Glycan Nodo Analisi: un approccio bottom-up per Glycomics

Sommario

Questo articolo presenta una forma migliorata di una nuova tecnica di glicomica bottom-up progettata per analizzare il profilo composizionale aggregato dei glicani in biofluidi non frazionati attraverso la scomposizione chimica dei glicani nei loro monosaccaridi specifici per il linkage costituente per il rilevamento mediante GC-MS. Le potenziali applicazioni includono la diagnosi precoce del cancro e di altri disturbi affettivi dei glicani.

Abstract

Sintetizzati in un processo non guidato da schemi da enzimi chiamati glicosiltransferasi, i glicani sono attori chiave in vari eventi intra ed extracellulari significativi. Molte condizioni patologiche, in particolare il cancro, influenzano l'espressione genica, che a sua volta può deregolare l'abbondanza relativa e i livelli di attività degli enzimi glicoside idrolasi e glicosiltransferasi. I glicani interi aberranti unici derivanti dalla glicosiltransferasi deregolata sono spesso presenti in tracce all'interno di biofluidi complessi, rendendo il loro rilevamento difficile e talvolta stocastico. Tuttavia, con un'adeguata preparazione del campione, una delle più antiche forme di spettrometria di massa (gascromatografia-spettrometria di massa, GC-MS) è in grado di rilevare di routine la raccolta di monosaccaridi specifici per punti di ramificazione e linkage ("linfonodi glicani") presenti in biofluidi complessi. Complementare alle tradizionali tecniche di glicomica top-down, l'approccio qui discusso prevede la raccolta e la condensazione di ciascun nodo di glicano costituente in un campione in un singolo segnale analitico indipendente, che fornisce informazioni strutturali e quantitative dettagliate sui cambiamenti del glicoma nel suo complesso e rivela glicosiltransferasi potenzialmente deregolate. I miglioramenti apportati alla permetilazione e alle successive fasi di estrazione liquido/liquido qui forniti migliorano la riproducibilità e la resa complessiva facilitando l'esposizione minima dei glicani permetilati a condizioni acquose alcaline. Le modifiche alla fase di acetilazione aumentano ulteriormente l'entità della reazione e la resa complessiva. Nonostante la loro riproducibilità, le rese complessive di acetati di alditolo parzialmente permetilati (PMAA) di N-acetilesasomina (HexNAc) hanno dimostrato di essere intrinsecamente inferiori al loro valore teorico atteso rispetto alle PMAA esose. Il calcolo del rapporto tra l'area sotto il cromatogramma ionico estratto (XIC) per ogni singolo esoso PMAA (o HexNAc PMAA) e la somma di tali aree XIC per tutti gli esosi (o HexNAc) fornisce un nuovo metodo di normalizzazione che facilita la quantificazione relativa dei singoli nodi di glicano in un campione. Sebbene attualmente limitato in termini di limiti assoluti di rilevazione, questo metodo accelera l'analisi dei biofluidi clinici e mostra notevoli promesse come approccio complementare ai tradizionali glifumetti top-down.

Introduzione

Glicolipidi, glicoproteine, proteoglicani, glicosaminoglicani e costituiscono i quattro classi principali di complessi carboidrati eterogenee noti collettivamente come glicani. Come componenti onnipresenti e integrali della membrana plasmatica, glicocalice, e la matrice extracellulare e fluidi, glicani partecipano in questi diversi processi biochimici come l'endocitosi, traffico intracellulare, motilità cellulare, trasduzione del segnale, riconoscimento molecolare, l'attivazione del recettore, adesione cellulare, l'interazione ospite-patogeno , intercellulare comunicazione, immunosorveglianza, e l'iniziazione risposta immunitaria. ¹ Presente in quasi tutti i campi della vita, enzimi noti come glicosiltransferasi che costruiscono i polimeri glycan agire in tandem con glicosidasi (noto anche come glicosidasi, che abbattere glicani) per la costruzione, ristrutturazione, e infine produrre polimeri finalizzato glycan ^2. Anche se ogni glycosyltransferase può operare su diversi glicoconiugati, un glycosyltransferasegeneralmente forgia una sul sollevatore e anomero specifico legame glicosidico trasferendo la frazione monosaccaride di un particolare nucleotide attivato zucchero donatore (ad esempio, il PIL-fucose) per una determinata categoria di accettori nucleofili (ad esempio, un lipide, polipeptide, acidi nucleici, o la coltivazione oligosaccaride). È stato stimato che più del 50% di proteine ​​(specie di membrana e proteine ​​secretorie) sono post-traduzionali modificato glicosilazione ³ calcoli combinatori rudimentali prevedono un apprezzamento per la notevole variabilità, versatilità, e specificità riconosciuta alle glicoproteine ​​di glicosilazione.; per esempio, se un substrato polipeptide ha solo 10 siti di glicosilazione e ogni sito può formare un legame glicosidico con 1 di soli 3 diversi monosaccaridi estremità riducenti, teoricamente, la glicoproteina finale può assumere 3 ¹⁰ = 59.049 identità distinte. In glicoproteine, legami glicosidici comunemente formano con la catena laterale di azoto oresidui f asparagina nella sequenza Asn-X-Ser / Thr (X può essere qualsiasi aminoacido prolina tranne) per produrre N -glycans ² e della catena laterale idrossili di residui di serina e treonina per produrre O -glycans ^4. La composizione di glycome di una cellula (ad esempio, il suo complemento dei prodotti di glicosilazione) è unico e limitato perché, con poche eccezioni, glicosiltransferasi mostrano donatore rigorosa, accettore, e il collegamento specificità. ⁵ glicoproteine ​​importanti e abbondanti plasma sanguigno soffrono glicosilazione aberrante come conseguenza a valle di espressione glycosyltransferase anormale e l'attività a causa di molte condizioni patologiche, in particolare il cancro e le malattie infiammatorie. ^6-24

