Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
organoidi intestinali primarie sono un modello di sistema di valore che ha il potenziale per avere un impatto significativo nel campo delle mucose immunologia. Tuttavia, la complessità delle caratteristiche di crescita organoide portano avvertimenti significativi per l'investigatore. In particolare, i modelli di crescita di ogni singolo organoide sono molto variabili e creano una popolazione eterogenea di cellule epiteliali in coltura. Con tali limitazioni pratiche coltura tissutale comune non possono essere semplicemente applicate al sistema organoide a causa della complessità della struttura cellulare. Conteggio e placcatura basato esclusivamente sul numero di cellule, che è comune a cellule separate individualmente, quali le linee cellulari, non è un metodo affidabile per organoidi se viene applicata una tecnica di normalizzazione. Normalizzazione al contenuto totale di proteine è fatta complessa a causa della matrice proteica residente. Queste caratteristiche in termini di numero di cellule, forma e tipo di cellula dovrebbero essere presi in considerazione quando si valuta con secretotende dalla massa organoide. Questo protocollo è stato generato per delineare una procedura semplice per la cultura e il trattamento di piccoli organoidi intestinale con agenti patogeni microbici e pamp (PAMPs). Si sottolinea, inoltre, le tecniche di normalizzazione che dovrebbero essere applicate quando l'analisi delle proteine sono condotte dopo una tale sfida.
Introduzione
La capacità di raccogliere e organoidi coltura primaria sono stati descritti per intestino tenue, colon, pancreas, fegato e cervello e sono progressi entusiasmanti germano per comprendere un fenomeno fisiologicamente più rappresentativo per la biologia dei tessuti 1-5. I primi metodi che descrivono la cultura e la manutenzione di piccoli organoidi intestinale è stata riportata da Sato et al. Fuori dal laboratorio di Hans Clevers 1. Prima di questo metodo, la raccolta e la coltura di cellule epiteliali intestinali primarie ha dimostrato di essere limitato e inefficace nel sostenere la crescita delle cellule epiteliali. Metodi incluse dis....
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Protocollo
Tutte le ricerche è stato approvato e condotto secondo le linee guida Virginia Tech IACUC
1. Preparare R-Spondin1 condizionata media Da HEK293T-Rspo1 Cell Line
- Generazione di cellule HEK293T-Rspondin1 è stata precedentemente descritta 10. Seme HEK293T-Rspondin1 cellule secernenti al 5-10% di confluenza, circa 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 cellule, in un pallone T-175 con 40 ml di 1x Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% siero fetale bovino ( FBS) come mezzi di crescita e incubare a 37 ° C + 5% CO 2.
NOTA: I media di crescita per le cellule che secernono HEK293T-Rspondin1 servirà come R-spondin1 condiz....
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Risultati
Quando si segue questo protocollo per coltivare organoidi intestinali, caratteristica a forma di sfera organoidi saranno presenti dopo la raccolta. L'aggiunta di R-spondin1 mezzi condizionati ogni giorno avvierà la crescita e la gemmazione delle organoidi. La crescita di organoidi è mostrato in Figura 1A - F e rappresentativa organoidi intestinali nei giorni 1, 2, 4, 5, 6 e il giorno 14. Figura 1F rappresenta le cara.......
