Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani e produce livelli di peptide superiori e consente la valutazione della forma molecolare corretta. Pertanto, questo metodo sarà uno strumento prezioso nella ricerca del peptide.
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Articolo metodologico
Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Questo spesso include la misurazione dei peptidi che regolano l'assunzione di cibo. Per la corretta determinazione della concentrazione di un peptide, dovrebbe essere stabile durante il trattamento del sangue. Tuttavia, questo non è il caso di diversi peptidi che vengono rapidamente degradati da peptidasi endogene. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di trattamento del sangue che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution (RAPID) per l'utilizzo nei ratti. Qui, abbiamo stabilito questa tecnica per l'uso nell'uomo e indagato recupero, forma molecolare e circolanti concentrazione di cibo ormoni regolatori. Il metodo RAPID ha migliorato significativamente il recupero per 125 I-marcato somatostatina-28 (+ 39%), glucagone-like peptide-1 (+ 35%), acile grelina e glucagone (+ 32%), l'insulina e kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), la leptina(+ 21%) e peptide YY 3-36 (+ 19%) rispetto al trattamento standard (sangue EDTA su ghiaccio, p <0.001). cromatografia liquida ad alte prestazioni ha mostrato l'eluizione di endogena grelina acile nella posizione prevista dopo l'elaborazione RAPID, mentre dopo il trattamento standard di 62% di acil grelina sono stati degradato con conseguente un picco precedente probabile che rappresenta desacyl grelina. Dopo l'elaborazione del rapporto RAPID grelina acil / desacyl nel sangue di soggetti normali di peso è stato di 1: 3 rispetto al 01:23 dopo trattamento standard (p = 0,03). Anche i livelli endogeni Kisspeptin erano più alti dopo RAPID rispetto al trattamento standard (+ 99%, p = 0,02). Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani, produce peptide superiori e permette di valutare la forma molecolare corretta.
Introduzione
Alla luce della crescente diffusione in tutto il mondo di obesità 1,2, la ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Mentre finora solo un peptide noto che perifericamente prodotta e azione centrale per stimolare l'assunzione di cibo, cioè grelina 3, negli ultimi decenni, una vasta gamma di peptidi è stato identificato che riducono l'assunzione di cibo, ad es. leptina, peptide YY (PYY) ed anche glucagone-like peptide-1 (GLP-1) e insulina 4, Pertanto, negli studi in meccanismi regolatori di livelli di fame e sazietà peptidici sono spesso valutata e, allo stesso tempo, si....
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Protocollo
Il protocollo è stato approvato dal comitato etico locale per la ricerca umana (numero di protocollo EA1 / 114/10).
Processing 1. Sangue
- Raccogliere il sangue venoso 7:00-08:00 al mattino a digiuno da una vena e il processo avambraccio in base alla procedura standard o il metodo rapido. Istruire i soggetti di non esercitare o di fumo prima di prelievo di sangue.
- Per l'elaborazione di serie, raccogliere il sangue in provette EDTA contenenti refrigerati e centrifugare entro 10 min a 3.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore lavorazione con metodo radioimmunologico.
- Per l&....
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Risultati
Trattamento del sangue RAPID aumenta il rendimento di 125 peptidi I-radiomarcato nel sangue umano rispetto al trattamento del sangue standard.
Dopo il trattamento del sangue standard (sangue EDTA su ghiaccio), il recupero dei peptidi radiomarcati era ~ 60% in 9/9 peptidi (che vanno dal 48-68%, Figura 1A - K). Trattamento rapido migliore la resa in tutte le 125 peptidi I-etichettati, vale a dire la somatostatina-28 (+ 39%,
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Discussione
Abbiamo segnalato in precedenza che il metodo rapido per il trattamento del sangue migliorato il recupero per 11/12 peptidi rispetto al trattamento del sangue standard per ratti 6. Nel presente studio abbiamo dimostrato che questo metodo è anche adatto per l'uso nell'uomo. Dopo l'elaborazione RAPID, il recupero per 9 di 9 125 peptidi marcati I-testato è stato migliorato rispetto al trattamento del sangue standard (EDTA di sangue sul ghiaccio). Il miglioramento osservato variava 19-39% c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca STE 1765 / 3-1 (AS) e Ministero tedesco dell'Istruzione e della ricerca 03IPT614A (CG). Ringraziamo Reinhard Lommel e Petra Buße per la loro eccellente supporto tecnico, così come Karin Johansson e Christina Hentzschel aiuto per l'organizzazione e l'esecuzione di misure antropometriche
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-V | |
| Antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| Leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| Chimostatina | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartucce | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 &; m |
| Acil-grelina | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Milliporo |
| GLP-1 | radioattivo, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Milliporo di |
| glucagone | , Billerica, MA, USA | 9030 | Milliporo di |
| insulina | , Billerica, MA, USA | 9011S | Milliporo di |
| leptina | , Billerica, MA, USA | 9081-HK | |
| Kisspeptin-10 | radioattivo Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals radioattivo, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioattivo |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | radioattivo |
| Somatostatina-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, Stati Uniti | T-060-16 | radioattivo |
| Colonna ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2,1 mm x 50 mm, 1,8 & micro; m |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, diversi componenti, quindi nessun unico numero di catalogo | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | grelina totale radioattiva |
| RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | radioattivo |
| Grelina attiva RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioattivo |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | download |
Riferimenti
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P.
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Ristampe e permessi