Principalmente a causa di fattori epigenetici, il glycome è significativamente più diversificata, dinamica e complessa di quella del proteoma e del trascrittoma. ^25,26 Mentre circa l'1% del genoma dei mammiferi codifica la formazione, la modifica emontaggio di glicani, ²⁷ procede di glicosilazione in un non-template-driven modo, un contrasto marcato per polipeptide e la biosintesi degli acidi nucleici. L'interazione tra la quantità relativa e l'attività degli enzimi di glicosilazione e fattori ambientali come la disponibilità di nutrienti e precursore in ultima analisi, determina la natura, la frequenza e l'estensione di glicosilazione. ^5,28 Embriogenesi (ad esempio, la determinazione e la differenziazione), attivazione cellulare, e la progressione attraverso l'espressione genica influenza ciclo cellulare (cioè, trascrizione e traduzione) e modificare l'identità e la quantità di glicosiltrasferasi disponibili, la cui attività è il determinante monte immediata del profilo glycan della cellula. Perché (alcuni dei) del proliferativa, adesivi, e le proprietà invasive di cellule cancerose sono simili a quelle delle cellule embrioniche ordinarie, modifiche del vie biosintetiche glycan (ad esempio, l'accumulo di precursore, espressione deregolamentato, aberrant modifica, troncamento strutturale, o la formazione di romanzo) servono biomarcatori tumorali come universali che indicano varie fasi di formazione del tumore, la progressione, la migrazione e l'invasione ²⁹ Anche se la glicosilazione è molto complesso, evidentemente, solo poche alterazioni glicosilazione possono abilitare la carcinogenesi e metastasi.; a quanto pare, alcuni prodotti di glicosilazione "aberranti" infatti beneficiare cellule cancerose, consentendo loro di eludere il riconoscimento immunitario e sopravvivere alle esigenze di migrazione in ambienti intravascolari e metastatici inospitali. ^28,30,31 Non sorprendentemente, gli esperimenti hanno rivelato che interrompere o prevenire modelli di alterata l'espressione genica e la formazione glycan aberranti possono fermare tumorigenesi. ²⁹ Tuttavia, i glicani aberranti rilevati in un campione BIOFLUID (ad esempio, urina, saliva, e plasma sanguigno o siero) non possono essere indicatori diretti di cancro (o un'altra malattia), ma piuttosto a valle esiti di sottile ma significativocambiamenti nel sistema immunitario o ramificazioni quantificabili di una condizione perniciosa in un organo imprevedibile. ³²

Anche se forniscono informazioni circa l'universale glycome, molti molecolari glicomica interazione basati su tecniche (ad esempio, lectina / array di anticorpi e metabolico / etichettatura covalente) dipenderà l'individuazione di strutture intere glycan e non forniscono informazioni strutturali dettagliate sui singoli glicani. In netto contrasto, la spettrometria di massa (MS) può aiutare a identificare e quantificare singole strutture glycan e rivelare tali informazioni strutturali come i siti di attacco per core polipeptide. dell'espressione o dell'attività di un solo glicosiltrasferasi deregolamentato possono iniziare una cascata di eventi molecolari dannosi in molteplici vie glicosilazione. Poiché ogni glycosyltransferase può operare su più di un substrato glicoconiugati e tra i diversi polimeri glycan crescita, cascate biosintetici liberalizzati resa disproporzionale maggiore quantità di un solo prodotto glicani ma diverse classi eterogenee di glicani aberranti nei fluidi intra o extracellulare. ³³ Tuttavia, tali glicani aberranti unici sono a volte considerati poco pratico come biomarcatori per il cancro o altre patologie glycan-affettiva perché, rispetto alla grande piscina di glicani ben regolamentata, questi glicani aberranti rappresentano una frazione molto piccola che possono spesso rimangono rilevabili anche da tecniche come altamente sensibili come la spettrometria di massa. Ad esempio, nei fluidi corporei intra ed extracellulari, l'ampio spettro proteina-concentrazione (che attraversa otto ordini di grandezza) può impedire il rilevamento di glicoproteine ​​scarse mascherati dalle specie più abbondanti. ³² Inoltre, la determinazione dell'attività glycosyltransferase rimane una notevole pratica e la sfida teorica perché molti glicosiltransferasi sono assenti in biofluidi clinici o diventare inattivo ex vivo. Nonostante la difficoltà di consistently rilevare e quantificare le quantità ultra-minuti di glicani tutto unico, praticanti di spettrometria di massa hanno fatto enormi passi avanti verso l'impiego glicani intatti come marcatori clinici. Abbiamo recentemente sviluppato un approccio complementare all'analisi dei glicani intatte che, impiegando GC-MS, facilita il rilevamento di tutti branch-point costituente e monosaccaridi specifici di collegamento ( "nodi glicani") che insieme conferiscono unicità ad ogni glicani e in molti casi servono direttamente surrogati come molecolari che quantificano l'attività relativa del glycosyltransferase colposo (s).

