Sviluppo di un In Vitro Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Summary

Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

Abstract

La fibrosi è spesso coinvolta nella patogenesi di varie malattie croniche progressive come la broncopneumopatia interstiziale. Il segno distintivo patologico è la formazione di focolai fibroblastici, che è associato alla gravità della malattia. Si propone che le cellule mesenchimali costituite dai focolai fibroblastici derivino da diverse fonti cellulari, inclusi i fibroblasti intrapolmonari originariamente residenti e i fibrociti circolanti del midollo osseo. Recentemente, si è supposto che anche le cellule mesenchimali sottoposte a transizione epitelio-mesenchimale (EMT) contribuiscano alla patogenesi della fibrosi. Inoltre, l'EMT può essere indotta trasformando il fattore di crescita β e l'EMT può essere potenziata da citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale α. Il test di contrazione su gel è un modello in vitro ideale per la valutazione della contrattilità, che è una delle funzioni caratteristiche dei fibroblasti e contribuisce alla riparazione delle ferite e alla fibrosi. Qui, è dimostrato lo sviluppo di un saggio di contrazione del gel per valutare la capacità contrattile delle cellule mesenchimali sottoposte a EMT.

Introduction

La fibrosi è coinvolto nella patogenesi di diverse malattie croniche progressive, come la malattia polmonare interstiziale, fibrosi cardiaca, cirrosi epatica, insufficienza renale terminale, sclerosi sistemica, e malattie autoimmuni ^1. Tra le malattie polmonari interstiziali, la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia cronica progressiva e mostra prognosi infausta. caratteristica patologica della IPF è lo sviluppo di focolai fibroblastici costituito da fibroblasti attivati ​​e miofibroblasti che sono associati con la prognosi. Le origini di tali fibroblasti polmonari sono proposti per essere derivato da varie cellule mesenchimali, tra cui fibrobl....

Protocol

1. Preparazioni e coltura di cellule epiteliali del polmone

1. cellule epiteliali del polmone umano A549 Cultura (linea cellulare aderente) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 100 UI / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina.
2. Rimuovere e scartare il terreno di coltura di cellule dal piatto di cultura, e lavare una volta con 5 - 10 ml di tampone fosfato salino (PBS). Dopo il lavaggio, aspirare immediatamente la PBS.
3. Aggiungere 2 ml Tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,05%) e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 3 min.
4. Raccogliere le cellule st....

Results

Durante EMT, le cellule epiteliali perdono marcatori epiteliali, come E-caderina, e di ottenere l'espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina e α-actina muscolo liscio ^4,5. L'incubazione delle cellule epiteliali umane A549 polmone con TGF-β1 e TNF-α induce EMT. L'aspetto delle normali cellule A549 sono pietra ciottolo come forma e la forma triangolare che è una caratteristica delle cellule epiteliali (Figura 3A), ma dopo stimolate con TGF-β1 e TNF-α.......

Discussion

Il protocollo sviluppato in questo studio comprende due fasi. Il primo passo è eseguito per indurre EMT, mentre il secondo passo è il dosaggio gel contrazione. Poiché è importante confermare che le cellule sottoposti EMT, passaggio 2 fornisce un eccellente complemento ai cambiamenti di espressione morfologiche e geniche. Studi precedenti hanno mostrato che EMT delle cellule A549 è stata indotta da solo il ²⁴ TGF-β1; tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza ^10, TNF-α aumenta EMT e l'acquis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	Per A549 medio
FBS	GIBCO	10437
Fattore di crescita trasformante-β 1, Umano, ricombinante	Wako Laboratory chemicals	209-16544
Ricombinante umano TNF-&alfa;	R& D systems	210-TA/CF
E-Caderina (24E10) Clone monoclonale di coniglio	di segnalazione cellulare	#3195	Diluizione 1:3.000
Vimentina (D21H3) Corpo monoclonale di coniglio	Tecnologia di segnalazione cellulare	#5741	Diluizione 1:3.000
Anticorpo anti-alfa-tubulina	sigma aldrich	T9026	Diluizione 1:10.000
Anticorpo monoclonale anti-actina, &alfa;-Muscolo liscio& nbsp;	sigma aldrich	A5228	Diluizione 1:10.000
Anticorpo anti-N-caderina	BD Transduction Laboratories	#610920	Diluizione 1:1.000
IgG anti-topo, Pecora antiaderente intera legata a HRP (anticorpo secondario)	GE Healthcare	NA931-100UL	Diluizione 1:20.000 IgG
anti-coniglio, Asino antiaderente intero legato a HRP (anticorpo secondario)	GE Healthcare	NA934-100UL 1	:20.000 diluizione
Reagente bloccante	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti, con coperchio	corning	#353046
100 mm Piatto per coltura cellulare	TPP	#93100
DMEM,	tecnologie per la vita	12100-046	Per 4&volte; DMEM
Gel di collagene di tipo 1	Gelatina Nitta	Cellmatrix tipo I-A
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Sistema di documentazione su gel	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Software di analisi su gel	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	software di analisi in bundle con AE-6911FXN
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	life technologies	25300054
piastre a 24 pozzetti, soluzione di	IWAKI	1820-024
, 0,4%	life technologies	15250-061
Kit di estrazione dell'RNA	Qiagen	74106
Tecnologie per la vita	trascrittasi inversa	18080044
Sistema di PCR in tempo reale	Kit PCR verde Stratagene	Mx-3000P
SYBR Kit per PCR verde	Qiagen	204145
Cocktail di inibitori della proteasi (100x)	life technologies	78429
Membrana	PVDFKit
	bio-rad	5000006JA
Gel di poliacrilammide	ATTO	2331810
Reagente di rilevamento Western blotting	GE Healthcare	RPN2232
Telecamera CCD a freddo	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Inibitore della tripsina	sigma aldrich	T9003-100MG
Poliossietilene (20)Monolaurato di sorbitano	Wako Prodotti chimici di laboratorio	163-11512
Poliossietilene (9) ottiifenile etere	Wako Prodotti chimici di laboratorio	141-08321