La valutazione simultanea di Cardiomyocyte DNA Sintesi e Ploidia: Un metodo per assistere Quantificazione del Cardiomyocyte Rigenerazione e fatturato

Sommario

La quantificazione del turnover dei cardiomiociti è impegnativa. Il protocollo qui descritto fornisce un contributo importante a questa sfida, consentendo una quantificazione accurata e sensibile della generazione di nuclei neo-cardiomiocitari e della ploidia dei nuclei.

Abstract

Anche se è accettato che il cuore ha un potenziale limitato per rigenerare cardiomiociti dopo un trauma e che bassi livelli di fatturato cardiomiociti si verificano durante il normale invecchiamento, la quantificazione di questi eventi rimane difficile. Questo è in parte dovuto alla rarità del processo e il fatto che più fonti cellulari contribuiscono al mantenimento del miocardio. Inoltre, la duplicazione del DNA all'interno di cardiomiociti spesso porta ad un cardiomiociti poliploide e solo raramente porta a nuove cardiomiociti di divisione cellulare. Al fine di quantificare con precisione cardiomiociti discriminazione fatturato tra questi processi è essenziale. Il protocollo qui descritto si avvale di etichettatura nucleoside lungo termine al fine di etichettare tutti i nuclei che sono sorte a seguito di nuclei replicazione del DNA e cardiomiociti identificati utilizzando l'isolamento dei nuclei e la successiva immunomarcatura PCM1. Insieme questo permette l'identificazione accurata e sensibile dell'etichettatura nucleoside della cardiomyocyte popolazione nuclei. Inoltre, 4 ', l'etichettatura e l'analisi di ploidia nuclei 6-diamidino-2-phenylindole, consente la discriminazione dei nuclei neo-cardiomiociti da nuclei che hanno incorporato nucleosidici durante poliploidizzazione. Anche se questo metodo non può controllare per cardiomiociti binucleazione, permette una quantificazione rapida e robusta dei nuclei neo-cardiomiociti tenendo conto di poliploidizzazione. Questo metodo ha un certo numero di applicazioni a valle, tra cui la valutazione dei potenziali terapie per migliorare la rigenerazione dei cardiomiociti o studio degli effetti di malattia cardiaca sul fatturato dei cardiomiociti e ploidia. Questa tecnica è anche compatibile con l'aggiunta di tecniche immunoistochimiche a valle, permettendo la quantificazione di incorporazione nucleoside in tutti i tipi di cellule cardiache.

Introduzione

Negli ultimi anni c'è stato un accumulo di prove contestare la supposizione che il cuore è un terminalmente differenziate, ^1,2 organo post-mitotico. Tuttavia, la quantificazione del fatturato dei cardiomiociti e rigenerazione rimane difficile.

Le difficoltà di identificare con precisione la generazione dei cardiomiociti rara utilizzando tecniche di immunoistochimica standard sono ben segnalati ^3. Inoltre, la fonte cellulare di generazione cardiomiociti rimane incerta con evidenza di contributi di proliferazione dei cardiomiociti, nonché di differenziazione delle cellule staminali ^4-6. Pertanto, l'uso di modelli lineage tracing che richiedono la conoscenza del fenotipo cardiomiociti progenitore è impossibile e quantificazione della proliferazione in una singola popolazione, compresi cardiomiociti, è appropriato. Inoltre, una cardiomiociti ha il potenziale per endoreplication senza cariocinesi (risultante in una macchina poliploidediomyocyte) o cariocinesi in assenza di citocinesi (risultante in un cardiomiociti binucleate) ^7,8. La quantificazione precisa del fatturato cardiomiociti dipende dalla capacità di distinguere tra questi eventi e la vera generazione neo-cardiomiociti. Questo crea complicazioni unici, poiché la replicazione del DNA e l'espressione delle chinasi ciclina-dipendenti in cardiomiociti non dimostrano solo la divisione cellulare vera ^9,10.

