Method Article

Indagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta Discoideum Dictyostelium Per aggregazione Dosaggi

DOI:

10.3791/53972

⸱

June 18th, 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ameba sociale Dictyostelium discoideum subisce una transizione evolutiva in un organismo multicellulare quando muore di fame. La proteina conservata evolutiva coronina A svolge un ruolo cruciale nell'avvio dello sviluppo. Utilizzando i saggi di aggregazione come metodo principale, miriamo a chiarire il ruolo della coronina A nello sviluppo precoce.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum un'ameba si trovano nel terreno, si nutrono di batteri. Quando fonti di cibo diventano scarse, secernono fattori di avviare un programma di sviluppo multicellulare, durante il quale le singole cellule chemiotassi verso i centri di aggregazione 1-4. Questo processo dipende dal rilascio di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) 5. cAMP è prodotto in onde attraverso l'azione concertata di ciclasi e fosfodiesterasi, e si lega al G recettori accoppiati alla proteina cAMP 6,7. Un test ampiamente utilizzato per analizzare i meccanismi coinvolti nel ciclo di sviluppo del eucariote Dictyostelium discoideum inferiore si basa sull'osservazione di aggregazione delle cellule in condizioni sommerse 8,9. Questo protocollo descrive l'analisi del ruolo di Coronin A nel ciclo di sviluppo per fame in piastre tessuto-coltura sommersa in soluzione salina bilanciata (BSS) 10. Coronin A è un membro del pr ampiamente conservatafamiglia otein di coronins che sono stati implicati in una vasta gamma di attività 11,12. Dictyostelium cellule prive Coronin A sono in grado di formare aggregati multicellulari, e questo difetto può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cAMP cascata 10. Le tecniche descritte in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine ​​durante le fasi iniziali del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum monte della cascata cAMP. Pertanto, utilizzando questo test aggregazione può consentire l'ulteriore studio della Coronin Una funzione e far progredire la nostra comprensione della biologia Coronin.

Introduction

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La famiglia Coronin delle proteine ​​è altamente conservata in tutta eucarioti. Queste proteine ​​sono caratterizzati dalla presenza di un triptofano-aspartato amino-terminale (WD) ripetere contenente regione seguita da una regione unica collegata a un dominio coiled-coil carbossi-terminale 13,14 (figura 1). Coronins sono stati implicati in una varietà di funzioni cellulari, tra cui la regolamentazione del citoscheletro e trasduzione del segnale 12. Nei mammiferi, fino a sei brevi molecole Coronin (Coronin 1-6) e un 'tandem' Coronin 7, possono essere co-espressi 12,15. Coronin 1 è il membro della famiglia più ampiamente studiato, e ha dimostrato di essere coinvolto in distruzione degli agenti patogeni, la sopravvivenza delle cellule T e la segnalazione neuronale. Come, esattamente, Coronin 1 svolge tali attività rimane poco chiaro. Mentre Coronin 1 è stato mostrato per regolare Ca 2+ e cAMP-dipendente di segnalazione così come F-actina citoscheletro modulazione 16-18, il potenziale co-expression di un massimo di 7 membri della famiglia nei mammiferi ha reso difficile per studiare la funzione molecolare di coronins in questi sistemi, a causa di potenziali esuberi. A differenza di organismi dei mammiferi, il più basso eucariote Dictyostelium discoideum esprime solo due membri della famiglia Coronin (Coronin A, la ortologo di mammiferi Coronin 1 e Coronin B, la ortologo di Coronin mammiferi 7) con funzioni apparentemente non ridondanti 15,19,20. Questo fatto rende Dictyostelium discoideum un modello potente per studiare la funzione di coronins.

Per studiare il ruolo di Coronin A in Dictyostelium discoideum, abbiamo indotto il ciclo di sviluppo per fame in piastre di coltura tissutale contenente tampone equilibrata soluzione salina (BSS) utilizzando sia le cellule di tipo selvatico o cellule prive Coronin A 10. Abbiamo scoperto che le cellule prive Coronin A erano in grado di formare aggregati multicellulari su fame. Per una valutazione quantitativa accurata di questa fenotipol'imaging cellulare dal vivo automatizzato descritto in questo protocollo è uno strumento di vitale importanza. Il difetto nella inizio della risposta di inedia nelle prime cellule mancanti Coronin A può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cascata cAMP. L'applicazione esogena di impulsi cAMP per simulare l'apertura di sviluppo è stato utilizzato da diversi laboratori in passato 8,9. Tuttavia, questa procedura è anche noto per essere fortemente dipendente densità cellulari e temporizzazione. Pertanto, il protocollo qui descritto mira a ridurre questi variabilità per garantire un elevato grado di riproducibilità. Nel loro insieme, le tecniche utilizzate in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine ​​durante le prime fasi del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum e hanno il potenziale per identificare a monte così come effettori a valle di Coronin Una funzione.