Fin dalla sua prima applicazione diretta riferito all'analisi glicani nel 1958, gascromatografia (GC) ha dimostrato una tecnica potente per l'analisi per-metilato mono e disaccaridi, ³⁴ determinare la loro anomericity e configurazione assoluta, e separarli per la successiva analisi di spettrometria di massa. ³⁵ tra il 1984 e il 2007, Ciucanu e colleghiintrodotto e affinato una tecnica glycan permethylation in fase solida che ha impiegato idrossido di sodio e iodometano, seguita da estrazione liquido / liquido di glicani permethylated con acqua e cloroformio. ^35,36 Tra il 2005 e il 2008, Kang e collaboratori integrati un risparmio di tempo di rotazione approccio -column nella fase permethylation. ^37,38 nel 2008, il gruppo di ricerca Goetz messo a punto un solido-fase quantitativa permethylation metodo glycan-profiling usando matrix-assisted laser desorbimento-ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa per confrontare e distinguere invasiva e non potenzialmente non invasiva delle cellule del cancro al seno; ³⁹ poi, nel 2009, il team di Goetz combinato enzimatica e tecniche di rilascio di sostanze chimiche per fendere O -glycans da glicoproteine ​​intatte in uno schema permethylation in fase solida altamente alcalini ⁴⁰ Anche se la procedura di Goetz facilitato permethylation simultanea e rilascio di sostanze chimiche. di -glycans O, è stato applicato solo alle pre-isolata glicoproteine. Abbiamo modificato questa tecnica nel 2013 e adattato per intere biofluidi non frazionate e campioni di tessuto omogeneizzati incorporando acido trifluoroacetico (TFA) idrolisi, riduzione e acetilazione passi. ³³ Questi passaggi aggiuntivi anche rilasciare glicani da glicolipidi e N -linked glicani da glicoproteine ​​e convertire li in acetati parzialmente metilati alditolo (PMAAs, Figura 1), il cui pattern di metilazione-and-acetilazione distintivo facilitare l'analisi mediante GC-MS e unicamente caratterizzare i nodi glicani costituenti in originale intatta polimero glicani ⁴¹ (Figura 2). ³³ in definitiva, questo procedura produce un ritratto composito di tutti i glicani in un complesso a base di BIOFLUID diretta, quantificazione relativa di caratteristiche uniche come glycan "fucosilazione core", "6-sialylation", "bisettrice GlcNAc", e "beta 1-6 ramificazione" - ogni deriva da un unico chromatograp GC-MSpicco hic. Questo articolo presenta un'ulteriore ottimizzazione della permethylation, acetilazione, l'isolamento, e le fasi di pulizia insieme con il miglioramento della modalità di quantificazione relativa.

Protocollo

Attenzione: evitare il contatto della pelle / degli occhi con uno qualsiasi dei reagenti utilizzati in questo esperimento. Al momento dell'esposizione, sciacquare a fondo l'area interessata con acqua e consultare un medico immediato.