Per facilitare la quantificazione della generazione neo-cardiomiociti, abbiamo unito una tecnica di isolamento nuclei stabilito, e l'etichettatura immunologica di materiale pericentriolar 1 (PCM1) per l'identificazione dei nuclei cardiomiociti come descritto da Bergmann et al. ^7,11 con nuovi metodi di lungo termine l'etichettatura del DNA e analisi ploidia. PCM-1 è una proteina centrosome che si accumula sulla superficie nucleare differenziate, miociti non ciclismo. Studi precedenti hanno dimostrato che gli anticorpi controPCM-1 Etichetta specificamente nuclei cardiomiociti ^7,11 e come tale PCM1 è stato utilizzato da un certo numero di gruppi indipendenti per identificare cardiomiociti ^1,12,13. Inoltre, abbiamo dimostrato che l'espressione PCM1 associa a nuclei cardiomiociti geneticamente etichettati in TnT-cre modello di topo transgenico ¹⁴ (figura supplementare 1).

Il protocollo qui descritto consente l'identificazione precisa e sensibile di neo generazione cardiomyocyte nuclei nel cuore del mouse, indipendentemente dalle origini cellulari (Figura 1A e B) e contemporaneamente escluse etichettatura nucleoside causa poliploidizzazione dall'analisi (Figura 1C e D). Anche se questo metodo non può controllare per cardiomiociti binucleazione, permette una quantificazione rapida e robusta dei nuclei neo-cardiomiociti che è richiesto per la quantificazione precisa del fatturato dei cardiomiociti. Per di più,essa fornisce uno strumento di screening rapido per valutare eventuali cambiamenti nelle dinamiche di generazione dei cardiomiociti.

Mentre etichettatura DNA solito comporta 5-Bromo-2'-deossiuridina (BrdU) come analogico timidina, il protocollo qui descritto utilizza dosaggio 5 etinil-2'-deossiuridina (EdU) basato quanto richiede meno fasi di lavorazione per una più rapida through-put e non richiede denaturazione del DNA per immuno-rilevamento, che lo rende compatibile con altri protocolli immunocolorazione e aumentando così le potenziali applicazioni a valle del metodo.

Figura 1: pulsante continuo con EdU etichette neo-cardiomiociti, indipendentemente dalla loro progenitori. (A) EdU è incorporato nel DNA dei cardiomiociti durante la divisione cellulare. La proliferazione della popolazione cardiomiociti sarà Result in un aumento, o la sostituzione dei cardiomiociti ed è sintesi del DNA pertanto produttivo (contribuisce al mantenimento dei tessuti e la riparazione). (B) EdU è incorporato nel DNA delle cellule progenitrici cardiache durante la divisione cellulare. Questo verrà mantenuto nella cella durante la differenziazione alla stirpe dei cardiomiociti. Questa differenziazione delle cellule staminali comporterà anche un aumento del numero dei cardiomiociti e contribuisce quindi alla manutenzione e riparazione dei tessuti. (C) cardiomiociti hanno il potenziale per subire "non produttivi" replicazione del DNA con conseguente aumento della ploidia dei cardiomiociti, che è associato con l'ipertrofia dei cardiomiociti e rimodellamento miocardico, ma non sostituisce cardiomiociti persi. Il processo di poliploidizzazione differisce da binucleazione poiché comporta un cardiomiociti con un singolo nucleo che contiene quattro o più insiemi di due cromosomi omologhi (> 2N). (D) A seguito di un continuo nuclei pUlse, questo protocollo descrive l'isolamento dei nuclei e l'identificazione dei nuclei cardiomiociti di espressione PCM1 per consentire la quantificazione sia ploidia dei cardiomiociti e EdU incorporazione. Espressione PCM1 e EdU incorporazione rilevato mediante citometria a flusso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocollo

il lavoro degli animali è stato autorizzato e approvato dal Newcastle University Ethics Review Board. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alle linee guida della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. Amministrazione EdU

