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Articolo metodologico

siRNA Transfection e l'EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

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DOI:

10.3791/53995

⸱

20 settembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per trasfezione efficiente siRNA in appena isolate citotrofoblasti villi umani con microperforazione e identificando complessi DNA-proteina in queste cellule. cellule trasfettate possono essere monitorati da Western Blot e EMSA analisi durante il tempo della cultura di 4 giorni.

Abstract

I citotrofoblasti villosi primari umani sono una fonte molto utile di cellule primarie per studiare le funzioni placentari e i meccanismi di regolazione e per comprendere le malattie legate alla gravidanza. In questo protocollo, i citotrofoblasti villosi primari umani appena isolati dalla placenta attraverso un protocollo standard DNasi/tripsina sono microporosi con piccoli RNA interferenti (siRNA). Questo approccio ha fornito una maggiore efficienza per la trasfezione di siRNA rispetto a un metodo basato sulla lipofezione. Le cellule trasfettate possono essere successivamente analizzate mediante Western blot standard entro un lasso di tempo di 3-4 giorni dopo la trasfezione. Inoltre, utilizzando citotrofoblasti villosi primari in coltura, l'analisi EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) è stata ottimizzata ed eseguita su estratti dai giorni 1 a 4. L'uso di queste cellule primarie in coltura e il protocollo descritto consentono una valutazione dell'implicazione di specifici geni e fattori di trascrizione nel processo di differenziazione del citotrofoblasto villoso in uno strato cellulare simile a quello dei sinciziotrofoblasti. Tuttavia, l'intervallo di tempo limitato consentito nella coltura preclude l'uso di metodi che richiedono più tempo, come la generazione di una popolazione cellulare stabile. Pertanto, il test di questa popolazione cellulare richiede protocolli di trasferimento genico altamente ottimizzati.

Introduzione

La disfunzione placentare umana è associata allo sviluppo di diverse malattie associate alla gravidanza come la preeclampsia e la restrizione della crescita intrauterina 1. Un importante costituente cellulare della placenta sono i trofoblasti, che possono essere classificati come citotrofoblasti extravillosi o villosi. Dopo la fusione, i citotrofoblasti villosi si differenziano ulteriormente nello strato di sinciziotrofoblasto, una struttura cellulare multinucleare con un ruolo importante nello scambio feto-materno e nella produzione di ormoni 2. I citotrofoblasti villosi primari umani e le loro controparti differenziate rappresentano importanti campioni biologici e consentono ai ricercatori di studiare una serie di processi correlati alla placenta, come la fusione cellulare, in coltura. Inoltre, sono in corso sforzi sostanziali per identificare marcatori che facilitino una gestione appropriata e migliorino le terapie preventive specifiche per le malattie legate alla gravidanza. I laboratori isolano abitualmente i citotrofoblasti primari dei villi umani da placente fresche, utilizzando una procedura di isolamento standard basata sulla digestione della tripsina dei villi della placenta 3. Poiché i citotrofoblasti in coltura perdono la loro capacità di proliferare e differenziarsi rapidamente in uno strato simile a quello dei sinciziotrofoblasti dopo la coltura 4, sono necessari metodi di trasfezione molto efficienti e approcci di analisi ottimizzati. Studi precedenti hanno determinato le condizioni ottimali di trasfezione di questi citotrofoblasti primari 5. Qui viene presentato un metodo diverso di trasfezione di siRNA, che è stato precedentemente testato in questa cellula di tipo 6. Rispetto a un approccio basato sulla lipofezione, questo metodo di microporazione migliora la trasfezione, valutata in base all'entità del silenziamento di geni specifici.

Gli studi sul promotore e sull'espressione genica forniscono anche una migliore comprensione della funzione placentare. Sebbene sia più difficile da utilizzare a causa del breve lasso di tempo per il quale i citotrofoblasti villosi primari possono essere coltivati, le analisi dei promotori utilizzando protocolli standard possono comunque essere affrontate, come precedentemente pubblicato 7. L'Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) è uno di questi metodi in vitro comunemente usati, che consente un monitoraggio rapido e semplice delle interazioni DNA-proteina. Estratti nucleari da questi trofoblasti primari sono stati utilizzati per testare una regione del promotore della sincitina-2 per interazioni specifiche. I risultati hanno rivelato che i fattori legati possono essere rilevati in diversi momenti della coltura e in modo specifico e riproducibile.