1. Permethylation e Glycan Estrazione

1. Preparazione colonna
   1. Ottenere un numero di unità di colonne microcentrifuga rotazione come i campioni da analizzare. Rompere e staccare i tappi tubo serbatoio in plastica. Mettere un filtro microcentrifuga mini in ogni tubo serbatoio. Posizionare le colonne di spin microcentrifuga assemblati (che contengono i mini filtri) in un rack provetta per microcentrifuga.
   2. Ottenere uno stock di idrossido di sodio (NaOH) perline (20-40 mesh). Trasferimento alcuni NaOH ad una piccola barca di peso o, se l'umidità sta causando aggregazione, un mortaio di porcellana caldo come lo stock di lavoro di NaOH. Evitare l'uso di ciuffi di perline NaOH NaOH o schiacciati / polvere.
      Attenzione: NaOH è un potente tossina e base corrosivo. Lavare la pelle / occhi esposti con acqua per 15 minuti. ThorougHLY pulire il banco di lavoro dopo aver completato l'esperimento.
   3. Utilizzando un piccolo scoop o una spatola, trasferire perline NaOH dal magazzino al lavoro per riempire le mini filtri microcentrifuga con NaOH fino al primo smusso esterno (~ 5 mm sotto il bordo). Toccare i filtri microcentrifuga pieni sul banco per il confezionamento / condensare le perline NaOH.
      Nota: In questo esperimento, per minimizzare eccessivo assorbimento dell'acqua da perline NaOH igroscopici, mantenere il livello di tutti i liquidi aggiunti (ad esempio, acetonitrile, dimetilsolfossido, soluzione analita) sopra la superficie del riempimento della colonna NaOH e limitare il contatto diretto con l'aria.
   4. Ottenere uno stock di acetonitrile (ACN). Trasferire ~ 350 microlitri ACN per ogni mini filtro microcentrifuga NaOH ricco. Mantenere il NaOH sommerso sotto ACN e rimuovere grosse bolle d'aria mescolando con un gel-carico punta della pipetta punta arricciata.
      Attenzione: Acetonitrile è un irritante infiammabile.
   5. centrifugazione colonna
      1. Disporre le colonne microcentrifuga simmetricamente all'interno di una centrifuga; utilizzare un tubo di bilanciamento, se necessario. Evitare di versare i granuli NaOH all'interno della centrifuga. Chiudere il coperchio della centrifuga.
      2. Centrifuga le colonne (contenente NaOH e ACN) per ~ 15 sec a 2.400 × g.
      3. Al termine della centrifugazione, rimuovere colonne microcentrifuga dalla centrifuga, e scartare l'ACN in un contenitore per rifiuti pericolosi. Mantenere la colonna NaOH imballaggio intatto.
   6. Aggiungere ~ 350 microlitri dimetilsolfossido (DMSO) per ogni mini filtro microcentrifuga NaOH ricco. Mantenere il NaOH sommerso sotto DMSO e rimuovere eventuali grosse bolle d'aria con un puntale. Come descritto in precedenza, le colonne centrifugare per ~ 15 sec a 2.400 × g, ed eliminare il DMSO mantenendo il NaOH imballaggio intatto.
      Attenzione: DMSO è un agente mutageno e irritanti ed è facilmente assorbito attraverso la pelle.
   7. Collegare tutti i mini filtri microcentrifuga con i tappi inclusi nel filtro rotativokit. Trasferire ~ 350 ml di DMSO a ogni mini filtro microcentrifuga NaOH ricco e utilizzare una punta della pipetta 200 ml per eliminare le bolle d'aria nella confezione NaOH in modo che DMSO raggiunga tutte le regioni entro allora imballaggio NaOH. Evitare di schiacciare o eccessivamente raschiando le perle NaOH; NaOH in polvere è indesiderabile. Finire questo passaggio il più rapidamente possibile.
2. Preparazione di Controllo Qualità del plasma (QC) del campione (s)
   Nota: Per assicurare risultati coerenti in lotti sperimentali, considerare l'utilizzo di almeno una aliquota di un campione prelevato da una grande raccolta, omogenea massa del materiale biologico che interessa da analizzare in ciascun lotto. Ad esempio, se l'analisi plasma sanguigno, utilizzare aliquota (s) di una collezione massa di plasma sanguigno come campione QC (s) in ciascun lotto. campioni Processo QC nello stesso modo dei campioni sconosciuti.
   1. Centrifuga uno stock campione di QC plasma per 4 min a ~ 10.000 × g. Durante la centrifugazione, alcuni precipitato ad alta densità può comporre a the inferiore e qualche precipitato bassa densità possono galleggiare all'inizio del plasma. Evitare sia durante la rimozione aliquota (s) di plasma.
   2. Passare a "1.3) Preparazione del campione" di seguito. Poi, tornare a questo passo dopo centrifugazione il plasma è completa.
   3. Prelievo 9 ml di plasma, QC, centrifugato e trasferirlo ad una provetta da 1,5 ml in polipropilene opportunamente etichettati dotato di un tappo di chiusura a scatto (qui di seguito denominata "provetta di plastica da 1,5 ml"). Aggiungere 1 ml di acqua deionizzata per ogni aliquota; se desiderato, utilizzare questo come un vettore per standard interno (s).
   4. Aggiungere 270 ml di DMSO a questo controllo del plasma. Vortex per garantire la completa dissoluzione.
3. Preparazione del campione
   1. Ottenere come molti provette di plastica da 1,5 ml come il numero di campioni (analita) biologici.
   2. Trasferimento 9 microlitri di ciascun campione biologico (analita) nella provetta di plastica da 1,5 ml corrispondente. Trasferire 1 ml di acqua deionizzata e 270 ml DMSO ad ogni provetta.
   3. Mescolare energicamente (ad esempio, vortex e / o più volte pipetta su e giù) i campioni per garantire la completa dissoluzione in DMSO.
      Attenzione: Effettuare le seguenti operazioni all'interno di una cappa aspirante. Usato nelle seguenti fasi, iodomethane (CH ₃ I), diclorometano (CH ₂ Cl _2, alias cloruro di metilene), e cloroformio (CHCl _3, triclorometano), sono liquidi volatili in grado di sciogliere alcuni tipi di plastica (ad esempio, guanti di nitrile) . Assicurarsi di utilizzare guanti resistenti ai solventi. A causa della loro bassa viscosità e ad alta tensione di vapore, questi reagenti può gocciolare da un puntale durante il trasferimento. Ridurre al minimo la perdita di reagente e potenziale esposizione tenendo la soluzione di riserva adiacente alla nave ricevente.
   4. Trasferire un volume totale sufficiente di iodomethane ad una piccola provetta pulita. Ogni campione analita richiederà 105 iodomethane ml. Trasferimento ~ 500 microlitri diclorometano in anothER provetta pulita. Per evitare che la siringa intasamento, lavare la siringa con diclorometano subito dopo il trasferimento iodomethane.
      Attenzione: Iodometano è fotosensibile, volatile, e potente tossina in grado di danneggiare il sistema nervoso centrale o causare la morte se inalato o ingerito. Diclorometano è un potenziale cancerogeno, mutageno riproduttiva e potente irritante in grado di danneggiare diversi organi o causare la morte.
   5. Utilizzare una siringa per analitica di aggiungere 105 microlitri iodomethane ad ogni campione da analizzare. tubi analiti Cap immediatamente per ridurre al minimo l'evaporazione iodomethane. Completamente vortice e, se necessario, centrifugare brevemente tutti i campioni per assicurare che rimanga liquido nel cappuccio. Qualsiasi cambiamento di colore (ad esempio, al marrone, viola o giallo) segnala il degrado iodometano, che possono mettere in pericolo la seguente reazione permethylation.
   6. Sciacquare la siringa analitico utilizzato per trasferire iodomethane con diclorometano almeno 3 volte. Questo gli impedirà from intasamento. Smaltire questo risciacquo, insieme a iodomethane supplementare e diclorometano in un vaso di rifiuti pericolosi organici. Posizionare provette utilizzate in un contenitore per rifiuti pericolosi.
   7. Ottenere una nuova serie di tubi di serbatoio in plastica da 2 ml. Rimuovi snap-caps se lo si desidera.
   8. Staccare i filtri microcentrifuga mini. Centrifuga le colonne scollegato per 15 sec a 2.400 × g, e poi scarta i tubi del serbatoio con l'effluente DMSO.
   9. Re-inserire le colonne di spin centrifugati, e metterli dentro i nuovi tubi serbatoio. Numero Ciascuna colonna e il suo tubo serbatoio corrispondente con lo stesso numero del campione. Assicurarsi che i mini spine di filtro sono stretti; perdita potenziale può avere un impatto il passo successivo. Minimizzare il tempo tra la rimozione DMSO dalle colonne di rotazione e di trasferimento dei campioni analiti sulle colonne di rotazione.
