Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Summary

Il rilevamento della fluorescenza multicolore nella microfluidica delle goccioline coinvolge tipicamente sistemi di rilevamento basati su microscopi a epifluorescenza ingombranti e complessi. Qui descriviamo uno schema di rilevamento multicolore compatto e modulare che utilizza una serie di fibre ottiche per codificare temporalmente i dati multicolore raccolti da un singolo fotorivelatore.

Abstract

I saggi di fluorescenza sono le letture più comuni utilizzate nella microfluidica delle goccioline grazie ai loro segnali luminosi e alla rapida risposta temporale. Applicazioni come i saggi multiplex, l'evoluzione enzimatica e la selezione cellulare potenziata dalla biologia molecolare richiedono la rilevazione di due o più colori di fluorescenza. I sistemi di rilevamento multicolore standard che accoppiano i laser a spazio libero ai microscopi a epifluorescenza sono ingombranti, costosi e di difficile manutenzione. In questo articolo, descriviamo uno schema per eseguire il rilevamento multicolore eccitando regioni discrete di un canale microfluidico con laser accoppiati a fibre ottiche. La luce emessa viene raccolta da una fibra ottica accoppiata a un singolo fotorivelatore. Poiché l'eccitazione si verifica in diverse posizioni spaziali, l'identità della luce emessa può essere codificata come uno spostamento temporale, eliminando la necessità di schemi di filtraggio della luce più complicati. Il sistema è stato utilizzato per rilevare popolazioni di goccioline contenenti quattro combinazioni uniche di coloranti e per rilevare concentrazioni sub-nanomolari di fluoresceina.

Introduction

Microfluidica gocciolina forniscono una piattaforma per alta biologia throughput compartimenti esperimenti in un gran numero di goccioline acquose sospese in un olio vettore ^1. Goccioline sono stati utilizzati per applicazioni vari come singola analisi cella ^2, la reazione a catena della polimerasi digitale (PCR) ^3, ed enzimi evoluzione ^4. saggi fluorescenti sono la modalità standard di rilevamento per microfluidica di gocce, come i loro segnali luminosi e tempo di risposta veloce sono compatibili con la rilevazione dei volumi goccioline sub-nanolitri a tassi kilohertz. Molte applicazioni richiedono il rilevamento della fluorescenza per almeno due colori simultaneamente. Per esempio, il nostro laboratorio esegue comunemente PCR-attivata esperimenti gocciolina ordinamento che utilizzano un canale di rilevamento per il risultato di un test, e utilizza uno sfondo tintura secondaria per rendere gocciolina test negativo numerabile ^5.

stazioni di rilevamento tipiche per microfluidica droplet sono based su microscopi epifluorescenza, e richiedono complicati sistemi di manipolazioni di luce per introdurre luce di eccitazione da laser spazio libero nel microscopio ad essere focalizzata sul campione. Dopo fluorescenza viene emessa da una goccia, la luce emessa fluoresced è filtrato in modo che ciascun canale di rilevamento utilizza un tubo fotomoltiplicatore (PMT) centrata su una banda di lunghezze d'onda. sistemi di rilevamento ottico epifluorescenza microscopio a base di fornire una barriera all'ingresso a causa della loro spese, la complessità e la manutenzione necessari. Fibre ottiche forniscono i mezzi per costruire un sistema di rilevamento semplificata e robusta, in quanto le fibre possono essere inseriti manualmente in dispositivi microfluidici, eliminando la necessità di instradamento specchio luce-based, e consentendo percorsi di luce da interfacciare tramite connettori di fibre ottiche.