I dati presentati in questo protocollo confermano che il nostro approccio di trasfezione e il protocollo EMSA possono essere utilizzati per citotrofoblasti villosi primari isolati e saranno di grande utilità per studiare le diverse funzioni dei citotrofoblasti villosi in condizioni normali o patologiche.

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Protocollo

Il comitato etico ha approvato UQAM questi protocolli, che sono in accordo con le linee guida del comitato etico di St-Luc Ospedale del Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada). I partecipanti hanno firmato un modulo di consenso informato.

1. Preparazione medio e isolamento delle primarie dei villi citotrofoblasti

  1. Preparare terreno di coltura per citotrofoblasti villi primari umani, completandolo Modified Media Dulbecco di Eagle (DMEM) con 25 mM HEPES, 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare il mezzo preparato attraverso sterile filtro 0,22 micron e conservare in un freezer a -20 ° C in aliquote di 50 ml.
  2. Isolare citotrofoblasti villi primari da placente freschi seguenti protocolli standard 3.
    1. Utilizzando pinze, rimuovere la membrana fetale dal tessuto da graffi delicatamente fuori, facendo attenzione a non rimuovere il tessuto dei villi. Taglia ilrimanendo villi della placenta in cubetti di circa 3 x 3 cm utilizzando bisturi e le forbici. Lavare accuratamente con acqua contenente 0,9% di NaCl per rimuovere sangue materno.
      1. Tenendo ogni cubo con le pinze, rimuovere con attenzione il tessuto dei villi da rimanenti navi e forbici tessuti utilizzando fibrose.
      2. Da 15 a 30 mg di tessuto dei villi, digerire quattro volte in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente tripsina (da 9,6 x 10 5 1,8 x 10 6 U; concentrazione finale 1,2 mg / ml) e deossiribonucleasi I (DNasi I) ( concentrazione finale 200 ug / ml) per 30 min a 37 ° C in un bagno d'acqua con agitazione continua.
        Nota: Utilizzare 150 ml di volume totale per la prima digestione, 100 ml per il secondo digestione e 75 ml per i due digestioni rimanenti.
    2. Raccogliere il surnatante contenente cellule disperse e centrifugare a 1250 xg per 15 minuti senza freno. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di DMEM contenente preriscaldata1% di penicillina / streptomicina.
    3. Strato le cellule disperse sulla cima di una discontinua 5% - pendenza 70% polivinilpirrolidone rivestite di silice (vedi Tabella 1 per la preparazione gradiente) e centrifugare per 23 min a 507 xg senza freno. Rimuovere lo strato di densità tra 1.017 al 1.033 per aspirazione e raccogliere gli strati tra il 40% e il 50% in gradiente con una nuova pipetta. Lavare le cellule estensivamente con 10 ml di preriscaldata DMEM contenente 1% di penicillina / streptomicina.
      Nota: La frazione raccolta corrisponde alla densità tra i 1.048 e 1.062, che ospita trofoblasto.
    4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. In breve, le cellule mescolare e aggiungere 10 ml in una nuova provetta. Aggiungere 10 ml di trypan blu e mescolare delicatamente di nuovo. Stilare la sospensione cellulare e riempire le camere emocitometro. Contare le cellule sotto obiettivo 10X.
    5. Mettere 1 x 10 6 e 4,5 x 10 6 cellule in tubi separati per l'impiego nelle sezioni 1.3 e 2, rispettivamentely. Seme le cellule rimanenti ad una densità di 1,5 x 10 6 cellule / pozzetto in terreno DMEM e cultura a 37 ° C e 5% CO 2 per un massimo di 4 giorni per altri esperimenti.
  3. Valutazione della purezza dei isolate citotrofoblasti villi primarie
    1. Spin 1 x 10 6 delle citotrofoblasti appena isolate in tubi microcentrifuga a 300 x g. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di preriscaldata PBS (PBS). cellule centrifugare a 300 xg e rimuovere PBS mediante aspirazione.
    2. Aggiungere 1 ml di metanolo freddo per cellule e incubare a -20 ° C per 20 min. cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti e rimuovere il metanolo per aspirazione.
      Attenzione: Utilizzare maschera scatola metallica, occhiali protettivi e guanti di gomma durante la manipolazione metanolo.
    3. Aggiungere 1 ml di PBS a temperatura ambiente per reidratare cellule, centrifugare a 300 xg e rimuovere PBS per aspirazione.
    4. Incubare le cellule in PBS contenente FBS (1:50 [v / v] diluizione) e un FcRreagente bloccante (1,10) per 45 min a temperatura ambiente per eliminare legami non specifici.
    5. Lavare due volte con 500 microlitri di PBS temperatura ambiente, cellule centrifugare a 300 xg per 5 min e rimuovere PBS per aspirazione. Risospendere le cellule in 100 microlitri temperatura ambiente PBS.
    6. Incubare le cellule con un isotiocianato monoclonale di topo fluoresceina (FITC) coniugata LP5K antiumano citocheratina-7 anticorpi clone (1: 200) o un anticorpo di controllo isotipo-matched non specifico in PBS contenente 0,2% BSA per 45 min a temperatura ambiente in il buio. Lavare le cellule in PBS.
    7. Analizzare le cellule mediante citometria di flusso 3. Utilizzare preparazioni cellulari, che dimostrano un minimo del 96% di cellule CK-7-positivi mediante citometria di flusso per ulteriori esperimenti.