   10. Permethylation
       1. Trasferire quantitativamente ogni soluzione campione al suo corrispondente NaOH-bead-riempita microcentrifuga rotazione colonna. Utilizzare una punta della pipetta 1000 microlitri per questo passo. Dopo il trasferimento, crimp ~ 2 mm l'estremità di una punta 200 microlitri e lasciare nei contenuti della colonna da utilizzare come agitatore. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
          Nota: La bassa viscosità di iodomethane può causare la perdita di esempio perché la soluzione analita può gocciolare dalla punta della pipetta durante il trasferimento. Tenere il tubo campione e la colonna di spin adiacente all'altro con una mano, e trasferire rapidamente la soluzione campione con l'altra mano.
       2. Lasciare che la reazione permethylation di procedere per 11 min. Mescolare ogni campione almeno 4-5 volte durante questo periodo. Per facilitare permethylation efficiente, che si verifica in corrispondenza della superficie di perline NaOH, utilizzare punte gel-loading pipette tip-crimpato come agitatori per miscelare delicatamente il contenuto della colonna. miscelazione aggressivo può forare il filtro rotativo, polverizzare e sospendere perline NaOH (che può ridurre l'efficacia di successivi / estrazione liquido-liquido), e / o causare la perdita del campione (come sample intriso di granuli NaOH possono traboccare dalla colonna).
       3. In preparazione per la successiva fase di estrazione liquido / liquido, preparare una quantità sufficiente di M cloruro di sodio (NaCl) soluzione 0,5 in un tampone fosfato 0,2 M di sodio (pH 7,0), per essere conservati a temperatura ambiente. Ogni campione richiede un totale di ~ 12 ml di soluzione NaCl per tutti e tre cicli di estrazione liquido / liquido.
       4. Al termine del periodo permethylation 11-min, subito ancora scollegare attentamente le colonne e centrifugare per 15 secondi a 2400 × g. Eliminare le spine.
   11. Rimuovere immediatamente le colonne di spin dalla centrifuga e metterli in una nuova serie di tubi di spin serbatoio vuoto, lasciando la soluzione a flusso continuo contenente glicani appena permethylated dietro. Non gettare nulla.
   12. Non appena possibile, aggiungere 300 ml acetonitrile (ACN) per i secchi, i filtri di spin NaOH-riempite. Centrifugare i filtri di rotazione per 30 sec a 9.600 × g.
   13. immediately successivamente, trasferire la soluzione permethylation principale (cioè, la soluzione che è stato incubato con le perline NaOH per 11 min quindi filata attraverso il filtro rotativo in un tubo da centrifuga prima dell'aggiunta di 300 ml di ACN nel passaggio precedente) per silanizzato 13 x provette di vetro 100 mm ⁴² contenente 3,5 ml di 0,2 M tampone di fosfato di sodio contenente 0,5 M NaCl, pH 7.0 e mescolare (vortex) immediatamente. Evitare il trasferimento di qualsiasi residuo solido bianco durante questa fase. Fate questo per ogni campione prima di procedere alla fase successiva.
   14. Senza ritardo, trasferimento (combinare) ACN spin attraverso ciascun tubo serbatoio per (con) il resto del campione liquido nella rispettiva tubo di vetro silanizzato e miscelare (vortex) immediatamente. Anche in questo caso, evitare di trasferire qualsiasi residuo solido bianco durante questa fase. Cap, scossa, e vortex il tubo di vetro. Ripetere l'operazione per ogni campione. Eliminare le colonne NaOH e pipette Pasteur in appositi contenitori per rifiuti.
4. Liquido / liquido Extraction e Glycan Purificazione
   1. All'interno della cappa, aggiungere 1,2 ml di cloroformio per ogni campione. Subito dopo, tappare i tubi di vetro silanizzato e vigorosamente mescolare il contenuto.
   2. Pre-calore blocchi di metallo a circa 75 ° C in un collettore di evaporazione. Utilizzare blocchi di riscaldamento con i pozzi che possono ospitare i 13 mm × 100 mm tubi di vetro.
   3. Ottenere una nuova serie di pipette silanizzati Pasteur, pipette Pasteur non silanizzati, e provette di vetro silanizzata con tappi.
      Attenzione: Cloroformio (CHCl ₃₎ è un irritante, mutageno, cancerogeno e potenziale in grado di permeare attraverso alcuni tipi di guanti.
   4. Centrifugare brevemente (~ 3.000 × g) tubi di vetro contenenti campioni per separare gli strati acquosi e organici.
   5. Utilizzare una pipetta Pasteur silanizzata non per estrarre sufficiente dello strato acquoso superiore tale che ~ 3 mm di strato acquoso rimane sopra lo strato organico inferiore.
   6. Aggiungere 3,5 ml di 0,5 M Nasoluzione Cl in tampone fosfato 0,2 M di sodio (pH 7) a ciascuna provetta di vetro, vigorosamente mescolare e centrifugare brevemente (~ 3000 × g). Come nel passaggio precedente (1.4.3), utilizzare una pipetta Pasteur silanizzata non per estrarre lo strato acquoso.
   7. Ripetere il passaggio precedente (1.4.4), ma lasciare ~ 1 ml di strato acquoso.
   8. Utilizzare un pulito silanizzata pipetta Pasteur per trasferire lo strato organico ad una provetta di vetro silanizzata mm pulita e adeguatamente etichettati 13 × 100. Evitare la contaminazione acquosa estraendo nel modo seguente:
      1. Tenere entrambe le provette di vetro silanizzato attuali e nuovi adiacenti gli uni agli altri in una mano. Con l'altra mano, premere il bulbo della pipetta per creare bolle durante l'inserimento della pipetta giù attraverso lo strato acquoso.
      2. Una volta dentro lo strato organico, fermare la creazione di bolle, e tenere la lampadina pipetta costante per consentire gli strati organici e acquosi per stabilizzare e separare di nuovo. Poi, lentamente, rilasciare il bulbo di ritirare la maggior quantità di organic livello possibile, senza alcuna contaminazione acquosa.
      3. Rapidamente sollevare la punta della pipetta attraverso lo strato acquoso, e resistere alla riflesso naturale del rilasciando leggermente la lampadina (che si traduce in ritiro qualche contaminazione acquosa), aumentando nel contempo la pipetta dal tubo.
      4. Rapidamente trasferire lo strato organico a bassa viscosità per il nuovo tubo adiacente. Qualsiasi contaminazione acquosa sarà visibile come piccole gocce di liquido sulla parte superiore dello strato organico estratto in nuove provette di vetro. Se acquosa / contaminazione NaCl è visibile, rimuoverla con una pipetta; centrifugare, se necessario, di mettere in comune le goccioline acquose in una singola goccia.
   9. Smaltire di tubi vecchio vetro, pipette e aromatiche e soluzioni rifiuti organici. Lavare e riciclare tappi tubo di vetro.
   10. Essiccare tutti i campioni sotto un flusso delicato e costante di azoto in un collettore di evaporazione preriscaldato a 75 ° C per 5 min ~ all'interno di una cappa aspirante. Per garantire un raffreddamento per evaporazione durante tutte ste secca-downps, un flusso delicato e costante dell'azoto deve disturbare la superficie del liquido senza spruzzi o schizzi liquido. Rimuovere campioni dal collettore di evaporazione sulla completa asciugatura del campione finale. macchie bianche sul fondo di un tubo di vetro secchi indicano tampone / contaminazione NaCl.
   11. Pausa la procedura qui se non c'è abbastanza tempo rimanente nel corso della giornata per completare il passaggio di idrolisi TFA. Temporaneamente (vale a dire, durante la notte) conservare i campioni a secco a -20 ° C. Per continuare la procedura dopo il magazzinaggio, rimuovere i campioni dal congelatore a -20 ° C e consentire loro di riscaldare completamente prima di togliere il cappuccio.
   12. Mentre i campioni calda, in preparazione per l'acido trifluoroacetico (TFA) idrolisi (fase successiva), impostare il mantello riscaldante tale che la temperatura del contenuto provetta liquidi raggiungerà 121 ° C. Preparare la soluzione TFA TFA da magazzino (vedi punto 2.1 qui di seguito).

