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Articolo metodologico

Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione

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DOI:

10.3791/54041

⸱

2 giugno 2016

 ,  , 
1Center for Vaccines and Immunology, Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.

Abstract

particelle virus-simili (VLP) e particelle subvirale (SVP) sono un approccio alternativo per la progettazione di vaccini virali che offre i vantaggi di una maggiore sicurezza biologica e stabilità oltre l'uso di agenti patogeni dal vivo. Non infettive e di auto-assemblaggio, VLP sono utilizzati per presentare proteine ​​strutturali come immunogeni, bypassando la necessità di agenti patogeni dal vivo o vettori virali ricombinanti per la consegna antigene. In questo articolo, abbiamo dimostrato le diverse fasi di progettazione VLP e sviluppo per applicazioni future in sperimentazione animale preclinico. Il procedimento comprende le seguenti fasi: selezione di antigene, espressione dell'antigene in linea cellulare di scelta, purificazione di VLP / SVP, e quantificazione per il dosaggio dell'antigene. Dimostriamo uso di entrambe le linee cellulari di mammiferi e insetti per l'espressione dei nostri antigeni e dimostrare come le metodologie differiscono nella resa. La metodologia presentata può applicare a una varietà di agenti patogeni e può essere ottenuto sostituendo gli antigeni con str immunogenicoproteine ​​uctural di microrganismo dell'utente di interesse. VLP e SVP assistono con caratterizzazione dell'antigene e la selezione dei migliori candidati vaccini.

Introduzione

particelle virus-simili (VLP) sono una tecnologia approvata per la vaccinazione umana. In effetti, alcuni dei vaccini più contemporaneamente in licenza, tra cui il papillomavirus umano (HPV) e l'epatite Β (HepΒ) vaccini impiegano questo metodo. VLP sono formate da proteine ​​strutturali in grado di auto-assemblaggio. Le particelle assemblate imitano morfologie virali, ma non possono infettare o replicare perché non hanno genomi virali. VLP possono essere espressi e purificati da un certo numero di sistemi procariotici ed eucariotici. Una revisione della letteratura ha rivelato che diversi sistemi di espressione sono impiegati alle seguenti tariffe: batteri - 28%, lievito di birra - 20%, impianto - 9%, insetto - 28%, e di mammiferi - 15% 1. Da segnalare, vaccini HPV a base di proteine ​​del capside L1 sono prodotte nel lievito (Gardasil) o in un sistema di cellule di insetto (Cervarix) 2. Vaccini HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, sono prodotti anche nel lievito, e sono composti da HepΒ antigene di superficie 3, 4.

Usiamo sistemi di espressione di cellule di mammiferi e insetti per la produzione di VLP che richiedono co-espressione di molteplici proteine ​​strutturali per il montaggio. Il nostro lavoro si concentra sulla progettazione, produzione, e di vaccini VLP-based di depurazione contro gli agenti patogeni umani: virus dell'influenza, virus respiratorio sinciziale (RSV), virus della dengue (DENV), e virus Chikungunya (CHIKV). I nostri metodi sono sufficientemente flessibili per permettere co-espressione delle molteplici proteine ​​strutturali da più plasmidi di espressione, o un singolo plasmide di espressione (Figura 1). In precedenza, abbiamo prodotto e purificato H5N1 VLP assemblato dalla co-espressione di plasmidi che codificano emoagglutinina influenza (HA), neuraminidasi (NA), e matrice (M1) in embrionali cellule 293T renali umane 5,6. I geni sono stati codone-ottimizzati per l'espressione in cellule di mammifero e clonati in pTR600, un vettore di espressione eucariotica contenente i citomegalovirus immediato inizio promotore più INTRON A per avviare transcrizione di inserti eucariotiche e il segnale di poliadenilazione ormone della crescita bovina per la terminazione della trascrizione 7. Un approccio simile utilizzando tre plasmide co-espressione di HA, NA (Figura 1A) e una proteina della matrice virale alternativa, HIV Gag p55, è stato utilizzato per la generazione di influenza stagionale sottotipo umana H3N2 VLP in questo studio e ha dimostrato di generare VLP di dimensioni simili come particelle influenzali 8. Anche se vaccini contro l'influenza prevalentemente suscitano anticorpi anti-HA, l'aggiunta di neuraminidasi dell'influenza media attività sialidasi per consentire VLP in erba da cellule trasfettate 9 e presenti anche gli obiettivi immunogenico aggiuntivi. Per produrre RSV VLP, abbiamo anche scelto il nucleo non collegato di HIV Gag per progettare vaccini prototipo che presentano glicoproteine ​​di superficie esclusivamente RSV per dimostrare ulteriormente la flessibilità della formazione VLP con HIV Gag, come descritto in precedenza e caratterizzato da microscopia elettronica 6,10. Altrihanno precedentemente dimostrato che VLP presentando glicoproteine ​​RSV possono essere assemblati utilizzando vari componenti virali da virus della malattia di Newcastle (NDV) 11, e l'influenza di matrice 12. Full-length sequenze glicoproteina di superficie sono stati utilizzati in questo studio per mantenere conformazioni nativi che possono essere necessari per il recettore funzionale di legame e il dosaggio degli anticorpi riconoscimento attraverso test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