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Discussione
La cultura e la manutenzione di organoidi intestinali è una procedura che può essere masterizzato da qualsiasi persona con la tecnica di coltura tissutale adeguata. Ci sono sottigliezze in passaging rispetto a crescere le cellule in un monostrato più convenzionale, ma queste sottigliezze non sono difficili da superare. I passaggi critici di questo metodo comporta poter far crescere le organoidi ad una densità sufficientemente elevata per la semina ottimale. Gli esperimenti devono essere ridimensionati con organoidi come.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel e Bettina Heid per le discussioni tecniche. Gli autori ringraziano la dottoressa Nanda Nanthakumar per aver fornito le cellule Caco-2. Gli autori ringraziano anche il Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) della Virginia Tech. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (all'I.C.A.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Sezione 1,3,6) O marca equivalente |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Sezione 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Sezione 1,6) Per le cellule Caco-2 e HEK293 Rspondin1 |
| Linea cellulare | secernente HEK293T-Rspondin1(Sezione 1) Descritto e modificato da Kim, K.A. et al. Le particelle lentivirali contenevano cDNA RSPO1(NM_138683) ORF clonato in una dorsale pReceiver-Lv105 ordinata e acquistata su misura da GeneCopoeia. | ||
| Tubo conico da 50 ml | Falcon | 352070 | (Sezione 1) O borraccia |
| T-175 di | Corning | 431079 | (Sezione 1) O marca equivalente. |
| Matrice proteica | Corning | 356231 | (Sezione 2,3,4,5,6) Matrigel Fattore di crescita ridotto |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Sezione 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Sezione 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 pozzetti TC Piastre | Corning | 3524 | (Sezione 2) |
| Supplemento N2 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Sezione 2) |
| B27 senza vitamina A 50 volte | Tecnologie per la vita | 12587-010 | (Sezione 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Sezione 2) |
| Integratore di glutammina (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Sezione 2) Può combinarsi con Advanced DMEM / F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Sezione 2) Può combinarsi con Advanced DMEM / F12 |
| 10 ml di pipetta sierologica | Falcon | 357551 | (Sezione 2) O marca equivalente |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Sezione 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-acetil-L-cisteina | Sigma-Aldrich | A9165 | (Sezione 2) Stock = 1 M |
| topo ricombinante EGF | Biolegend | 585608 | (Sezione 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Sezione 3) | |
| da dissezione | (Sezione 3) | ||
| pinze | (Sezione 3) | ||
| vetrini | (Sezione 3) | ||
| pinzette | (Sezione 3) | ||
| 25 ml Sierologico Pipet | Falcon | (Sezione 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Sezione 3) 0,5 M o alternativa Piastra |
| 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | (Sezione 3) O piastra TC di dimensioni uguali |
| Siringa da 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | (Sezione 4) |
| Ago di scorrimento di precisione | Becton Dickinson | 305120 | (Sezione 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm) |
| Flagellina da Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Sezione 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Sezione 5,6) ( Murray et al.) |
| Emocitometro | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Sezione 5,6) O marca equivalente |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Sezione 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Sezione 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Sezione 6) |
| Tripsina | gibco | 25200056 | (sezione 6) |
| Metanolo | Fisher | A412-4 | (Sezione 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Sezione 6) | |
| 96 Piastra per saggi | a pozzetti Corning | 3603 | (Sezione 6) Piastra nera, fondo trasparente Trattato TC |
| Colorante | Tecnologie per la vita | H1399 | (sezione 6) Pallone Hoechst 33342 |
| T-75 | Corning | 430641 | (Sezione 6) O marca equivalente |
| Tubo conico da 15 ml | Falcon | 352096 | (Sezione 1,3) O marca equivalente |
| Tubo in polipropilene da 1,7 ml | Bioexpress | C-3262-1 | O marca equivalente |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | O marca equivalente |
| TNF-alpha | il test di espressione genica | Mm 00443260_g1 | Taqman Applied Biosystems |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 Kit per | il test di espressione genica Taqman |
| IL-1beta | Applied Biosystems | il test di espressione genica Mm 00434228_m1 Taqman | |
| IL-18 | Applied Biosystems | il test di espressione genica Mm 00434225_m1 Taqman | |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman |
| 7500 Sistema PCR veloce in tempo reale | Applied Biosystems | ||
| Mastercycler a gradiente Nexus | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzetti, 0,1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | ||
| Proteina R-spondina 1 ricombinante di topo | R& D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| cloroformio | Sigma-Aldrich | C7559 |
Riferimenti
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelia....
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Ristampe e permessi