2. trifluoroacetico Acid (TFA) idrolisi

Attenzione: L'acido trifluoroacetico (TFA) è un acido organico corrosivo e irritante tossico.

1. Preparare una quantità sufficiente di una soluzione 2,0 M TFA in acqua deionizzata. Ogni campione analita richiederà 325 ml di 2,0 M soluzione di TFA. Concentrato TFA è 13,0 M.
2. Aggiungere 325 ml di 2,0 M TFA per ogni campione da analizzare. Per evitare TFA evaporazione e la perdita del campione durante la successiva fase di essiccazione (2.3), strettamente tappare ogni provetta immediatamente dopo l'aggiunta di TFA. Segnare il livello della soluzione in tutti i tubi di vetro. Agitare ogni campione accuratamente prima del passaggio successivo.
3. Incubare le provette per campioni ben chiusi per 2 ore in un opportuno blocco di riscaldamento pre-riscaldata o forno tale che il contenuto raggiungono una temperatura di 121 ° C. Se si utilizza un blocco riscaldante invece di un forno, provette per campioni coprire con un foglio di alluminio per evitare la condensazione di TFA nella parte superiore del tubo e parziale essiccazione di residui di campione sul fondo della provetta. Controllare i livelli di soluzione del campione dopo 20-30 minuti.al fine di garantire il minimo l'evaporazione TFA. Se necessario, stringere i tappi più o sostituire le protezioni per una vestibilità più stretta.
4. Durante la 2-hr attesa, impostare un altro collettore evaporazione a 75 ° C per la fase successiva (vedi 2.4).
5. Al termine del periodo di riscaldamento di 2 ore è, campioni completi secco a 75 ° C sotto una leggera corrente di azoto per ~ 15 min. Non lasciare incustoditi i campioni per più di 15 min. Controllare frequentemente i campioni, e interrompere il riscaldamento e l'essiccamento una volta tutti i campioni sono a secco.
6. Pausa la procedura qui se non c'è abbastanza tempo rimanente nel corso della giornata per completare la fase di riduzione. Temporaneamente (cioè, durante la notte) Conservare i campioni a -80 ° C. Per continuare la procedura dopo il magazzinaggio, rimuovere i campioni dal -80 ° C freezer, e consentire loro di riscaldare completamente prima di togliere il cappuccio.

