Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Summary

Qui viene mostrato un metodo per visualizzare l'ultrastruttura della matrice extracellulare in tessuti cardiaci decellularizzati.

Abstract

La fibrosi è un componente di tutte le forme di malattie cardiache indipendentemente dall'eziologia, e mentre sono stati fatti molti progressi nel campo della biologia della matrice cardiaca, ci sono ancora grandi lacune legate a come si forma la matrice, come differiscono il rimodellamento fisiologico e patologico e, soprattutto, come la dinamica della matrice potrebbe essere manipolata per promuovere la guarigione e inibire la fibrosi. Attualmente non esiste un'opzione terapeutica per il controllo, la prevenzione o l'inversione della fibrosi cardiaca. Parte del motivo è probabilmente l'enorme complessità della formazione di cicatrici cardiache, come quella che si verifica dopo l'infarto del miocardio per sostituire immediatamente i cardiomiociti morti o morenti. La matrice extracellulare stessa partecipa al rimodellamento attivando le cellule residenti e anche aiutando a guidare le cellule infiltranti verso la lesione defunta. La matrice è anche una sorta di deposito per le proteine matricellulari che sono cruciali per il normale turnover della matrice, così come per la segnalazione fibrotica. È stato inoltre dimostrato che la matrice svolge un ruolo elettromeccanico nel tessuto cardiaco. La maggior parte delle tecniche per la valutazione della fibrosi non sono di natura qualitativa, ma forniscono piuttosto risultati quantitativi utili per confrontare due gruppi ma che non forniscono informazioni relative alla struttura della matrice sottostante. Di seguito è evidenziata una tecnica per visualizzare l'ultrastruttura della matrice cardiaca. La microscopia elettronica a scansione di tessuto cardiaco decellularizzato rivela notevoli differenze nella struttura che altrimenti potrebbero sfuggire utilizzando i tradizionali metodi di ricerca quantitativa.

Introduction

La fibrosi interrompe la normale rete di collagene miocardico, che è fondamentale per le normali funzioni meccanicistiche dei cardiomiociti ^1,2, nonché per la comunicazione intercellulare, la segnalazione intracellulare e la sopravvivenza cellulare ³. Lo sviluppo della fibrosi è un fattore determinante della funzione cardiaca e il rimodellamento fibrotico dell'interstizio cardiaco derivante da una varietà di eziologie porta ad un aumento della rigidità ventricolare sinistra e della disfunzione diastolica ⁴. La fibrosi miocardica può anche portare ad aritmie e, indipendentemente dal fatto che la progressione del rimodellamento fibrotico sia un fenomeno generale o locale, è altamente associata a una prognosi infausta nei pazienti con cardiomiopatia ischemica e non ischemica ⁵. Allo stesso modo, l'assenza di fibrosi miocardica è un forte predittore del recupero funzionale ventricolare e della sopravvivenza a lungo termine ⁶.

Il segno distintivo della fibrosi è la deposizione di collagene in eccesso, che ha la resistenza alla trazione dell'acciaio ⁷ e può influenzare negativamente la funzione dei cardiomiociti su più livelli. Le forze meccaniche derivanti da una matrice eccessivamente collagenica possono portare all'atrofia dei cardiomiociti ^8,9, alla rigidità passiva dei tessuti ¹⁰, alla rigidità miocardica indotta dalla contrazione tonica ^11-13 e alla riduzione dell'apporto di ossigeno alla restante popolazione di cardiomiociti. L'accoppiamento gap junction di cardiomiociti e myoFbs può anche compromettere le caratteristiche elettriche del cuore, creando un rischio maggiore per lo sviluppo di aritmie ^14-16. La fibrosi perivascolare altera la reattività vasomotoria delle arterie coronarie intramurali e delle arteriole ¹⁷ e contribuisce al restringimento luminale che riduce l'apporto di ossigeno e quindi la sopravvivenza dei cardiomiociti ^17-22. Il rimodellamento fibrotico ed elettrico patogeno, derivante da un sito iniziale di lesione ischemica o di squilibrio energetico, progredisce inevitabilmente verso l'insufficienza cardiaca.