In questo articolo, si descrive l'assemblaggio e la validazione di un sistema di compatto e modulare per eseguire il rilevamento della fluorescenza multicolore utilizzando una vasta gamma di fibre ottiche unda singola cellula fotoelettrica ^6. Le fibre ottiche sono accoppiati alle singole laser e sono inseriti normale ad un canale di flusso a forma di L in offset spaziali regolare. Una fibra raccolta fluorescenza è orientato parallelamente alle regioni di eccitazione ed è collegato ad un singolo PMT. Poiché una gocciolina passa attraverso i raggi laser in tempi diversi, i dati registrati dal PMT mostra un temporale di offset che consente all'utente di distinguere tra la fluorescenza emessa dopo la gocciolina viene eccitato da ciascun fascio laser distinti. Questo spostamento temporale elimina la necessità di separare la luce emessa PMT separate mediante una serie di specchi dicroici e filtri passa-banda. Per convalidare l'efficacia del rivelatore, abbiamo quantificare la fluorescenza nelle popolazioni gocciolina incapsulanti tinture di colore e concentrazione diversa. La sensibilità del sistema è studiato per il rilevamento singolo colore fluoresceina, e dimostra la capacità di rilevare goccioline con concentrazioni fino a 0,1 nM, una sensibilità impr 200xovement rispetto agli approcci a base di fibre recenti riportati in letteratura ^7.

Protocol

1. SU8 Maestro Fabrication

1. Progettare le strutture microfluidica per la fabbricazione di tre strati che utilizzano software di progettazione e hanno i disegni stampati da un fornitore su pellicola circuito con risoluzione di 10 micron. I dettagli della progettazione dei dispositivi sono forniti in un riferimento collegato ⁶ e le geometrie dei canali nella figura 1. Gli strati dovrebbero includere segni di allineamento per aiutare colloca caratteristiche di ogni strato fabbricazione ^8.
2. Posizionare un wafer di silicio del diametro di 3 pollici di pre-pulizia su un dispositivo a induzione giro e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30 sec a 1.750 rpm, fornendo uno spessore di 80 micron.
3. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 min. Lasciare il wafer raffreddare a RT prima di passare alla fase successiva.
4. Esporre il wafer rivestito alla ^st maschera 1 strato sotto un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra C 135 ° per 1 min, poi raffreddare a RT prima di procedere alla fase successiva.
5. Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 5000 rpm, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 40 micron.
6. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
7. Allineare la maschera di livello 2 ^° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 4 minuti e 30 secondi, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
8. Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30sec a 1.000 giri, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 100 micron.
9. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
10. Allineare la maschera di livello 3 ^° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 9 minuti, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
11. Sviluppare le maschere immergendo in un bagno agitata di propilenglicole monometiletere acetato per 30 min. Lavare il wafer in isopropanolo e cuocere su una piastra C 135 ° per 1 min. Posizionare il maestro sviluppato in una capsula di Petri 100 mm per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio.

2. PDMS fabbricazione di dispositivi

1. Preparare 10: 1 PDMS combinando 50 g di base siliconica con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto con un utensile rotante dotato di un bastoncino. degquando la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
2. Versare il PDMS per dare uno spessore di 3 mm sopra il master e inserire di nuovo nel essiccatore per un ulteriore degasaggio. Una volta che tutte le bolle vengono rimossi, cuocere il dispositivo a 80 ° C per 80 min.
3. Tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi e posto su una superficie pulita con il lato modellato e pugni gli ingressi e le uscite fluidici con un pugno biopsia 0,75 millimetri. Il dispositivo deve essere tagliato in modo che i 120 micron e 220 micron geometrie alte sono accessibili dal lato del dispositivo.
4. Plasma trattare il dispositivo, con il lato caratteristica, insieme con un pre-puliti 2 pollici da 3 pollici vetrino a 1 mbar O ₂ al plasma per 20 secondi in un pulitore di plasma di 300 W. Incollare il dispositivo PDMS ponendo il lato modellato del dispositivo PDMS sul lato plasma trattata del vetrino. Posizionare il dispositivo in forno a 80 ° e cuocere il dispositivo montato per 40 min.
5. Render i canaliidrofobica utilizzando una siringa per sciacquare il dispositivo con un fluido di trattamento superficiale fluorurato. cuocere immediatamente il dispositivo a 80 ° C per 10 minuti per evaporare il solvente.