3. Riduzione

1. All'interno di una cappa, preparare una quantità sufficiente di un boroidruro / L di sodio 10 g (NaBH ₄₎ una soluzione 1 M Ammonium idrossido (NH ₄ OH). Ogni campione richiede 475 ml di questa soluzione. Fare una soluzione fresca per ogni lotto di campioni. Idrossido di ammonio concentrato (27-30% w / w NH ₃₎ è circa 14,5 M.
   Attenzione: boroidruro di sodio _(NaBH4) è una, la tossina idroreattivo igroscopico e potente irritante che rilascia-upon contatto con i vapori di acqua altamente infiammabile che causano gravi ustioni al contatto inalazione, ingestione, o gli occhi / pelle.
   Attenzione: idrossido di ammonio (NH ₄ OH) è un irritante corrosivo e la tossina in grado di provocare gravi ustioni e danni d'organo irreversibili al contatto inalazione, ingestione, o gli occhi / pelle. Lavare l'area interessata con acqua per 30 minuti, e impedire che la vittima da sfregamento o graffiare le zone colpite.
2. Per ciascun campione, aggiungere 475 ml di 10 g / L NaBH ₄ in 1 M NH ₄ OH. campioni Mescolare accuratamente per sciogliere eventuali residui. provette Cap epermettere la reazione di riduzione proseguire per 1 ora.
3. Durante la 1-hr attesa, impostare il collettore di evaporazione riscaldata a 75 ° C. Utilizzare un blocco di riscaldamento con pozzetti per i tubi di vetro (vedi 3.4 sotto).
4. Quando il periodo di reazione di 1 ora è completa, aggiungere 63 ml di metanolo (MeOH) per ogni campione. Questo passo e il passo successivo cancella boro residuo trimetil borato - un liquido relativamente volatile che bolle a 68 ° C.
5. campioni asciutti (nel collettore preriscaldato) a 75 ° C sotto una leggera corrente di azoto per ~ 15 min. Controllare frequentemente campioni e non lasciarli incustoditi. Piccole gocce di liquido sul fondo dei tubi di vetro, il campione non è ancora asciutto.
   Nota: Per distinguere bolle d'aria dalla goccioline liquide, inclinare la provetta. Solo goccioline liquide si muoveranno dopo inclinando, ma il contrario non è sempre vero: se una bolla non si muove, può ancora essere un (molto piccola) goccia di liquido.
6. Una volta SAMPLes sono completamente a secco, preparare una 9: soluzione di 1 (v / v) di metanolo (MeOH) e acido acetico (AcOH). Aggiungere 125 ml di questa soluzione MeOH: AcOH per ogni campione.
7. campioni secco (in un collettore preriscaldato) a 75 ° C sotto leggera corrente di azoto.
8. Quando i campioni sono completamente asciutti, sottovuoto asciugare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente: I campioni in una vasca di plastica vuoto (come quelli venduti da FoodSaver), chiudere il coperchio per vuoto, impostare la manopola del vuoto a "vuoto", collegare il tubo di aspirazione, e accendere il vuoto. Per smontare il vuoto, invertire la procedura. Attendere che il sistema per decomprimere completamente prima di tentare di aprire il coperchio per vuoto.
9. Pausa la procedura qui se non c'è abbastanza tempo rimanente nel corso della giornata per completare la fase di riduzione. Temporaneamente (cioè, durante la notte) Conservare i campioni a -80 ° C. Per continuare la procedura dopo il magazzinaggio, rimuovere i campioni dal -80 ° C freezer, e consentire loro di riscaldare completamente prima uncapping.
10. In attesa che i campioni a vuoto a secco (o calda, dopo lo stoccaggio), preparare i reagenti per il passo successivo. Ottenere e numero di un campionatore automatico silanizzata conico-basso (AS) flaconcino (con tappo) per ogni campione. Inoltre, preriscaldamento sia un blocco di riscaldamento superficiale-ben AS-fiala e un blocco di vetro tubo profondo bene tale che il contenuto della provetta di vetro raggiungono una temperatura di 50 ° C.

4. acetilazione (eseguita in un Cappa aspirante)

1. Aggiungere 18 ml di acqua deionizzata per ogni campione. Cap e accuratamente tutti i tubi vortex per sciogliere completamente eventuali precipitati.
2. Aggiungere anidride acetica 250 microlitri di ciascun tubo di vetro. Cap, accuratamente vortex e ultrasuoni in un bagno di acqua per 2 minuti per assicurare la completa dissoluzione dei residui e precipitati.
3. Coprire tubi di vetro con foglio di alluminio, e incubare a una temperatura interna di 50 ° C per 10 min.
4. Aggiungere 230 microlitri di acido trifluoroacetico concentrato (TFA) per ogni campione. Immediatamente coronare und mescolare i campioni. Poi, incubare campioni-rivestiti foglio di alluminio-per 10 minuti a una temperatura interna di 50 ° C.
5. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,8 ml di diclorometano (CH ₂ Cl ₂₎ per ogni campione. Tappo e mescolare bene.
6. Aggiungere 2,0 ml di acqua deionizzata per ogni campione. Cap e campioni di mescolare bene. Centrifuga da 0 a 3.000 xg per separare gli strati. Utilizzare una pipetta Pasteur non silanizzata per eseguire l'estrazione liquido / liquido come indicato al punto 1.4.6, evitando la contaminazione dell'acqua.
7. Ripetere l'estrazione una volta, per un totale di due estrazioni. Utilizzare pipette Pasteur silanizzati per trasferire lo strato organico in etichettato silanizzata in flaconcini (tenuto saldamente in un rack AS). Riempire le fiale AS appena sotto all'orlo.
8. Utilizzare un pre-riscaldato, superficiale pozzetti blocco di riscaldamento a campioni secco (in fiale AS) per 15 min a 40 ° C sotto azoto. Non troppo secca. I prodotti finali sono conosciuti come parzialmente metilati acetati alditolo (PMAAs).

5. gascromatografia - spettrometria di massa (GC-MS)

1. Ricostituire ogni campione in 100 ml di acetone e mescolare bene. Utilizzare un campionatore automatico per iniettare 1 ml di ogni campione in modalità split nel GC split-mode liner (mantenuta a 280 ° C e contenente un piccolo tampone di lana di vetro silanizzata). Utilizzare un rapporto di divisione di 40. Uso di elio come gas di trasporto in modalità flusso costante di 0,8 ml / min attraverso una colonna GC DB-5ms 30 m con un ID 0,25 mm e 0,25 micron di film.
2. Mantenere la temperatura GC iniziale del forno a 165 ° C per 0,5 min. Dopo il tempo di attesa iniziale, programma il forno a rampa della temperatura, per ogni corsa, da 165 ° C a 265 ° C ad una velocità di 10 ° C / min (che richiede 10 minuti), quindi seguirà immediatamente la temperatura di 265 ° C a 325 ° C ad una velocità di 30 ° C / min (che richiede 2 min) e mantenere la temperatura a 325 ° C per 3 min. Il tempo di funzionamento totale per campione è di 15,5 min.
3. Utilizzare un professionistaperly sintonizzato e calibrato spettrometro di massa per sottoporre i componenti del campione eluizione dalla colonna GC di elettroni di ionizzazione (EI, 70 eV a 250 ° C). Per un analizzatore di massa TOF, analizzare frammenti di m / z 40 a m ​​/ z 800 con un tasso di sommatoria degli impulsi 0.1 sec. Impostare un tempo di ritardo solvente EI-filamento di 2.5 min.