1. Sciogliere EdU in soluzione salina sterile (0,9% w / v) ad una concentrazione finale di 12,5 mg / ml.
   1. Riscaldare la soluzione a 40 ° C e agitare per sciogliere completamente. Conservare abbastanza EdU / Saline a 4 ° C per iniettare tutti i topi nello studio consentendo 6 iniezioni giornaliere.
      Nota: in genere oltre 6 topi sono necessari per ogni gruppo sperimentale. Tuttavia, i calcoli di potenza devono essere eseguite per studi indipendenti.
2. Pesare i singoli topi. Calcolare il volume necessario per somministrare 100 mg / g di soluzione salina / EdU per ogni mouse (8 ml di soluzione madre EdU per g).
3. Disegnare il volum appropriatae di Edu / soluzione salina in insulina siringa con un ago da 25 G.
4. Eseguire intraperitoneale (ip) iniezioni durante la manipolazione topo, utilizzando le tecniche del Ministero degli approvati.
   1. Posizionare il mouse sul coperchio della gabbia. Delicatamente tirare indietro sulla base della coda e afferrare saldamente il mouse per la collottola.
   2. Esporre l'addome per iniezione tenendo il mouse con il dito indice e pollice vicino alla base della testa e ribaltamento testa dell'animale all'indietro verso il pavimento.
   3. Pulire l'addome con una soluzione di alcool al 70%. Individuare linea mediana dell'animale e quadrante in basso a destra. Iniettare la soluzione EdU / Saline nell'animale nel quadrante inferiore destro.
   4. Iniettare topi con una soluzione salina / EdU e registrare l'ora del giorno.
5. Ripetere i passaggi da 1,2 a 1,4, allo stesso tempo del giorno, per 6 giorni consecutivi.
   Nota: Come un controllo negativo EdU è necessario impostare il gating per l'analisi di citometria di flusso, iniettare un'età aggiuntivo, sesso e sperimentalmente corrispondonoMouse ed un volume equivalente di soluzione salina senza EdU. Ciò fornirà il controllo richiesto (nessun controllo UDE). Questo controllo deve essere incluso per ogni studio per consentire variazioni di lotti di reagenti e citometro istituito.

2. Cuori di raccolta

1. A 24 ore dopo il 6 ^° iniezione EdU, sacrificare i topi utilizzando dislocazione cervicale (o un programma alternativo approvato 1 Home Office metodo).
2. Mettere animale sacrificato in posizione supina e fare incisione cutanea dalla metà addome per il diaframma con le forbici chirurgiche.
3. Tagliare il diaframma, e tenendo lo sterno dalla cavità del corpo, tagliato bilateralmente per esporre il cuore.
4. Sollevare il cuore un po 'e tagliare i principali vasi sanguigni del tratto di efflusso a sezionare il cuore fuori della cavità toracica.
5. Immediatamente svolge ogni cuore in un individuo da 15 ml tubo da centrifuga contenente 10 ml di PBS refrigerate a 4 ° C.
6. Trasferimento cuori SEParate 10 cm Petri, utilizzando un bisturi tagliare ogni cuore in due in un orientamento sagittale e lavare cuore comprimendo delicatamente con un paio di pinze. Quindi sostituire la PBS per rimuovere tutto il sangue possibile. Ripetere questa operazione due volte.
7. Mettere entrambe le parti di ogni cuore nella stessa 1,5 ml singolo tubo microcentrifuga.
8. Passare al punto 3 o in alternativa Conservare i campioni -80 ° C come descritto nei passi 2.9 e 2.10.
9. Utilizzando un ago G 25, fare un piccolo foro nel coperchio provetta per impedire l'apertura del coperchio causa dell'espansione del gas quando il cuore viene elaborato.
10. Etichettare ogni provetta e posto in un contenitore di azoto liquido per congelare.

3. Nuclei Dissociazione e Cardiomyocyte Nuclei etichettatura

Nota: Questo nuclei etichettatura di dissociazione e cardiomiociti nuclei è adattato da quello di Bergmann et al ¹¹ eseguire questa procedura su tutti i campioni iniettati.con EdU e soluzione salina iniettata (nessun controllo UDE) controllo negativo. Vedi Tabella 1 per la ricetta di soluzioni necessarie per effettuare queste operazioni.