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Protocol

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  1. Osservare la risposta di inedia precoce di Dictyostelium discoideum mediante microscopia time-lapse.
    1. Crescere le cellule DH1.10 o cellule Corà -carente in un flacone contenente Erlenmayer HL-5 di media (per 1 L: 5 g proteoso peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, 0,35 g di Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g diidrostreptomicina-solfato, pH 6,6) a 22 ° C in un incubatore agitazione con una rotazione di 160 rpm. Mantenere le cellule ad una densità tra 0,01 x 10 6 cellule / ml e 2 x 10 6 cellule / ml.
    2. Esaminare l'aggregazione delle cellule, per la raccolta di log-fase di crescita le cellule DH1.10 21 o cellule Cora -carente 10 generata in background DH1.10, coltivate in agitazione cultura con HL-5 di media a 22 ° C. Per fare ciò, adottare le opportune quantità di cellule (di solito tra 10 e 50 ml), centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare le cellule due volte in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, pH 6,5).
    3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, le cellule piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Consentire loro di aderire per 1 ora a 22 ° C in BSS.
    4. Visualizza aggregazione mediante microscopia time-lapse come descritto in precedenza 10, prendendo immagini ogni 135 secondi. utilizzando un imaging cellulare dal vivo istituito dotata di obiettivo 5X e una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica elettrone-moltiplicando automatizzato dal software appropriato (vedi Materiali Tavolo).
  2. cAMP pulsare delle cellule discoideum Dictyostelium durante il digiuno.
    1. Esaminare l'effetto degli impulsi di cAMP applicati esternamente sullo sviluppo delle cellule DH1.10 21 o cellule 10 DH1.10 CORA -carente, raccogliendo le cellule. Per fare ciò, adottare le opportune quantità di cellule (di solito tra 10 e 50 ml), centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare due volte in BSS.
    2. coucellule NT utilizzando un emocitometro e risospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml in BSS. Agitare le culture (160 rpm) a 22 ° C per 2 ore prima di applicare impulsi. Aggiungere impulsi cAMP utilizzando una pompa peristaltica temporizzata. Programmare la pompa per erogare un impulso 5 sec ogni 6,5 min di 15 ml di 50 nM cAMP (concentrazione finale) in un periodo di 5 ore.
    3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, le cellule piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Lasciare aderire per 1 ora a BSS.
    4. Visualizza aggregazione dopo 16 ore a 22 ° C mediante microscopia in campo chiaro con obiettivo 5X.
  3. Induzione di Dictyostelium discoideum sviluppo attraverso l'esposizione a mezzo condizionato.
    1. Preparare fresco mezzo condizionato come descritto 22. Raccogliere le cellule DH1.10 log-fase 21 o celle 10 DH1.10 Cora -carente, di tremare cultoUres con HL-5 di media a 22 ° C con una pipetta, centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare le cellule tre volte in PBM (0,02 M di fosfato di potassio, 10 mM CaCl 2, e 1 mm MgCl 2, pH 6.1).
    2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, risospendere questi in PBM ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml e agitare per 20 ore a 110 rpm / 22 ° C.
    3. Raccogliere mezzo condizionato dopo centrifugazione a 400 g per 3 min e chiarire per centrifugazione a 8.000 xg per 15 min a 4 ° C.
    4. Filtro condizionata mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron (vedi Materiali Tavolo) e diluire in triplice PBM.
    5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e la piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Consentire loro di aderire per 1 ora a 22 ° C.
    6. Scambio supernatante delle cellule con il mezzo precedentemente preparato condizionata.
    7. Visualizza l'aggregazione di unopo 16 ore al microscopio in campo chiaro utilizzando un obiettivo 5X.

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Results

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Le cellule carenti di Coronin Uno spettacolo un difetto di sviluppo precoce (figura 2). In assenza di Coronin A cellule sono in grado di formare aggregati multicellulari, che è la fase iniziale durante il ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum. Pertanto, Coronin A sembra giocare un ruolo durante la risposta di inedia precoce e / o segnalazione cAMP. Infatti, la mancanza di formazione degli aggregati multicellulare in assenza di Coronin A è accompagnato da...

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Discussion

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Le proteine ​​Coronin si trovano nella maggior parte dei taxa del clade eucariotica. Dictyostelium discoideum Coronin A, l'omologo di Coronin mammiferi 1, è coinvolto nella risposta di inedia in anticipo, dal momento che Coronin Un deficit di cellule non sono in grado di formare centri di aggregazione durante l'inizio dello sviluppo ciclo 10. Per essere in grado di valutare quantitativamente e con precisione il ritardo di sviluppo tra i ceppi, un set-up microscopio imaging cellulare dal vivo ...

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Disclosures

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Acknowledgements

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Ringraziamo il Dictyostelium Stock Center per ceppi e reagenti. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica e del Cantone di Basilea.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Terreni HL-5 (per 1 L: 5 g di peptone proteoso, 5 g di peptone tiotone E, 10 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, 0,35 g di Na2HPO4*2H2O, 0,35 g di KH2PO4, 0,05 g di diidrostreptomicina-solfato, pH 6,6)
Proteoso peptoneBD Bioscience211693
Tiotone E peptoneBD Bioscience211684
Estratto di lievitoBD Bioscience212750
GlucosioAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
diidrostreptomicina-solfatoSigma-AldrichD1954000
PBM (0,02 M fosfato di potassio, 10 μ M CaCl2 e l mM MgCl2, pH 6.1)self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)self made
0.45-μ m Filtropure S filtroSarstedt83.1826
Falcon 24 pozzetti Piastra per coltura tissutaleFisher Scientific08-772-1H
Microscopio CellobserverAxioVision personalizzato Zeiss
Microprocessore IPC... pompa di dosaggio controllataISMATECISM 931
Axiovert 135M microscopioZeiss491237-0001-000
Agitatore di incubazioneInforst HT Minitron
Software

References

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