La necrosi dei cardiomiociti avvia la risposta fibrotica e il successivo rimodellamento fibrotico avverso può verificarsi indipendentemente dall'eziologia. Trovare un modo per controllare la fibrosi cardiaca sarebbe clinicamente utile per il trattamento delle cardiomiopatie ischemiche e idiopatiche, della cardiopatia ipertensiva, della cardiomiopatia ipertrofica, della cardiopatia valvolare e delle distrofinopatie ^23-42. Indipendentemente da come inizia il processo della malattia fibrotica, i fattori profibrotici solubili possono attraversare lo spazio interstiziale e provocare l'attivazione di fibroblasti interstiziali e avventiziali in siti lontani dalla cicatrice fibrotica iniziale, creando un effetto a cascata che alla fine porta all'insufficienza cardiaca. Lo scenario ottimale sarebbe quello di sfruttare il processo fibrillogenico utilizzando una terapia mirata che può essere applicata durante la fase ipertrofica compensativa della cardiomiopatia prima che progredisca verso l'insufficienza della pompa sistolica, l'insufficienza cardiaca diastolica o altri esiti allo stadio terminale. L'obiettivo finale sarebbe quello di invertire la fibrosi in modo che i cardiomiociti morti possano essere sostituiti e la funzione cardiaca ripristinata completamente.

L'importanza della matrice è ampiamente compresa, ma i metodi per studiare la matrice sono limitati principalmente a misurazioni quantitative dei principali componenti strutturali, in particolare il collagene, e i livelli relativi di diverse proteine della matrice e della matricellulare. Questo protocollo evidenzia una tecnica raramente utilizzata che è utile per valutare le differenze qualitative nella matrice cardiaca. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per confrontare e contrastare le differenze fondamentali nelle matrici cardiache di diverse eziologie di malattie cardiache (negli espianti umani), per esaminare i cuori di suini post-infartuati trattati con l'isoforma del fattore di crescita gliale (GGF) della neuregulina-1β, rispetto agli animali non trattati ⁴³, e per sondare le differenze nelle matrici dei tessuti cardiaci da mdx topi (un modello animale comunemente usato di distrofia muscolare di Duchenne) di età diverse e confrontati con i controlli wild-type. Questa tecnica è stata introdotta per la prima volta dai dottori Caulfield e Borg nel 1979 ⁴⁴, ma da allora pochi studi hanno impiegato questa potente tecnica ^45-47, reintrodotta qui con solo lievi modifiche. Questa metodologia è un prezioso strumento di ricerca, perché fornisce informazioni qualitative sull'ultrastruttura della matrice extracellulare che altrimenti potrebbero essere trascurate quando si misura semplicemente il contenuto dei componenti della matrice e/o il livello di fibrosi.

Protocol

Etica Dichiarazione: I protocolli per la gestione degli animali sono stati approvati dalla Vanderbilt Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC, protocolli numero M / 10/117 (suini) e M / 10/219 (topi) e condotto secondo le norme AAALAC-internazionali. l'utilizzo di tessuti cardiaci umani sopraelevate è stato approvato dalla Vanderbilt University Medical center IRB (numero di protocollo 100887).