Analisi 6. Dati

1. Se si utilizza un analizzatore di massa TOF, sommare il frammenti ionici più abbondante e / o diagnostica per ogni PMAA applicando una finestra massa di 0,15 Da ottenere un cromatogramma ionico estratta. Ioni di destinazione per ogni PMAA sono stati pubblicati altrove, ³³ ma le seguenti modifiche sono state apportate: ioni t-Glc sono ora 145.1 + 205.1; 2-Man ioni sono 161,1 + 189,1; 3-Gal ioni sono 161.1 + 233.1, 6-Gal ioni sono 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man ione è 189,1; ioni 3,6-Man sono 189,1 + 233,1.
2. Utilizzare QuanLynx o altri software per integrare automaticamente le aree di picco per ogni riassunto estratti cromatogramma ionico.
3. verificare manualmente i risultati di integrazione con la visualizzazione di ogni cromatogramma ionico estratto integrato. Poi, esportare i dati di integrazione dei picchi a un foglio per ulteriori analisi e la normalizzazione dei dati, che coinvolge dividendo l'area di ogni individuo XIC esosi dalla somma di tutte le aree esoso XIC; analogamente, l'area di ogni individuo HexNAc XIC è diviso per la somma di tutte le aree HexNAc XIC. Questa procedura produce abbondanze normalizzati per ogni singolo esosi e HexNAc.

Risultati

Un cromatogramma corrente ionica totale (TIC) mostrando permethylation successo, idrolisi, riduzione e acetilazione dei campioni di plasma umano rispetto ai casi in cui sono state eseguite correttamente due passi permethylation critici sono mostrati in Figura 3.

Assoluta Resa HexNAcs relativa a esosi:

N -acetylhexosamine (HexNAc) a...

Discussione

In generale, la produzione di successo di acetati alditolo parzialmente denaturato (PMAAs) da esosi è irto di difficoltà meno ed è più robusto rispetto alla produzione di successo di N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. L'esatto meccanismo dietro questo fenomeno in quanto svolge in ogni fase di questa procedura è sconosciuta, ma deve riferirsi alla chimica unica del gruppo acetil N (anziché gruppo ossidrile) che è unico per HexNAcs rispetto al esosi. Il meccanismo dietro questo fenomeno si riferisce...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perle di idrossido di sodio	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, grado di reagente 97%
Colonna centrifuga da 0,9 ml	69705	Divisione Pierce di ThermoFisher Scientific	Include tappi e fritte in polietilene
Fiala per autocampionatore GC-MS (silanizzato)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific Target	DP Fiala ad alto recupero, 1,5  ml, 12  mm x 32  mm, include tappi perforabili rivestiti in teflon Provette
polipropilene da 1,5 ml	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Coperchio con tappo a scatto
Provette in polipropilene da 2 ml	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Coperchio con tappo a scatto
Dimetilsolfossido (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagente per biologia molecolare, grado reattivo >99,0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contiene rame come stabilizzante, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuga	75002436: Centrifuga Sorvall Legend Micro 17	ThermoFisher Scientific	Rotore 24 x 1,5/2,0 con coperchio di biocontenimento ClickSeal. Numero di catalogo del rotore: 75003424
provetta in vetro 13 x 100 (silanizzata)*	53283-800	VWR	Provette in vetro borosilicato da 13 mm x 100 mm con finitura con tappo a vite
Tappi per provette in vetro	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble&commercio; Tappi a vite fenolici neri; 13  filettatura GPI mm-415; Rivestimento in gomma con rivestimento in PTFE.
Cloruro di sodio	S7653	Sigma-Aldrich	>99,5% di purezza
Cloroformio	4440-08	Macron Fine Chemicals
Acido trifluoroacetico	299537	Sigma-Aldrich	Purificato al 99% mediante ridistillazione per il sequenziamento delle proteine
Boroidruro di sodio	71321	Fluka Analytical	99%
Soluzione di idrossido di ammonio	320145	Sigma-Aldrich	Contenuto NH3: 28,0-30,0%
Metanolo	AH230-4	Honeywell Burdick & Acido	di grado HPLC
nbsp;	320099	Sigma-Aldrich	99,70%
Essiccatore sottovuoto in plastica	Qualsiasi modello di dimensioni adeguate	FoodSaver
	539996	Sigma-Aldrich	99,50%
Diclorometano	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Grado HPLC stabilizzato
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker analizzato
Collettore di evaporazione riscaldato (unità principale)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Modulo di riscaldamento e agitazione; Modello a triplo blocco con funzione di riscaldamento e agitazione
Collettore di evaporazione riscaldato (evaporatore ad asta)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Evaporatore Reacti-Vap, 27 porte; Per l'uso con il modulo di riscaldamento Reacti-Therm a triplo blocco
Blocchi portacampioni in alluminio per collettore di evaporazione	pi18816	ThermoFisher Scientific	Blocco, alluminio, Reacti-Block S-1, contiene 13  provette diametro mm, 13 fori (14  mm Ø x 45  mm di profondità)
Gascromatografo	Modello A7890	Agilent	Dotato di autocampionatore CTC PAL
Spettrometro di massa	GCT Premier (Tempo di volo)	Acque
Liner in modalità split (disattivato / silanizzato)	5183-4647	Agilent	Contiene un piccolo tappo di lana di vetro silanizzata
DB-5ms Colonna GC	122-5532	Agilent	30 m x 0,25 mm ID x 0,25 micron spessore del film
Clorotrimetilsilano	95541	Sigma-Aldrich
Essiccatore sottovuoto in vetro (per silanizzazione in vetrofilia)	EW-06536-30	Cole-Parmer	largo 12"; dimensione
*La silanizzazione in vetro viene eseguita internamente, durante la notte utilizzando vapore di clorotrimetilsilano in un grande essiccatore sottovuoto in vetro.