2. siRNA Transfection di primari umani dei villi citotrofoblasti

  1. Transfection di umani citotrofoblasti villi principale utilizzando un dispositivo microperforazione
    1. Preparare 6 pozzetti contenenti2 ml di terreno DMEM per l'incubazione di cellule microporated.
    2. Dopo l'isolamento di citotrofoblasti primari (vedi paragrafo 1.2), prendere una aliquota di cellule in sospensione e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
    3. Trasferire 1,5 x 10 6 cellule in una provetta e le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule con 1 ml di PBS Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -free) e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule delicatamente in 100 ml di buffer di risospensione.
      Nota: Evitare di tenere sospensione cellulare per più di 15-30 min a temperatura ambiente, per massimizzare la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione.
    5. Aggiungere 300 ng di sincitina-2 siRNA (o di controllo-scrambled siRNA) al tubo di 1,5 ml microcentrifuga e aspirare la miscela di cellule-siRNA utilizzando un 100 ul trasfezione pipetta. Inserirela pipetta nella stazione (vedi elenco dei materiali) e fatte salve le cellule ad una 1300 V singolo impulso di 30 msec.
    6. trasferire immediatamente le cellule a 6 pozzetti (previste al punto 2.1.1) contenenti terreno integrato 37 ° C pre-riscaldato per evitare danni alle cellule.
    7. Ripetere i punti 2.1.5 e 2.1.6 per i restanti campioni.
    8. oscillare delicatamente la piastra per 30 secondi per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare la piastra a 37 ° C in un umidificata CO 2 incubatore per 24 a 48 ore. Aggiornare terreno di coltura 24 ore dopo la trasfezione.
    9. Valutare l'efficienza di trasfezione da analisi Western Blot (vedere i passi da 3 a 6).
  2. Lipofezione di siRNA in citotrofoblasti primari umani
    1. Dopo l'isolamento di cytotrophoblasts villi, seme le cellule ad una densità di 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti in 2 ml di terreno di coltura e incubare per 18 ore.
    2. Diluire 300 ng di sincitina-2-specifici siRNA (o di controllo-strapazzatesiRNA) e 5 ml di base lipidica reagente di trasfezione in distinte provette 1,5 ml in un volume totale di 10 ml di mezzo agli antibiotici e privo di siero. Incubare per 5 min.
    3. Mescolare i reagenti diluiti e incubare per altri 20 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso trasfezione. Aggiungere 90 ml di mezzo agli antibiotici e privo di siero alla miscela per un volume finale di 100 microlitri.
    4. Togliere terreno di coltura dalle 6 pozzetti (passo 2.2.1). Aggiungere 2 ml di mezzo fresco e la trasfezione mix 100 ml ad ogni pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 24 a 48 ore. Aggiornare terreno di coltura 24 ore dopo la trasfezione.
    5. Valutare l'efficienza di trasfezione da analisi Western Blot (vedere i passi da 3 a 6).