1. Per ogni cuore da analizzare, collocare 36 ml di soluzione PBS 1% BSA / in un tubo ultracentrifuga, incubare per 30 min, scartare la soluzione e poi lasciare asciugare all'aria.
   Nota: Questo tubo è utilizzato nel passo 3.6.
2. Posizionare i singoli cuori congelati su un piatto di 10 millimetri su ghiaccio e tritare con un bisturi che permette il cuore per scongelare durante il processo di macinazione.
3. Posizionare cuori macinate in 15 ml di cellule Lysis Buffer in una provetta da centrifuga da 50 ml ed omogeneizzare con un omogeneizzatore sonda per 15 secondi a 25.000 rpm a temperatura ambiente.
4. Aggiungere altri 15 ml di cellulare Lysis Buffer alla provetta e trasferire ad un 40 ml Dounce con un grande pestello spazio. Eseguire 10 colpi con il pestello e filtrare a 100 micron, allora 40 micron colino cella in una provetta da centrifuga da 50 ml.
5. Centrifugare per 10 min at 700 xg a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
6. Risospendere il pellet nucleare in 25 ml di saccarosio gradiente Solution e sovrapporre i nuclei cellulari contenenti soluzione sopra di 10 ml di soluzione gradiente di saccarosio fresca nel tubo ultracentrifuga preparato in 3.1.
7. Centrifugare a 13,000 xg per 1 ora a 4 ° C utilizzando un rotore tubo oscillazione fuori.
8. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet nuclei in 1.300 ml di buffer di stoccaggio nuclei in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e l'etichetta PCM1.
9. Rimuovere 300 microlitri della sospensione ad una nuova provetta e aggiungere a 700 ml di tampone di conservazione nuclei fresco. Etichettare questo tubo come il controllo ISO.
10. Aggiungere anti-PCM1 ad una concentrazione finale di 8 mg / ml per provetta etichettata PCM1 e aggiungere IgG di coniglio anticorpo di controllo isotipico ad una concentrazione di 8 mg / ml per provetta etichettata controllo ISO.
11. Incubare per una notte a 4 ° C. Dopo incubzione, centrifugare a 700 xg per 10 minuti, scartare il surnatante, sostituirlo con 1 ml di tampone di conservazione nuclei fresco, risospendere e centrifugare ancora per 10 min a 700 x g. Eliminare il supernatante e sostituirlo con 1 ml di tampone di conservazione nuclei fresco.
12. Aggiungere 1 ml di F (ab ') 2 Frammento di capra anti-IgG di coniglio (H + L) anticorpo (FITC o colorante verde fluorescente equivalente) per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml.
    Nota: L'uso di un F (ab ') 2 dell'anticorpo frammento diminuisce il potenziale di marcatura non specifica delle cellule immunitarie compresi macrofagi e cellule B.
13. tubi avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce e incubare per 1 ora a 4 ° C.

4. Individuazione di EdU incorporazione

1. Diluire 10x concentrata EdU tampone di reazione 1:10 con acqua deionizzata.
2. Centrifugare il PCM-1 e ISO controllo etichettato nuclei sospensioni a 700 xg per 10 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet nuclei in 1 ml di1% BSA / PBS soluzione. Lavare il pellet nuclei due volte.
3. Dopo l'ultimo lavaggio, scartare il surnatante e sostituirlo con 100 ml di fissativo EdU.
4. Avvolgere tubi in alluminio per proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
5. Lavare i campioni due volte con 1 ml di 1% BSA / PBS, centrifugare a 700 xg ed incubare con soluzione di permeabilizzazione saponina basata 1x a temperatura ambiente per 15 min.
6. Preparare 1x etichettatura cocktail EdU (Tabella 2). Un minimo di 2 reazioni sarà richiesto di inserire il nessun controllo edu.
7. Aggiungere 500 ml di 1x EdU etichettatura cocktail direttamente a ciascun campione già contenente nuclei in 100 ml di soluzione di permeabilizzazione saponina basata 1x e incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 30 minuti.
8. Centrifugare a 700 xg e risospendere in 1 ml di 1% BSA / PBS e ripetere l'operazione altre due volte.
9. Centrifugare a 700 xg, scartare il surnatante e sostituirlo con 400 ml di soluzione colorante DNA (vedi Tabella dei Materiali).

Nome del reagente

1. cellulare Lysis Buffer

0,32 M di saccarosio

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl 2

5 mM acetato di magnesio

2.0 mM EDTA

0,5 mM EGTA

1 mM DTT

2.Sucrose Gradient Soluzione

2.1 M saccarosio

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM acetato di magnesio

1 mM DTT

3. buffer di stoccaggio Nuclei (NSB)

0.44 M saccarosio

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl 2

1,5 mm spermina

Tabella 1: Nuclei ingredienti tampone isolamento Ricetta per tutti i buffer utilizzati nella sezione del protocollo 3 (Nuclei dissociazione e dei cardiomiociti nuclei etichettatura)..