I nostri esempi di utilizzo di sistemi di singola espressione plasmide per generare particelle sono DENV e CHIKV. Nel caso di DENV, possiamo produrre particelle subvirale (SVP) senza capside in cellule 293T da un singolo plasmide contenente un PRM / E gene strutturale cassetta di espressione 13. Il termine SVP viene usato per indicare la mancanza di una proteina core o capside nell'assemblaggio di proteine ​​strutturali virali. CHIK VLP può anche essere prodotto utilizzando un singolo plasmide contenente un CHIKV cassette gene strutturale, capside codifica e busta proteine, o in icellule nsect infettando con un baculovirus ricombinante che codifica per la stessa cassetta gene strutturale ottimizzato per l'espressione di cellule di insetto (Figura 1B - C).

Il risultato finale dell'espressione approcci sopra discusso è il rilascio di VLP nel mezzo di coltura cellulare che possono poi essere purificato mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino glicerolo 20%. In questo rapporto, presentiamo i metodi per esprimere e purificare queste VLP da sistemi cellulari di mammiferi e insetti.

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Protocollo

1. sistema mammifero di espressione per la generazione di influenza H3N2 VLP

  1. Sottoclone virale glicoproteine ​​strutturali emoagglutinina (HA), neuraminidasi (NA), e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) Gag p55 in vettori di espressione eucariotica, come descritto in precedenza pTR600. 7
  2. Amplificare il DNA in Escherichia coli chimicamente competente (ad esempio, DH5α) e isolare trasfezione-grade plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore. Quantità di DNA dipende dalla resa e le esigenze degli utenti.
  3. Mantenere linea cellulare di mammifero, 293T, in terreni di coltura contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C con 5% di CO 2 in un incubatore umidificato.
  4. Crescere le cellule in modo che un pallone di coltura tissutale T-150 contiene 45-75 x 10 6 cellule per fiasco tale che matraccio ottiene completa adesione delle cellule e cellule confluenza 85-95% entro il giorno successivo. Ispezionare le cellule sotto il microscopio per conflu desideratorenza.
    Nota: ad alta densità cellulare è in genere consigliato di cedere l'espressione della proteina ottimale con il minimo citotossicità utilizzando reagenti di trasfezione commerciali comunque un eccesso di confluenza può causare l'accumulo di rifiuti cellulari sottoprodotti e ridurre la vitalità cellulare.
  5. Il giorno della transfezione, preparare liposomi e la miscela di DNA secondo le raccomandazioni del costruttore e trasfezione le cellule del DNA con una composizione del DNA di 1: 1: 2 di HA: NA: Gag con una quantità di DNA totale di 40 mcg per pallone T-150. Diluire soluzioni di DNA e liposomi in mezzi trasfezione privo di siero senza antibiotici tale che ciascun pallone contenente un volume totale di 20-30 ml.
    Nota: Rapporto tra costrutti genici può richiedere l'ottimizzazione degli utenti. Sebbene non dimostrato qui, una procedura di trasfezione simile è stata eseguita con il virus respiratorio sinciziale (RSV) F e HIV Gag ad un rapporto 1: 1. Per DENV e CHIKV plasmidi singola espressione, per un totale di 20 mg di DNA per T-150 pallone sono utilizzati per la ottimale eXpression. DNA: transfezione rapporti reagenti sono ottimizzati utente. Uso consigliato media transfezione basato sul metodo di trasfezione, vale a dire, trasfezioni lipidi policationici raccomandano riduzione o assenza di siero fetale bovino in tal modo i media possono essere completate con ormoni della crescita e oligoelementi per sostenere la crescita in assenza di siero.
  6. Rientro palloni a 37 ° C con 5% di CO 2 incubatore. Per un volume di 200 ml, utilizzare 9 T-150 palloni. Le cellule vengono mantenute in mezzo di coltura trasfezione fino al giorno del raccolto VLP.
  7. Harvest cultura surnatante dalle cellule dopo 72-96 ore dopo la trasfezione seconda antigene, o quando vitalità cellulare è sceso a 70-80%, come stimato mediante ispezione al microscopio. Trasferire il surnatante in 50 ml provette coniche e far girare le celle in basso a 500 g per 5 minuti a 4 ° C per far sedimentare i detriti cellulari.
    Nota: La sostituzione di tre giorni surnatante con pre-riscaldato, privo di siero dei media trasfezione fresco di cellule aderenti saranno yielda secondo lotto di VLP con rendimento simile o leggermente ridotto e deve essere ottimizzato dall'utente.
  8. Pool surnatante e filtro attraverso una membrana 0,22 micron pori prima sedimentazione tramite ultracentrifugazione.
  9. Testare l'attività emoagglutinazione dei VLP HA-esprimono mediante test di emoagglutinazione standard di 14 utilizzando lo 0,8% di tacchino o di globuli rossi dei mammiferi o procedere con ELISA antigene-specifica. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi.