3. Preparazione di lisati da tutta la cultura cellulare

  1. Rimuovere il supporto e lavare ogni pozzetto (dai passi 2.1.8 e 2.2.4) utilizzando DPBS pre-riscaldato (Mg 2+, Ca 2+ gratuito). Aspirare il DPBS e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare per 1-3 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2. Interrompere il trattamento tripsina con l'aggiunta di 500 ml di siero contenente terreni di crescita.
    Nota: utilizzare il volume supporto appropriato in base al tipo di pallone / piatto: 1 ml per 10 7 cellule / 100 mm piatto / 150 cm 2 fiasco; 0,5 ml per 5 x 10 6 cellule / 60 millimetri piatto / 75 cm 2 pallone.
  2. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) e le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Posizionare la provetta in ghiaccio. Risospendere il pellet in 50-200 ml di buffer ghiacciata Radio-Saggio di immunoprecipitazione (RIPA) (vedi Tabella 2 per la composizione del buffer) contenente appena aggiungereEd proteasi e gli inibitori della fosfatasi ad una concentrazione finale 1x. Brevemente, agitare la provetta e lasciare in ghiaccio per 30 min.
  4. Spin a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. posizionare con cura il tubo in ghiaccio. Usando una pipetta, trasferire il surnatante in una provetta fresco pre-raffreddata tenuti in ghiaccio. Eliminare il pellet.

4. Preparazione di estratti nucleari da cellule in coltura

  1. Per ogni (fase 1.2.5) bene, lavare citotrofoblasti coltivate due volte con 1 ml di pre-riscaldato DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratuito). Aspirare DPBS e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina / EDTA. Incubare per 1-3 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 e interrompere il trattamento tripsina aggiungendo 500 ml di siero contenente mezzi di crescita.
  2. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con DPBS (Mg 2+, Ca 2+-free) e le cellule pellet per centrifugazionea 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione tutto il surnatante senza disturbare il pellet e posizionare il tubo in ghiaccio.
  3. Estrarre proteina nucleare in base alle istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione di proteine ​​di ogni campione utilizzando test della proteina quantificazione (Bradford e il dosaggio dell'acido bicinconinico (BCA)).

5. Preparazione del campione e elettroforesi

  1. Determinare la concentrazione di proteine ​​per ogni estratto cellulare utilizzando un saggio proteico quantificazione (ad esempio, Bradford 8 o 9 BCA).
  2. Come da istruzioni del produttore (se anticorpi potrebbero essere utilizzati in condizioni di riduzione e denaturazione), aggiungere un volume equivalente di 2x Laemmli Sample Buffer (Tabella 2) per 20-30 mg di proteine ​​totali.
  3. lisati cellulari bollire a 100 ° C per 5 min. Aliquota 50-100 ml di lisato di evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento e memorizzare i tubi rimanenti a -20 ° C per un uso futuro.
  4. Mentre i campioni sono il riscaldamento, preparare 1 L di 1x tampone di corsa (Tabella 2).
  5. Spin i campioni a 16.000 xg per pochi secondi e disporli sul ghiaccio.
  6. Caricare uguale quantità di proteina in ciascun pozzetto di un gel SDS-PAGE 12% (vedi Tabella 2 per la composizione gel), insieme ad un marcatore di peso molecolare. Eseguire il gel per 1 a 2 ore a 100 V.

6. Trasferimento del Protein dal gel alla membrana

  1. Attiva polivinilidenfluoruro membrana (PVDF) con metanolo per 1 min e risciacquare con trasferimento 1x soluzione tampone / 10% metanolo. Secondo le istruzioni del produttore, trasferire per 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni della proteina.
    Nota: l'efficienza di trasferimento può essere valutata utilizzando Ponceau Red colorazione prima della fase di bloccaggio.