5. analisi di citometria di flusso

Nota: Eseguire la citometria a flusso su nuclei isolati come descritto in precedenza ^7,11,15.

1. In primo luogo, creare un grafico che descrive Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) per consentire la discriminazione dei nuclei da detriti (Figura 2A).
2. Creare un diagramma a discriminare singoli nuclei da aggregati (Figura 2b) tracciando 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) zona (3-405 / 450/50-A) rispetto altezza (33-405 / 450 / 50-H). garantire that il 3-405 / 450/50-Un segnale viene raccolto della scala lineare per consentire la corretta determinazione del contenuto di DNA.
3. Creare un diagramma che descrive 488/535 / 30 A (PCM-1) vs SSC e visualizzare solo gli eventi dal cancello singoletto creata in 5.2 al fine di valutare PCM-1 nella popolazione singoletto.
4. Eseguire il campione di controllo Isotype per stabilire un PCM-1 cancello positivo (Figura 2C). Eseguire una piccola quantità di PCM1 etichettato esempio per verificare l'PCM1 che esprime la posizione della popolazione e gating.
5. Creare un diagramma che descrive SSC-A vs 405/450 / 50-A (per rilevare DAPI). In questa trama, visualizzazione singoletto solo pcm1 nuclei che esprimono, con le porte create in 5.3. Utilizzare questa trama per creare un cancello gerarchico aggiuntivo che contiene solo 2N nuclei (Figura 2D).
6. Creare una trama che descrive 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A per consentire l'identificazione di etichettatura EdU della PCM1 esprimere popolazione di cardiomiociti. Visualizzare solo i nuclei che sono singoletto, P CM1 + e 2N utilizzando il gating sopra.
7. Campione di cuore eseguito da alcun controllo EdU per impostare il cancello positivo EdU (Figura 2E). Creare la porta appropriata per le cellule EdU +.
8. Record e quantificare singoletto, PCM-1 che esprimono, nuclei 2N che hanno incorporato edu.
9. Calcolare questa popolazione come percentuale del totale singoletto, PCM1 + nuclei. Ciò fornirà la velocità di generazione nuclei neo-cardiomiociti, durante il periodo di impulso EdU 7 giorni, come percentuale del totale nuclei cardiomiociti.
   Nota: Come DAPI legame al DNA è stechiometrico l'intensità di fluorescenza è proporzionale alla quantità di DNA. Determinare ploidia base all'intensità della / 450/50-Un segnale 405, come descritto in precedenza ^7.
10. Per valutare la ploidia all'interno della popolazione totale dei cardiomiociti utilizzare la trama stabilita in 5,5 e una strategia basata su gating concentrazione del DNA ^7.

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Figura 2:. Soppressione strategia di quantificare cardiomiociti EdU costituzione e ploidia (A) I nuclei sono discriminati da detriti sulla base di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). (B) Viene creato un cancello lineare e la popolazione nuclei singoletto è identificato sulla base di etichettatura DAPI e l'altezza 405/450/50 vs segnale di zona. (C) gating fluorescente permette la separazione dei nuclei cardiomiociti nuclei (PCM-1-negativi) (PCM-1-positive) e non cardiomiociti dal tessuto cardiaco. (D) L'intensità del segnale di DAPI viene utilizzato per determinare la concentrazione del DNA e quindi ploidia nuclei della popolazione cardiomiociti PCM1 +. Nel topo> 80% dei nuclei cardiomiociti sono diploide (2n). (E) gating fluorescente permette la separazione di 2N, nuclei cardiomiociti, che hanno incorporato EdU (PCM + / EDU + = 0,9%) da 2N, cardiomiociti che non sono incorporati EdU (PCM + istruzione). Tutte le fasi sono dettagliati nel protocollo 5.0. Esempio illustrato da MDX ^{-. / Y} topi sullo sfondo C57 / BL10 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Risultati