2. CHIK VLP espressione utilizzando Baculovirus / Insect Cell System

  1. Generare baculovirus ricombinanti che esprimono capside del virus Chikungunya e proteine ​​dell'involucro (C-E3-E2-6K-E1) da S-27 ceppo utilizzando un sistema commerciale di espressione baculovirus.
  2. Cellule Sf9 Cultura Spodoptera frugiperda in terreno di crescita Sf9 privo di siero con 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina a 28 ° C. Utilizzare 3-5 x 10 5 c / ml di avviare culture pallone filatore per suspensla crescita delle cellule di ioni. Passaggio routine quando raggiungono densità di cellule di 2-4 x 10 6 c / ml (ogni 3-4 giorni).
  3. cellule Culture Sf9 in sospensione in flaconi filatore con agitazione a 130 rpm in un sistema multipunto piatto agitatore. Per una corretta aerazione, mantenere volumi di coltura a non più di metà del volume del pallone filatore.
  4. Per l'espressione di CHIK VLP, infettare le cellule Sf9 ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml con baculovirus ricombinante ad una molteplicità di infezione di 1 e tornare a 28 ° C incubatore. In genere, infettare una o due palloni filatore, contenenti 250 ml cellule Sf9.
    Nota: Anche se non utilizzare questo metodo, le cellule Sf9 possono essere coltivate in fiaschi di vibrazione a 28 ° C utilizzando una piattaforma shaker.
  5. culture raccolto dopo 72-96 ore dopo l'infezione, o quando la vitalità delle cellule è diminuito al 70-80%, come determinato dal Trypan Blue esclusione secondo il protocollo del produttore.
    Nota: le cellule continuano a proliferare, mentre infetto e vi èun ~ 80% vitalità nelle culture Sf9 infettate con baculovirus ricombinanti CHIK VLP a 3 giorni dopo l'infezione (dpi). cellule baculovirus infettate sono più grandi in apparenza. Morfologia può anche cambiare da rotondo a oblunga. Alla fine di stadi di infezioni baculovirus, le cellule hanno cominciato a lisare.
  6. culture trasferire direttamente dal coltura in sospensione in 50 ml provette coniche e spin giù le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  7. Raccogliere surnatanti e filtrare attraverso una membrana da 0,22 micron pori prima sedimentazione tramite ultracentrifugazione.