1. Raccolta e conservazione

1. Rendere fresca 4% glutaraldeide in soluzione 0,1 M tampone fosfato (PB).
   ATTENZIONE: glutaraldeide è tossico, indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante.
   1. Fare una soluzione di 0,2 m stock di PB, pH 7,4 utilizzando 21,8 g di Na ₂ HPO ₄ e 6,4 g di NaH ₂ PO _4. Quantum satis (Qs) a 1.000 ml dH ₂ O.
   2. Aggiungere 400 ml di 50% glutaraldeide al 2,5 ml di soluzione PB e 2,1 ml di dH ₂ O.
2. Immergere un pezzo (non più grande di 2 cm ²⁾ di tessuto nella soluzione di glutaraldeide 4%. Nota: pezzi di piccole dimensioni possono anche essere utilizzati, ma dovrebbero essere di dimensioni sufficienti (non inferiore a 5 mm ²⁾ per essere facilmente visualizzati da occhio per agevolare successive fasi del protocollo.
3. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, poi conservare indefinitamente a 4 ° C.

2. Decellularization del tessuto cardiaco

1. Fai la soluzione al 10% di NaOH acquosa fresca con 10 g di NaOH pellet / 100 ml dH ₂ O.
   ATTENZIONE: Le soluzioni NaOH sono corrosivi e possono causare ustioni alcali, indossano i guanti.
2. Risciacquare il tessuto in DH ₂ O.
3. Incubare in soluzione al 10% di NaOH a temperatura ambiente per 6 - 10 giorni (fino a cambiamenti del tessuto da bruno-rossastro a biancastro o bianco).
4. Risciacquare in DH ₂ O fino a quando il tessuto diventa trasparente.
5. Immergere il tessuto in acido tannico 1% per 4 ore a temperatura ambiente. Usare 1 ml 5% soluzione di riserva per 4 ml dH ₂ O.
   ATTENZIONE: L'acido tannicoè un forte irritante, indossare guanti.
6. Risciacquare in DH ₂ O durante la notte.

3. Osmication e disidratazione del tessuto cardiaco (in Cappa aspirante per la sicurezza)

1. Fare una soluzione di 0,2 m stock di tampone cacodilato di sodio con 21,4 g cacodilato di sodio, cloruro di calcio e 10,0 g 450 ml dH ₂ O. Mix, quindi aggiungere acido cloridrico come necessario per aggiustare il pH a 7,4. Qs a 500 ml con dH ₂ O.
   ATTENZIONE: cacodilato di sodio e acido cloridrico sono tossici, indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante.
2. Fai la soluzione di riserva 2% acquosa di tetrossido di osmio in cappa per la sicurezza sciogliendo 1 g di cristallo tetrossido di osmio in 50 ml di dH ₂ O.
   ATTENZIONE: tetrossido di osmio è un pericolo di inalazione grave; la fissazione di vapore di mucose o bulbi oculari è possibile, quindi, gestire solo nella cappa con i guanti. Si raccomanda un paraspruzzi.
3. Risciacquare il tessuto in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (mescolare soluzione madre 1: 1 con DH _{2 O) per 5 minuti su dei rotatori (o agitazione).}
4. Ripetere il passaggio precedente per due volte, per un totale di tre risciacqui tampone.
5. Immergere il tessuto in 1% tetrossido di osmio in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (mescolare cacodilato magazzino di sodio e magazzino tetrossido di osmio 1: 1) il rotatore per 1 ora.
6. Risciacquare tessuto in 0.1 M tampone cacodilato di sodio 3 volte per 5 minuti ciascuno su rotatore.
7. Risciacquare tessuto con concentrazioni crescenti di etanolo (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, e infine 100%) per 15 minuti ciascuno in rotatore.

4. Sezione trasversale Preparazione della superficie per SEM

1. Trasferire il tessuto in 100% di etanolo ad un piatto piano Petri contenente anche il 100% di etanolo.
2. Tenere due lamette molto taglienti tale che gli appartamenti di lati sono in contatto tra loro e taglienti croce per formare due lati di un triangolo equilatero sopra il campione. Per eseguire ciò, utilizzare la mano sinistra per posizionare una lama sul lato destro del campione etaglio verso sinistra. Al tempo stesso, utilizzare la mano destra per posizionare la seconda lama all'estrema sinistra del campione e fetta verso destra. Così, le lame vengono fatti scorrere uno contro l'altro da direzioni opposte per fare un solo taglio liscio.
3. Infilare lati lama piatta contro l'altro per effettuare un taglio molto pulito del campione con una distorsione minima o forza strappo, preferibilmente esponendo il maggior superficie possibile senza danneggiare il campione.
4. Ripetere l'operazione per ogni campione per esporre le più pulite possibili superfici di sezione per l'esame nel SEM.