7. colorazione degli anticorpi

  1. Bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con la soluzione di bloccaggio 5%.
  2. Incubare la membrana con sincitina-2 anti-anticorpi (4 mg / ml; 1: 5.000) 6 o anti-gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 0,4 mg / ml; 1: 500) in soluzione di saturazione 5% notte a 4 ° C (anti-sincitina-2) o per 45 min a temperatura ambiente. Lavare la membrana tre volte in soluzione salina tamponata con Tris Tween (TBST; vedi Tabella 2 per la composizione buffer) per 5 min.
  3. Incubare la membrana con appropriata perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-coniglio o anticorpi anti-topo (1: 10.000) in 5% in tampone di bloccaggio TBST a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana tre volte in TBST per 5 minuti e poi risciacquare in TBS. Rilevare segnali mediante il substrato blotting chemiluminescenza-based.

8. radiomarcatura di oligonucleotidi a singolo filamento

  1. reazione di fosforilazione
    1. In una provetta, aggiungere 50 ng di un oligonucleotide avanti con 1x tampone T4 polinucleotide chinasi, 1 UT4 polinucleotide chinasi e 20 pCi (γ- 32 P) ATP e portare il volume di reazione di 20 microlitri di acqua priva di nucleasi.
    2. Incubare a 37 ° C per 30 min. Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA. Portare al volume di 50 ml con acqua priva di nucleasi.
  2. La rimozione dei nucleotidi prive di personalità giuridica da oligonucleotidi
    1. Preparare una colonna G-25 equilibrata con tampone TE (Tabella 2) seguendo le istruzioni del produttore. Porre la colonna in 1,5 ml provetta fresco-free DNasi.
    2. Aggiungere lentamente 50 ml di sonda (dal punto 8.1.2) sopra la resina, facendo attenzione a non disturbare il letto di resina. Spin per 2 min a 350 xg per raccogliere il campione purificato nella provetta da 1,5 ml. Lavare la colonna G-25 con 36 ml di acqua priva di nucleasi e rotazione per 2 min a 350 xg per raccogliere nella provetta.
  3. Ibridazione con l'OL filamento complementareigonucleotide
    1. Trasferire la sonda radiomarcata (86 mL) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ng del oligonucleotide inversa e 1x di tampone ricottura (Tabella 2). Riscaldare 5 min a 95 ° C e lasciare per una notte a temperatura ambiente per il raffreddamento.
    2. Preparare non radioattivi oligonucleotidi a doppio filamento con l'aggiunta di 50 ng di senza etichetta in avanti e oligonucleotidi e 1x di tampone ricottura invertire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Portare al volume di 100 ml con acqua priva di nucleasi. Il calore e mantenerlo a temperatura ambiente come descritto al punto 8.3.1.

9. Preparazione di un gel poliacrilammide non denaturante per EMSA

  1. Preparare un gel nativo 4% (10 x 12 cm) con 1,5 mm di spazio-pettine (vedi Tabella 2 per la composizione di gel). Pulire tutte le lastre di vetro con acqua distillata.
    Nota: E 'fondamentale che le piastre di essere completamente privo di detergente ionico, come SDS.
  2. immediatamente pnostra soluzione acrilammide tra le piastre e permettere polimerizzazione procedere (circa 30 min).
  3. Montare l'apparato di elettroforesi e riempire il serbatoio con 0.5x TBE. Pre-eseguire il gel per 30 minuti a 1 ora a 150 V prima di caricamento del campione.

10. DNA reazione di legame

  1. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 10 mg di estratto nucleare (passo 4.3) 1x Gel Spostamento Binding Buffer (Tabella 2) e portare il volume finale di 10 ml con acqua priva di nucleasi. Come controllo, predisporre un tubo senza estratto nucleare. Per la reazione della concorrenza, aggiungere 1 ml di non-specifica o specifiche oligonucleotide a doppio filamento a freddo (punto 8.3.2).
  2. Aggiungere 1 ml di sonda radioattiva dal punto 8.3.1 a ogni reazione. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungere 1 ml di tampone di caricamento 10x gel per reazione e caricare ogni campione sul gel preparata nella sezione 9.
  3. Eseguire il gel per 1 1/2 a 2 ore a 150 V. Dopo la migrazione, avvolgere il gel e il vetro in un involucro di plastica e la posizione in una cassetta esposizione al di sotto uno schermo al fosforo. Lasciare cassette a 4 ° C per 24 ore.
  4. Rimuovere lo schermo dalla cassetta di esposizione e inserire nel dispositivo di imaging di fosforo per la scansione.

