Glycan Nodo Analisi: un approccio bottom-up per Glycomics

Sahba Zaare; Jesús S. Aguilar; Yueming Hu; Shadi Ferdosi; Chad R. Borges

doi:10.3791/53961

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Articolo metodologico

Glycan Nodo Analisi: un approccio bottom-up per Glycomics

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DOI:

10.3791/53961

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22 maggio 2016

Sahba Zaare¹ , Jesús S. Aguilar¹ , Yueming Hu¹ , Shadi Ferdosi¹ , Chad R. Borges¹

¹Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta una forma migliorata di una nuova tecnica di glicomica bottom-up progettata per analizzare il profilo composizionale aggregato dei glicani in biofluidi non frazionati attraverso la scomposizione chimica dei glicani nei loro monosaccaridi specifici per il linkage costituente per il rilevamento mediante GC-MS. Le potenziali applicazioni includono la diagnosi precoce del cancro e di altri disturbi affettivi dei glicani.

Abstract

Sintetizzati in un processo non guidato da schemi da enzimi chiamati glicosiltransferasi, i glicani sono attori chiave in vari eventi intra ed extracellulari significativi. Molte condizioni patologiche, in particolare il cancro, influenzano l'espressione genica, che a sua volta può deregolare l'abbondanza relativa e i livelli di attività degli enzimi glicoside idrolasi e glicosiltransferasi. I glicani interi aberranti unici derivanti dalla glicosiltransferasi deregolata sono spesso presenti in tracce all'interno di biofluidi complessi, rendendo il loro rilevamento difficile e talvolta stocastico. Tuttavia, con un'adeguata preparazione del campione, una delle più antiche forme di spettrometria di massa (gascromatografia-spettrometria di massa, GC-MS) è in grado di rilevare di routine la raccolta di monosaccaridi specifici per punti di ramificazione e linkage ("linfonodi glicani") presenti in biofluidi complessi. Complementare alle tradizionali tecniche di glicomica top-down, l'approccio qui discusso prevede la raccolta e la condensazione di ciascun nodo di glicano costituente in un campione in un singolo segnale analitico indipendente, che fornisce informazioni strutturali e quantitative dettagliate sui cambiamenti del glicoma nel suo complesso e rivela glicosiltransferasi potenzialmente deregolate. I miglioramenti apportati alla permetilazione e alle successive fasi di estrazione liquido/liquido qui forniti migliorano la riproducibilità e la resa complessiva facilitando l'esposizione minima dei glicani permetilati a condizioni acquose alcaline. Le modifiche alla fase di acetilazione aumentano ulteriormente l'entità della reazione e la resa complessiva. Nonostante la loro riproducibilità, le rese complessive di acetati di alditolo parzialmente permetilati (PMAA) di N-acetilesasomina (HexNAc) hanno dimostrato di essere intrinsecamente inferiori al loro valore teorico atteso rispetto alle PMAA esose. Il calcolo del rapporto tra l'area sotto il cromatogramma ionico estratto (XIC) per ogni singolo esoso PMAA (o HexNAc PMAA) e la somma di tali aree XIC per tutti gli esosi (o HexNAc) fornisce un nuovo metodo di normalizzazione che facilita la quantificazione relativa dei singoli nodi di glicano in un campione. Sebbene attualmente limitato in termini di limiti assoluti di rilevazione, questo metodo accelera l'analisi dei biofluidi clinici e mostra notevoli promesse come approccio complementare ai tradizionali glifumetti top-down.

Introduzione

Glicolipidi, glicoproteine, proteoglicani, glicosaminoglicani e costituiscono i quattro classi principali di complessi carboidrati eterogenee noti collettivamente come glicani. Come componenti onnipresenti e integrali della membrana plasmatica, glicocalice, e la matrice extracellulare e fluidi, glicani partecipano in questi diversi processi biochimici come l'endocitosi, traffico intracellulare, motilità cellulare, trasduzione del segnale, riconoscimento molecolare, l'attivazione del recettore, adesione cellulare, l'interazione ospite-patogeno , intercellulare comunicazione, immunosorveglianza, e l'iniziazione risposta immunitaria. ¹ Present....