Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi è spesso coinvolta nella patogenesi di varie malattie croniche progressive come la broncopneumopatia interstiziale. Il segno distintivo patologico è la formazione di focolai fibroblastici, che è associato alla gravità della malattia. Si propone che le cellule mesenchimali costituite dai focolai fibroblastici derivino da diverse fonti cellulari, inclusi i fibroblasti intrapolmonari originariamente residenti e i fibrociti circolanti del midollo osseo. Recentemente, si è supposto che anche le cellule mesenchimali sottoposte a transizione epitelio-mesenchimale (EMT) contribuiscano alla patogenesi della fibrosi. Inoltre, l'EMT può essere indotta trasformando il fattore di crescita β e l'EMT può essere potenziata da citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale α. Il test di contrazione su gel è un modello in vitro ideale per la valutazione della contrattilità, che è una delle funzioni caratteristiche dei fibroblasti e contribuisce alla riparazione delle ferite e alla fibrosi. Qui, è dimostrato lo sviluppo di un saggio di contrazione del gel per valutare la capacità contrattile delle cellule mesenchimali sottoposte a EMT.
Introduzione
La fibrosi è coinvolto nella patogenesi di diverse malattie croniche progressive, come la malattia polmonare interstiziale, fibrosi cardiaca, cirrosi epatica, insufficienza renale terminale, sclerosi sistemica, e malattie autoimmuni 1. Tra le malattie polmonari interstiziali, la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia cronica progressiva e mostra prognosi infausta. caratteristica patologica della IPF è lo sviluppo di focolai fibroblastici costituito da fibroblasti attivati e miofibroblasti che sono associati con la prognosi. Le origini di tali fibroblasti polmonari sono proposti per essere derivato da varie cellule mesenchimali, tra cui fibrobl....
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Protocollo
1. Preparazioni e coltura di cellule epiteliali del polmone
- cellule epiteliali del polmone umano A549 Cultura (linea cellulare aderente) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 100 UI / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina.
- Rimuovere e scartare il terreno di coltura di cellule dal piatto di cultura, e lavare una volta con 5 - 10 ml di tampone fosfato salino (PBS). Dopo il lavaggio, aspirare immediatamente la PBS.
- Aggiungere 2 ml Tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,05%) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 3 min.
- Raccogliere le cellule st....
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Risultati
Durante EMT, le cellule epiteliali perdono marcatori epiteliali, come E-caderina, e di ottenere l'espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina e α-actina muscolo liscio 4,5. L'incubazione delle cellule epiteliali umane A549 polmone con TGF-β1 e TNF-α induce EMT. L'aspetto delle normali cellule A549 sono pietra ciottolo come forma e la forma triangolare che è una caratteristica delle cellule epiteliali (Figura 3A), ma dopo stimolate con TG.......
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Discussione
Il protocollo sviluppato in questo studio comprende due fasi. Il primo passo è eseguito per indurre EMT, mentre il secondo passo è il dosaggio gel contrazione. Poiché è importante confermare che le cellule sottoposti EMT, passaggio 2 fornisce un eccellente complemento ai cambiamenti di espressione morfologiche e geniche. Studi precedenti hanno mostrato che EMT delle cellule A549 è stata indotta da solo il 24 TGF-β1; tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza 10, TNF-α aumenta EMT e l'acquis.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Tadashi Koyama per l'aiuto tecnico. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; una sovvenzione al Gruppo di Ricerca sull'Insufficienza Respiratoria del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone; una sovvenzione per la ricerca sulle malattie allergiche e l'immunologia, Giappone.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | Per A549 medio |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Fattore di crescita trasformante-β 1, Umano, ricombinante | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Ricombinante umano TNF-&alfa; | R& D systems | 210-TA/CF | |
| E-Caderina (24E10) Clone monoclonale di coniglio | di segnalazione cellulare | #3195 | Diluizione 1:3.000 |
| Vimentina (D21H3) Corpo monoclonale di coniglio | Tecnologia di segnalazione cellulare | #5741 | Diluizione 1:3.000 |
| Anticorpo anti-alfa-tubulina | sigma aldrich | T9026 | Diluizione 1:10.000 |
| Anticorpo monoclonale anti-actina, &alfa;-Muscolo liscio& nbsp; | sigma aldrich | A5228 | Diluizione 1:10.000 |
| Anticorpo anti-N-caderina | BD Transduction Laboratories | #610920 | Diluizione 1:1.000 |
| IgG anti-topo, Pecora antiaderente intera legata a HRP (anticorpo secondario) | GE Healthcare | NA931-100UL | Diluizione 1:20.000 IgG |
| anti-coniglio, Asino antiaderente intero legato a HRP (anticorpo secondario) | GE Healthcare | NA934-100UL 1 | :20.000 diluizione |
| Reagente bloccante | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti, con coperchio | corning | #353046 | |
| 100 mm Piatto per coltura cellulare | TPP | #93100 | |
| DMEM, | tecnologie per la vita | 12100-046 | Per 4&volte; DMEM |
| Gel di collagene di tipo 1 | Gelatina Nitta | Cellmatrix tipo I-A | |
| Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Sistema di documentazione su gel | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Software di analisi su gel | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | software di analisi in bundle con AE-6911FXN |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | life technologies | 25300054 | |
| piastre a 24 pozzetti, soluzione di | IWAKI | 1820-024 | |
| , 0,4% | life technologies | 15250-061 | |
| Kit di estrazione dell'RNA | Qiagen | 74106 | |
| Tecnologie per la vita | trascrittasi inversa | 18080044 | |
| Sistema di PCR in tempo reale | Kit PCR verde Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR Kit per PCR verde | Qiagen | 204145 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi (100x) | life technologies | 78429 | |
| Membrana | PVDFKit | ||
| bio-rad | 5000006JA | ||
| Gel di poliacrilammide | ATTO | 2331810 | |
| Reagente di rilevamento Western blotting | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Telecamera CCD a freddo | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Inibitore della tripsina | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Poliossietilene (20)Monolaurato di sorbitano | Wako Prodotti chimici di laboratorio | 163-11512 | |
| Poliossietilene (9) ottiifenile etere | Wako Prodotti chimici di laboratorio | 141-08321 |
Riferimenti
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
- Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (20....
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Ristampe e permessi