3. Preparazione di componenti ottici

1. Preparare la fibra di eccitazione laser rimuovendo l'isolamento dall'ultima 5 mm a 105 micron nucleo, 125 rivestimento micron, NA = 0,22 fibra ottica.
2. Preparare il 2 ^° laser a colori in fibra di eccitazione ripetendo 3.1 per un 2 ^° fibra identici.
3. Preparare la fibra per raccogliere il segnale di fluorescenza ripetendo 3.1 di 200 micron nucleo, 225 rivestimento micron, NA = 0,39 fibra ottica.
4. Ispezionare le punte di tutte le fibre - se le punte non terminano in una superficie piana, ri-fendere le estremità con uno scriba fibra.
5. Attaccare un accoppiatore fibra laser a 50 mW, 405 nm laser e collegare uno dei 105 micron fibre nucleo al laser. Dirigere il fine spogliato verso il sensore della potenza del lasermetro, e usare le regolazioni fini del copulante laser per massimizzare la potenza del laser.
6. Ripetere 3.5 per un laser nm 50 mW, 473.
7. Montare un 446/510/581/703 nm filtri passa-banda quad sulla PMT utilizzando tubi di lenti per bloccare la luce del laser e trasmettere fluorescenza emessa. Fissare fibra accoppiatore in modo che la luce viaggia attraverso i filtri prima di colpire il PMT.
8. Fissare la fibra da 3,3 all'unità assemblati in 3.7.

4. Offline misto Emulsione Generation

1. Ottenere un dispositivo di microfluidica dropmaker fuoco flusso con un 60 micron x 60 micron orifizio.
2. Riempire una siringa da 1 ml con HFE 7500 oli con 2% fluoro ionico ^9.
3. Riempire una serie di 1 ml siringhe con le seguenti combinazioni di fluoresceina (FITC) e destrano coniugato coloranti blu (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, e 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. Montare il dispositivo dropmaker sul palco di un micro invertitifar fronte e le siringhe acquosi e olio su pompe a siringa. Coppia le siringhe ai dispositivi che utilizzano PE-2 tubi.
5. Esecuzione pompe a siringa a 500 microlitri / hr per l'olio e 250 microlitri / hr per le soluzioni acquose, crea una miscela di 80 micron goccioline contenenti le soluzioni da 4.3. Per ogni tipo di campione acquoso, utilizzare un dispositivo dropmaker fresca per evitare contaminazioni. Raccogliere ~ 200 ml di emulsione da ogni combinazione colorante in una siringa vuota.
6. Dopo 4 tipi goccioline sono stati raccolti in una singola siringa raccolta, mescolare l'emulsione ripetutamente ruotando la siringa.
7. Ripetere i passaggi 4,2-4,6 con soluzioni acquose contenenti 0,1, 1, 10, e 100 nM FITC in PBS.

5. Fibra ottica Inserimento

1. Posizionare il chip microfluidico fabbricato nella fase 2 sul palcoscenico di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di <100 msec tempi di posa.
2. Lavorare con attenzione di lato, Insert la fibra accoppiata al laser 473 nm in 120 canale più lontano upstream micron, facendo attenzione a non forare attraverso il canale di flusso principale.
3. Inserire la fibra accoppiata al laser 405 nm nel 120 micron canale di alta lato più a valle, fornendo la spaziatura fibra di 300 micron.
4. Inserire la fibra PMT-accoppiato nel 220 micron di altezza canale normale per le due fibre di eccitazione laser.