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Risultati

placente freschi dal gravidanze termine sono stati usati per isolare citotrofoblasti villi primari umani per condurre la serie di esperimenti presentati nella sezione Protocollo. Dopo l'isolamento, abbiamo prima analizzato la purezza cytotrophoblasts attraverso l'uso del marcatore citocheratina-7 (Figura 1). Preparazioni di cellule sono state quindi colorati con un anticorpo monoclonale anti-citocheratina-7 anticorpi. La figura 1 rappresenta i ri...

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Discussione

Gli studi sulla funzione della placenta umana e lo sviluppo sono state notevolmente migliorate dai protocolli volti ad ottimizzare l'isolamento di varie popolazioni di cellule placentari. Uno dei migliori popolazione di cellule placentari studiata rimane il citotrofoblasti villi, il cui studio ha notevolmente beneficiato di protocolli ottimizzati che permettono l'isolamento efficiente e affidabile. Questo ha permesso inoltre una serie di esperimenti, come gli studi di trasfezione e promotore. Utilizzando un prot...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Scienze e della Ricerca Ingegneria Consiglio Nazionale del Canada (NSERC) (# 298.527) (BB). CT è stato sostenuto da una borsa di studio FARE istituzionale. AV è stato sostenuto da un Ph.D. NSERC Graham Bell Borsa di studio. BB ha tenuto un Canada Research Chair in Retrovirology umana (Livello 2). Grazie a Beatrix Beisner per un aiuto nella revisione del testo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HBSS senza  Ca2+, Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma#14060-057
DMEM Alto glucosio senza HepesGibco#12100-061
Hepes (1 M)Gibco#15630-080
Penicillina-Streptomicina-Neomicina (100x)Gibco#15640-055
Amfotericina BSigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O Sigma#M
Siero fetale bovinoGibco#16170-078 
Percoll Sigma#P-1644Per gradiente di densità
Syncytin-2 siRNAAmbion Life technologies#AM16708
Scrambled siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Trypsine, tipo I Sigma#T8003
DharmaFECT Lipotrasfezione  reagenti GEhealthcare# T-2001-01
Trypsin/EDTALife technologies#25300-062
Inibitore della proteasi CocktailRoche Diagnostic#11873580001
Kit di analisi delle proteine BCA PierceThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
Anti-coniglio IgG, anticorpo legato HRP Segnalazione cellulare#7074
Substrato di Western Blotting (POD) a chemiluminescenza BMRocheDiagnostic#11500708001
DPBS Tecnologie per la vita#14287-080
Polinucleotide chinasi T4NEB#M0201S
ATP, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AcrylmideSigma 
TEMEDLife technologies#17919
Persolfato di ammonioSigma
Clone di anticorpi anti-citocheratina-7 umana LP5K,MilliporeCBL194FDiluizione 1:200
Reagente bloccante FcR Miltenyi Biotec130-059-901Diluizione 1:10
Citometro a flusso BD Sistema AcuriBecton Dickinson
Microporator MP-100 apparato Tampone di
R (sistema di trasfezione al neon 100  µ l Kit)Life technologiesMPK10096
membrana PVDF MilliporeIPVH00010 Attiva con metanolo
Anticorpo GAPDH umanoSanta Cruz Biotechnologysc-1371791:500
CavalloRubino Perossidasi (HRP) - capra coniugato anticorpo anti-coniglio o anticorpo anti-topoSegnalazione cellulare #70741:10.000
Cavallo Perossidasi di ravanello (HRP) - anticorpo anti-topo coniugatoSegnalazione cellulare7076 1:10.000
NE-PER Reagente per Estrazione Nucleare e CitoplasmaticaThermo Scientific#78833
G-25 column GE Healthcare#27-5325-01
Dispositivo di imaging a chemiluminescenza e fluorescenzaMontré al BiotechFusion FX5
4% gel nativoFatto
in casa PBSFatto1x
Personal Molecular Imager (PMI) SistemaBioRad
#A9099#A3678 coniugato FITC risospensione bio digitale # in casa

Riferimenti

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  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
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