Questo metodo consente la quantificazione di una maggiore integrazione EdU a causa di cardiomiociti divisione dei nuclei, mentre il controllo per una maggiore poliploidizzazione. Utilizzando un test basato BrdU, abbiamo precedentemente dimostrato che il cuore dei mammiferi risponde alla perdita di cardiomiociti cronica, nel modello di topo mdx di distrofia muscolare di Duchenne, con la rigenerazione di nuovi cardiomiociti. Abbiamo usato i metodi descritti qui per validare ulteriormente i nostri risultati pubblicati e per dimostrare l'utilità del protocollo. Come per il protocollo descritto; adulti (12 settimane di età) topi mdx BL10 e di controllo sono stati impulsiva con una sola iniezione quotidiana di EdU per 7 giorni, ha riferito in precedenza per consentire l'analisi statica tra i gruppi sperimentali ^5,13. Analisi immunoistochimica di cuori pulsati dimostra la presenza di PCM1 esprimere cardiomiociti che hanno incorporato EdU (Figura 3A). usin Tuttavia, i dati ottenutig metodi immunoistologici possono essere male interpretate, come altri tipi di cellule che hanno incorporato EdU possono essere erroneamente identificati come cardiomiociti. Un esempio di questo è illustrato nel complementare Figura 1A e B. Inoltre i metodi immunoistologici non distinguono poliploidizzazione dalla divisione nucleare. La citometria a flusso analisi dettagliata in questo protocollo consente la rapida quantificazione della divisione nucleare cardiomiociti in topi mdx e di controllo, mentre escludendo le cellule che erano incorporate EdU a causa di poliploidizzazione. Simili dati precedentemente pubblicati ^13, analisi ha rivelato un aumento dei tassi di generazione nuclei neo-cardiomyocyte nei cuori mdx topo rispetto ai pari età controlli (1,2% contro 0,17%; Figura 3B e C).

Figura 3: La quantificazione del EdU etichettato cardiomiociti in di tipo selvatico e cuori MDX. (A) Immagine di proiezioni Z-stack prese da 40 micron di spessore sezioni di cuori mdx. PCM-1 che esprimono nuclei cardiomiociti (verde) che ha incorporato EdU (rosso). freccia gialla indica EdU etichettato cardiomiociti. ie ii indica individuale EdU etichettato cardiomiociti indicati nella Z-plane. Nuclei etichettato con DAPI (blu) (B e C) citometria a flusso dei nuclei isolati che mostra trame rappresentativi 12-13 settimane di età wild type (C57 / BL10) e topi mdx (MDX ^{- / y} sul C57 / BL10 sfondo). (B) Istogramma che mostra l'intensità DAPI e discriminazione tra 2N e> 2N nuclei. (C) Piazzole mostrano EdU incorporazione nella popolazione nuclei 2N cardiomiociti se analizzato come descritto nel presente protocollo. Per tutti i mouse Edu è stato somministrato per 1 settimana a partire dal 12 settimane di età. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare:. PCM-1 è un marcatore specifico per nuclei cardiomiociti Utilizzando il protocollo descritto nuclei sono stati isolati dal topo transgenico doppio prodotto da attraversando topi TNT-cre ¹⁴ con la ROSA ^{nT / NG} cre sensibile linea di giornalista ^16. Nella risultante di attivazione del mouse cre sotto il controllo di Troponina T (TNT) promotore conduce all'espressione irreversibile di GFP con sta localizzata ai nuclei. Nuclei etichettato con controllo isotipico (Iso) dimostra la capacità di identificare la GFP esprimere cardiomiociti popolazione nuclei (488/530/30-A). Etichettatura dei nuclei con PCM1 anti-(anticorpo secondario rilevati dai 633-660 / 20-A) dimostra la correlazione di espressione PCM1 con il cardiomyocy esprimono GFPTE popolazione nuclei. In questo esempio, il 98,8% dei nuclei cardiomiociti come individuati dal promotore attività TNT, sono etichettati con anticorpi PCM1. Clicca qui per scaricare la Figura 1 supplementare.

Figura integrativa 2:. Sfide per quantificare il rinnovo dei cardiomiociti con tecniche immunoistochimiche (A) 2D L'immagine mostra due PCM-1 che esprimono nuclei cardiomiociti (verde), che sembrano essere etichettato anche per EdU (rosso). Le frecce gialle indicano quello che sembra essere cardiomiociti, che hanno incorporato edu. Ciò è dovuto alla apparente co-localizzazione di espressione PCM1 ed etichettatura EdU quando visualizzati utilizzando immagini 2-dimensionale. (B) Una proiezione 3-dimensionale di questa immagine identifica la EdU etichettato cellule non sono cardiomiociti, ma sono cellule non-cardiomiociti sovrastanti PCM1 esprimere nuclei cardiomiociti. Topi C57 / BL10 a 12 settimane di età utilizzato per gli esperimenti. Clicca qui per scaricare supplementare figura 2A. Clicca qui per scaricare supplementare figura 2B.

