Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
particelle virus-simili (VLP) e particelle subvirale (SVP) sono un approccio alternativo per la progettazione di vaccini virali che offre i vantaggi di una maggiore sicurezza biologica e stabilità oltre l'uso di agenti patogeni dal vivo. Non infettive e di auto-assemblaggio, VLP sono utilizzati per presentare proteine strutturali come immunogeni, bypassando la necessità di agenti patogeni dal vivo o vettori virali ricombinanti per la consegna antigene. In questo articolo, abbiamo dimostrato le diverse fasi di progettazione VLP e sviluppo per applicazioni future in sperimentazione animale preclinico. Il procedimento comprende le seguenti fasi: selezione di antigene, espressione dell'antigene in linea cellulare di scelta, purificazione di VLP / SVP, e quantificazione per il dosaggio dell'antigene. Dimostriamo uso di entrambe le linee cellulari di mammiferi e insetti per l'espressione dei nostri antigeni e dimostrare come le metodologie differiscono nella resa. La metodologia presentata può applicare a una varietà di agenti patogeni e può essere ottenuto sostituendo gli antigeni con str immunogenicoproteine uctural di microrganismo dell'utente di interesse. VLP e SVP assistono con caratterizzazione dell'antigene e la selezione dei migliori candidati vaccini.
Introduzione
particelle virus-simili (VLP) sono una tecnologia approvata per la vaccinazione umana. In effetti, alcuni dei vaccini più contemporaneamente in licenza, tra cui il papillomavirus umano (HPV) e l'epatite Β (HepΒ) vaccini impiegano questo metodo. VLP sono formate da proteine strutturali in grado di auto-assemblaggio. Le particelle assemblate imitano morfologie virali, ma non possono infettare o replicare perché non hanno genomi virali. VLP possono essere espressi e purificati da un certo numero di sistemi procariotici ed eucariotici. Una revisione della letteratura ha rivelato che diversi sistemi di espressione sono impiegati alle seguenti tariffe: batteri - 28%,....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. sistema mammifero di espressione per la generazione di influenza H3N2 VLP
- Sottoclone virale glicoproteine strutturali emoagglutinina (HA), neuraminidasi (NA), e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) Gag p55 in vettori di espressione eucariotica, come descritto in precedenza pTR600. 7
- Amplificare il DNA in Escherichia coli chimicamente competente (ad esempio, DH5α) e isolare trasfezione-grade plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore. Quantità di DNA dipende dalla resa e le esigenze degli utenti.
- Mantenere linea cellulare di mammifero, 293T, in terreni di ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
rendimenti VLP erano variabili in base alla progettazione di antigene virale costrutto. In questo protocollo, abbiamo dimostrato l'uso di cellule di insetto e di mammiferi per la produzione di SVP o VLP nel surnatante e purificazione da ultracentrifugazione. Quattro sottotipi di DENV PRM / E gene strutturale cassette di espressione sono stati usati per costruire le versioni di DENV SVP (delimitate da 1-4) nella tabella 1 e dimostrare un range compreso tra 1,1-2,6 mg .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbiamo usato le tecniche sopra descritte per esprimere con successo e purificare SVP e VLP composti da più proteine strutturali di vari agenti patogeni. In generale, usiamo sistemi di espressione di mammifero per generare i nostri VLP. Tuttavia, nelle nostre mani, dei mammiferi cellule derivate Chik rendimenti VLP erano bassi. CHIK resa VLP è stato più robusto quando si utilizza un sistema di celle baculovirus-insetto ricombinante. In generale, baculovirus-insetti sistemi cellulari producono una maggiore quantità di .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vogliamo riconoscere i membri precedenti del laboratorio Ross che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo per la massima efficienza e rendimento.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Maxi kit di plasmidi | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Sistema di espressione del baculovirus | Life Technologies | 10359-016 | |
| Piastra di agitazione multipunto Cimarec I 6 | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Provette per ultracentrifuga Polyclear | Seton | 7025 | Confermare le provette appropriate per l'ultracentrifuga e le dimensioni del secchio |
| Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Tampone citrato fosfato | Sigma | P4922 | |
| o-fenilendiammina dicloridrato | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μ m filtro sottovuoto superiore (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glicerolo | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Riferimenti
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug De....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