6. Rilevazione fluorescenza di emulsioni misti

1. Montare una siringa da 5 ml riempito con HFE 7500 con 2% fluoro ionico all'ingresso dell'olio distanziale del dispositivo di rilevazione con PE-2 tubi.
2. Montare la siringa contenente il misto FITC / CB emulsione su una pompa a siringa con orientamento verticale e di coppia di ingresso di gocce di reiniezione del dispositivo utilizzando PE-2 tubi. Collegare un tratto di tubo PE-2 dall'uscita dispositivo ad un contenitore per rifiuti.
3. Prime dispositivo eseguendo ciascuna delle pompe a 1.000 ml / h fino a quando entrambipetrolio e goccioline sono visti da combinare regolarmente nel dispositivo e che scorre a valle.
4. Regolare le portate in modo tale che l'olio distanziale corre a 6.000 ml / hr e le goccioline a 100 l / h, che fornisce notevole spaziatura tra le goccioline che viaggiano attraverso la regione di rilevamento.
5. Accendere i laser, avviare il programma di acquisizione dei dati, e regolare il guadagno PMT per fornire segnali che sono più di 100 volte il rumore di fondo della linea di base. Regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi doppietto sono chiaramente visibili una singola, timetrace linearmente scalato.
6. Acquisire 60 sec del timetrace tensione di PMT ad almeno 20 kHz. Importare i dati in programma di calcolo come Matlab e misurare le altezze dei picchi dei doppietti registrati utilizzando lo script del programma di calcolo personalizzato.
   NOTA: Questo è fornito come informazioni supplementari.
7. Ripetere i passaggi 6,2-6,7 con il FITC solo emulsione mista creata in 4.7, con il laser 405 nm spento.

Results

Realizzazione di un dispositivo PDMS che permette l'inserimento di fibre ottiche richiede una procedura di fotolitografia multistep per creare canali di diversa altezza (figura 1). Innanzitutto, un 80 micron alto strato di SU-8 è filata su un wafer di silicio e modellato usando una maschera per creare la geometria gestione dei fluidi. Quindi, un ulteriore strato di 40 micron di SU-8 è filata sul wafer, e modellato usando una seconda maschera per creare caratteristiche ch...

Discussion

rilevamento a fibre ottiche richiede l'allineamento delle fibre ottiche rispetto ai canali di fluido. Poiché il nostro dispositivo utilizza canali di guida fabbricati con fotolitografia multistrato, collocamento di maschere rispetto all'altro è di grande importanza. Se i canali di guida fibra sono troppo vicino al canale del fluido, vi è un potenziale di fuoriuscita di fluido; se i canali di guida sono situate troppo lontano o disallineata, il segnale di fluorescenza raccolte dalla fibra rilevamento può essere s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fotomaschere	CadArt Servcies
3" wafer di silicone, tipo P, grado di prova vergine	Wafer universitari	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 kit di elastomeri siliconici	Krayden	4019862
siringhe da 1 ml	BD
siringhe da 10 ml	BD	309604
27 aghi gaugue	BD	305109
PE 2 tubo in polietilene	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Comunemente noto come HFE 7500 Istruzioni per la sintesi del
tensioattivo			in ref #10
Colorante blu a cascata coniugato a destrano	Life Technologies	D-1976
Sale sodico di fluoresceina	Sigma	28803
Filtro	passa-banda quadruploSemrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Porta in fibra	Thorlabs	PAFA-X-4-A
tubo dell'obiettivo	Thorlabs	SM1L05
Cavo patch con 200 μ m nucleo / 225 μ m rivestimento in fibra ottica con un'estremità spelata e un connettore FC/PC	personalizzato		Thorlabs
con 105 μ nucleo m / 125 μ m rivestimento in fibra ottica con un'estremità spellata e un connettore FC/PC	Thorlabs	Custom
125 μ m utensile spelafili	per fibre Thorlabs	T08S13
225 μ m strumento di spelatura della fibra	Thorlabs	T10S13
adattatore fibra laser	OptoEngine	FC / PC Adattatore
405 nm CW laser a 50  mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distributore per laser CNI
473 nm CW laser a 50  mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50