variazioni tecniche.

Questo protocollo può essere ampiamente applicato a molti campi di ricerca, tra cui l'indagine del tessuto osseo stesso o l'interrogazione delle cellule del midollo osseo. Inoltre, questo approccio diretto alla dissezione delle ossa lunghe consentirà ai ricercatori in campi correlati di interrogare direttamente i contributi ossei al fine di espandere la nostra conoscenza della disfunzione del midollo osseo in patologie altrimenti poco studiate.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NCI n. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K.J.P. Gli autori ringraziano i membri attuali e passati del laboratorio Weilbaecher, in particolare Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla e Hongju Deng, e i membri del Brady Urological Institute, in particolare i membri del laboratorio Pienta per la lettura critica del manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Spille per bacheca
70% forbici per dissezione etanolo
 
Pinza
KimwipesKimberly-Clark34120
da 16 G
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml Provetta
microcentrifuga da 0,5 ml
Microcentrifuga
per dissezioneAgo per

Riferimenti

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