Componenti di reazione	Numero di reazioni
	2	5
PBS	875 ml	2.19 ml
protettivo di rame	20 microlitri	50 microlitri
colorante fluorescente picolyl azide	5 ml	12,5 ml
reazione diluitodel buffer preparato in 4.1	100 pl	250 microlitri
volume di reazione totale	1 ml	2,5 ml

Tabella 2: EdU ingredienti del cocktail. Ricetta per un cocktail etichettatura EdU necessaria sezione del protocollo 4 (Rilevamento di EdU incorporazione).

Discussione

Per quantificare con precisione il fatturato dei cardiomiociti e saggi di rigenerazione deve distinguere tra vero generazione dei cardiomiociti e la divisione del DNA non produttivo. Molti studi continuano ad ignorare semplicemente questi eventi non produttive, quantificando la proliferazione dei cardiomiociti esclusivamente tramite l'espressione della ciclina kinesis e marcatori del ciclo cellulare. Fino ad oggi un unico metodo che consente la quantificazione precisa del fatturato cardiomiociti, mentre il controllo di questi eventi non produttive rimane allusiva. In particolare, rimane difficile spiegare poliploidizzazione cardiomiociti che contribuisce fino al ~ 65% dei cardiomiociti replicazione del DNA ^13. Pertanto, per facilitare la quantificazione accurata di generazione cardiomiociti abbiamo sviluppato un protocollo che consente la quantificazione robusta delle aliquote di nuclei cardiomiociti neo escludendo replicazione del DNA che si traduce in un aumento ploidia. Anche se questo protocollo non può discriminazione tra generi neo-cardiomiocitizione e cardiomiociti bi-nucleazione, può essere utilizzato rapidamente e calcolare con precisione il limite superiore (pari al ploidia) di generazione di cardiomiociti. Questo protocollo prevede quindi uno strumento di screening per valutare eventuali variazioni dei tassi di generazione dei cardiomiociti e poliploidizzazione in modelli di malattia o per valutare il potenziale di efficienza di terapie. Una volta variazioni del tasso di generazione di nuclei neo-cardiomiociti vengono identificati utilizzando questo protocollo studi successivi possono essere utilizzati per l'accertamento se questo a causa di cambiamenti nella generazione cardiomiociti del numero dei cardiomiociti nucleazione, come descritto in precedenza ^2,13,17,18. Questi includono l'uso delle dinamiche di nucleazione quantificazione cardiomiociti istologici durante il periodo di impulso o analisi di sezioni di tessuto ottenuti da animali impulsi Edu per confrontare EdU incorporazione nelle popolazioni cardiomiociti mononucleate e multinucleate.

A causa dei bassi livelli di fatturato cardiomiociti questoprotocollo utilizza iniezioni multiple di EdU nel corso di un periodo di 7 giorni. Ciò consente anche la "caccia" di tutte le potenziali fonti cellulari di generazione di cardiomiociti e consente la quantificazione della generazione di cardiomiociti nuclei cumulativo in questo periodo di tempo. A seconda dello studio, questo lasso di tempo può essere regolata per soddisfare i livelli previsti di generazione di cardiomiociti. Per la quantificazione accurata EdU incorporazione nei nuclei cardiomiociti, è imperativo che non vi è alcuna marcatura non specifica dei nuclei con l'anticorpo secondario utilizzato per rilevare PCM-1 reattività. Sarebbe quindi opportuno effettuare ulteriori esperimenti di titolazione anticorpi secondari per ottimizzare questo aspetto del protocollo, in particolare se un anticorpo secondario diverso da quello proposto in questo protocollo deve essere utilizzato. Il protocollo qui descritto utilizza PCM-1 per identificare i nuclei cardiomiociti. Mentre questo è un marcatore cardiomiociti stabilita, marcatori alternativi possono essere utilizzati per convalidaredati; questi includono anticorpi specifici per cardiaca Troponina T, che è stato identificato come in parte localizzato nei nuclei cardiomiociti ^1. Analogamente, alternative proteine ​​localizzate nucleari possono essere utilizzati per identificare e quantificare EdU incorporazione in popolazioni nuclei diversi da quello dei cardiomiociti. E 'importante che tutti i nuclei cardiomiociti che sono attivamente mitosi sono esclusi dall'analisi, come il destino di questa sintesi del DNA è sconosciuta e può provocare sia la divisione cellulare o aumento della ploidia. PCM1 viene smontato durante la fase M del ciclo cellulare quindi cardiomiociti mitosi non sarà identificato mediante espressione PCM1. Inoltre, tutti i nuclei in fase s del ciclo cellulare devono essere esclusi dal successiva analisi. Ciò può essere ottenuto gating su tutti i nuclei con intensità DAPI sopra popolazione 2N compresi quelli con un'intensità DAPI tra 2N e 4N popolazioni.