3. La sedimentazione / Purificazione di VLP / SVP

  1. Sterilizzare tubi ultracentrifuga open-top 25 mm x 89 mm con il 70% di etanolo in cappuccio biosicurezza. Assicurarsi che l'etanolo è asciugata prima dell'uso.
  2. Caricare fino a 32 ml di surnatante in una provetta pulita. Si raccomanda un volume minimo di 25 ml per prevenire il collasso e il danno di tubi riempiti ultracentrifuga adeguatamente.
  3. underlay attentamente surnatanti ingegnoh sterile 3 ml 20% glicerolo in PBS (v / v). Assicurarsi che i tubi sono equilibrati.
  4. Spin a 135.000 xg per 4 ore a 4 ° C.
  5. Aspirare il surnatante, garantendo il pellet non sloggiare dal tubo.
  6. Risospendere sedimentato VLP nella parte inferiore dei tubi con PBS sterile vigorosamente pipettando su e giù. La quantità di PBS necessaria per risospendere VLP dipende dalla resa di proteine ​​totali VLP e applicazioni a valle. In genere, risospendere ogni pellet VLP in almeno 100 ml.
  7. Conservare i campioni a 4 ° C per una conservazione a breve termine e di stoccaggio -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

4. determinazione delle rese di proteine ​​e rendimenti antigene specifico

  1. Determinare il contenuto proteico totale utilizzando un metodo proteina quantificazione commerciale, come ad esempio test BCA come da protocollo del produttore.
  2. Per valutare il contenuto antigene specifico, eseguire diretta enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) rivestendo diluizioni seriali di antigene standard e 2-51; g di campione proteico totale a una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto ELISA.
    1. Seguire con anticorpi antigene-specifici per sondare la presenza degli antigeni sulla piastra e utilizzare substrati sviluppo ELISA convenzionali per produrre assorbanza rilevabili per lettore di micropiastre. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi di test HA e ELISA per un campione HA-esprimendo VLP; molte combinazioni di HA e NA sono forse, ma i rendimenti possono essere diverse su HA-NA compatibilità 15.
      Nota: gli anticorpi antigene-specifici hanno affinità variabili e si raccomanda che la diluizione endpoint-titolazione degli anticorpi essere determinata prima di eseguire VLP quantificazione. anticorpi commerciali avranno intervalli di concentrazione o diluizione consigliato per l'uso in ELISA, così come protocolli suggerite.

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Risultati

rendimenti VLP erano variabili in base alla progettazione di antigene virale costrutto. In questo protocollo, abbiamo dimostrato l'uso di cellule di insetto e di mammiferi per la produzione di SVP o VLP nel surnatante e purificazione da ultracentrifugazione. Quattro sottotipi di DENV PRM / E gene strutturale cassette di espressione sono stati usati per costruire le versioni di DENV SVP (delimitate da 1-4) nella tabella 1 e dimostrare un range compreso tra 1,1-2,6 mg ...

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Discussione

Abbiamo usato le tecniche sopra descritte per esprimere con successo e purificare SVP e VLP composti da più proteine ​​strutturali di vari agenti patogeni. In generale, usiamo sistemi di espressione di mammifero per generare i nostri VLP. Tuttavia, nelle nostre mani, dei mammiferi cellule derivate Chik rendimenti VLP erano bassi. CHIK resa VLP è stato più robusto quando si utilizza un sistema di celle baculovirus-insetto ricombinante. In generale, baculovirus-insetti sistemi cellulari producono una maggiore quantità di ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vogliamo riconoscere i membri precedenti del laboratorio Ross che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo per la massima efficienza e rendimento.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Maxi kit di plasmidiQiagen12163
DMEMCellgro10-013
LipofectamineLife TechnologiesL3000075Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM ILife Technologies31985062
Bac-to-Bac Sistema di espressione del baculovirusLife Technologies10359-016
Piastra di agitazione multipunto Cimarec I 6ThermoFisher Scientific50094596
Provette per ultracentrifuga PolyclearSeton7025Confermare le provette appropriate per l'ultracentrifuga e le dimensioni del secchio
Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCAThermoFisher Scientific23235
Tampone citrato fosfatoSigmaP4922
o-fenilendiammina dicloridrato SigmaP8287
0.22 μ m filtro sottovuoto superiore (500 ml)Nalgene569-0020
GliceroloSigmaG5516
H2SO4Sigma339741 
Sf-900 II SFMThermoFisher Scientific10902-096

Riferimenti

  1. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
  2. Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
  3. Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
  4. Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
  5. Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
  6. Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
  7. Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
  8. Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501(2008).
  9. Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
  10. Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
  11. Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
  12. Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
  13. Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
  14. Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
  15. Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
  16. Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
  17. Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
  18. Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
  19. Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).

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