5. punti critici di essiccazione (CPD) di tessuto cardiaco

1. Utilizzare una spatola o pinzette per trasferire tessuto portacampioni dell'essiccatore punto critico (CPD), assicurando che il tessuto rimanga in 100% di etanolo in ogni momento. Assicurarsi che il supporto è immerso in etanolo e che il trasferimento è realizzato con tessuto esposto all'aria per non più di pochi secondi.
2. Operare CPD per noiil manuale di ER per completare 3 spurgo-e-fill cicli di sostituire l'etanolo con anidride carbonica liquida.
3. Operare CPD per il manuale utente per raggiungere il punto di essiccazione critica dei campioni e restituirli alla pressione atmosferica con ventilazione controllata di CO _2.

6. Montaggio dei campioni Cuore tessuto per SEM

1. Preparare un campione stub SEM per ciascun campione, aderendo una linguetta adesiva carbonio alla superficie superiore dello stub alluminio.
2. Con l'ausilio di uno stereomicroscopio, aderire accuratamente il campione nella scheda adesiva con la superficie sezione di interesse rivolto verso l'alto (lontano dalla scheda, visibile), e il più vicino possibile parallelo al piano della superficie del campione stub. Non sonda o toccare la superficie di interesse.
3. Break a bastoncino di legno per ottenere una spazzola conica, ideale per l'applicazione della vernice. Applicare argento o vernice carbonio alla base e ai lati del campione, per migliorare l'aderenza allo stub.
4. Estendere una linea molto sottile di argento o carbonio vernice fino ad un bordo della superficie di interesse, per fornire un percorso di carica dalla superficie di interesse per terra.
5. Applicare 2 o 3 piccoli tocchi di argento o vernice carbonio intorno al perimetro della scheda di carbonio, per fornire un percorso conduttivo dalla superficie scheda carbonio allo stub in metallo e quindi a massa.
6. Lasciare vernice conduttiva asciugare per due ore.
7. Operare polverizzazione dispositivo a induzione per il manuale dell'utente ad applicare un rivestimento relativamente pesante (target range del 30 - 40 nm) di lega di oro-palladio o oro. Camera della pompa campione di circa 0,1 mbar; impostare timer per 40 sec. la valvola insieme aperto a 8:00 posizione (moderato flusso di gas Argon). Premere Start per avviare rivestimento sputtering a 30 mA. Viola scarica luminescente dovrebbe essere visibile nella camera campione.