Anche se è sempreaccettato che il cuore ha la capacità di sostituire cardiomiociti durante l'invecchiamento normale e dopo lesione acuta, la sorgente e il grado di questo potenziale rimane controverso. Inoltre, i tassi di turnover disparate cardiomiociti sono stati segnalati ^1,7,20-22. Questo può essere in parte dovuto alla difficoltà di individuare e quantificare la generazione neo-cardiomiociti ¹⁹ in modo accurato. Ad oggi la maggior parte degli studi hanno contato esclusivamente sull'impiego di analisi istologica e l'identificazione dei cardiomiociti tramite l'espressione di proteine ​​citoplasmatiche, comprese le proteine ​​del sarcomero, per la quantificazione del fatturato cardiomiociti e rinnovo ^2,4,23,24. L'uso di questi metodi per rilevare l'espressione di marcatori di proliferazione, o come dimostrato qui, l'incorporazione di analoghi della timidina può facilmente portare alla errata identificazione di altri tipi di cellule cardiache come cardiomiociti. Mentre l'uso di confocale 3D può aiutare ad alleviare questi problemi Thmetodi di ESE sono costose e che richiede tempo. È interessante notare che il protocollo qui descritto dimostra neo-cardiomiociti generazione nuclei avviene ad una velocità di 0,17% a settimana. Ciò è coerente con altri citometria a flusso studi basati dimostrano tassi di turnover settimanali fino al 0,13% ^5. Anche se è forte la tentazione di estrapolare i tassi di fatturato annuo sulla base di questi dati, come negli studi precedenti ^2,5,25,26, questo è inadeguato come i tassi di turnover sono dinamici durante il tempo di vita di un animale ^13.

Questo metodo ha un certo numero di potenziali applicazioni, tra cui la valutazione dei potenziali terapie per migliorare la rigenerazione dei cardiomiociti o studio degli effetti di malattia cardiaca sul fatturato dei cardiomiociti ei tassi di cardiomiociti poliploidizzazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,32 M saccarosio	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM acetato di magnesio	sigma	M-5661
2,0 mM EDTA	Sigma	E5134
0,5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1,5 mM spermina	Sigma	85590
Isotipo coniglio IgG- ChIP Grado	abcam	abc7415
Coniglio anticorpo anti-PCM-1	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Frammento di anticorpo IgG (H+L) anti-coniglio di capra	Life technologies	Filtri cellulari A-11070
70 μ m e 100 μ m	Fisher scientific	11597522, 11517532
grande clearance	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-etinil-2'-deossiuridina)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Kit di test per citometria a flusso	Life technologies	C10634	Questo kit include reagenti necessari per la sezione, tampone di reazione EdU,  Soluzione fissativa di permeabilizzazione a base di saponine EdU e i reagenti necessari per il cocktail di etichettatura EdU.
CyStain DNA 2 step kit,	Sysmex Partec	05 5005	Questo kit include i reagenti necessari per l'etichettatura DAPI (soluzione di colorazione del DNA)
Omogeneizzatore di sonda, ad es. , TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor Sonde monouso	Qiagen	990890
ultracentrifuga	Sorvall
Provetta per ultracentrifuga Facscanto II	BD Biosciences
, parete sottile, polipropilene. 38,5 ml, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Albumina sierica bovina	Sigma	A2153