7. SEM L'esame dei campioni di tessuto di cuore

1. Eseguire microscopia elettronica a scansione relativamente bassa tensione di accelerazione per minimizzare l'imaging pROBLEMI connessi ad una cattiva dissipazione carica nel campione (in carica). Suggerita condizione di imaging iniziali sono: 5 kV tensione di accelerazione, distanza di lavoro di 10 mm.
2. Con l'assistenza di un operatore esperto, impiego aumentato distanza di lavoro di estendere la profondità di campo in condizioni di imaging che richiedono attenzione di fibre in più piani focali, o fibre si estendono per lunghezza considerevole nella dimensione z.
   1. Per il microscopio usato qui (vedi Tabella dei Materiali), in l'accesso all'interfaccia utente della scheda di navigazione in alto a destra.
   2. Accedere alla scheda Coordinate dal menu stage. Per aumentare la distanza di lavoro, immettere un valore più grande in millimetri per coordinata Z poi clicca sul vai alla scheda di passare alla fase di esempio per la distanza di lavoro inserito.
3. Con l'assistenza di un operatore esperto, impiegare campione inclinazione e rotazione per posizionare la superficie di interesse ortogonale al fascio di elettroni. Ulteriori inclinazione di 10 a 30 degrSEO da questa posizione può migliorare l'osservazione e la documentazione della struttura a matrice.
   1. Per il microscopio usato qui (vedi Tabella dei Materiali), nell'interfaccia utente, cliccare e tenere premuto il tasto destro del mouse, quindi far scorrere a sinistra oa destra per mettere a fuoco il campione vicino alla periferia del piano superficie preparata di interesse, notando la distanza di lavoro focalizzato .
   2. Navigare con il Manuale joystick interfaccia utente per spostare vicino al bordo opposto della superficie e ripetere messa a fuoco. Se la distanza di lavoro non è approssimativamente uguale alla prima posizione, il campione di inclinazione per raggiungere un accordo approssimativo in entrambe le posizioni utilizzando la scheda Coordinate del menu stage (vedi 7.2) e immettere un valore di inclinazione del T di coordinate.
   3. Ruota esemplare novanta gradi (inserire il valore in R campo coordinate) e ripetere il processo fino a quando tutte le posizioni sono focalizzate approssimativamente alla stessa distanza di lavoro.
      Nota: la pressione variabile SEM può essere impiegato per migliorare la dissipazione di caricase disponibile. Alto vuoto è la modalità di funzionamento standard per la microscopia elettronica a scansione.

Results

La tecnica evidenziata è stata applicata ai tessuti cardiaci da un inutilizzato trapianto di cuore umano donatore (figura 1), i tessuti espiantati da pazienti sottoposti a trapianto, cuori da wild-type e topi distrofici (figura 3), e in campioni di cuore post-infartuati da un porco modello di danno cardiaco (Figura 2). Come mostrato in figura 1, la matrice cardiaco umano è un tessuto intricata di proteine ​​reticolate ch...

Discussion

Preparazione della superficie trasversale sezione è la fase più critica durante il protocollo. Per preservare struttura fine, i campioni devono rimanere disidratati in etanolo al 100% in ogni momento fino introdotto al processo di essiccazione punto critico. Pertanto, il taglio dei provini per ottenere superfici per l'esame EM deve essere fatto, mentre i campioni sono immerso in etanolo in un piatto piano. E 'anche fondamentale che la superficie esposta non viene toccato o sondato durante la successiva manipolaz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scienze della microscopia elettronica	del cloruro di calcio	12340	100 g
microscopia elettronica	adesiva al carbonio	12664	30 g
Linguette adesive al carbonio Scienze	microscopia elettronica	77825	ordine per adattarsi ai tronchetti
Lame di rasoio a doppio taglio Acciaio inossidabile	Ted Pella, Inc	121-6	250/pkg
Etanolo	Elettronico Microscopia Scienze	15055	450 ml
Gluteraldeide, soluzione al 50%	Microscopia elettronica Scienze	16310	grado EM, distillazione purificata
Acido cloridrico Microscopia elettronica	Scienze	16760 o 16770	100 ml
Fosfato monosodico NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
Osmio Microscopia elettronica a tetrossido		Scienze 19100	1 g
Microscopia elettronica	adesiva conduttiva argento	Scienze 12686-15	15 g
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
Acido tannico, 5% Acquoso	Microscopia elettronica Sciences	21702-5	500 ml
Triidrato di sodio cacodilato Microscopia	elettronica Scienze	12300	100 g
Lega d'oro-palladio o	sistemi di raffinazione dell'oro, Inc.	varia	in base alla marca e al modello del rivestimento per polverizzazione catodica
Essiccatore per punti critici	Microscopia elettronica Scienze	850
Applicatori in legno semplice	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 SEM ambientale FEI		Q250 SEM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Modello 108
Stub di campioni SEM in alluminio	Microscopia elettronica Scienze	75220-12	specifiche per il miscroscopio