RNA Purificazione da nella cellula Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofagi

Sommario

Qui descriviamo un metodo per l'isolamento dell'RNA batterico dai batteri Listeria monocytogenes che crescono all'interno dei macrofagi murini. Questa tecnica può essere utilizzata con altri patogeni intracellulari e cellule ospiti di mammifero.

Abstract

L'analisi del trascrittoma dei patogeni batterici durante l'infezione dei mammiferi è uno strumento prezioso per studiare i geni e i fattori che mediano l'infezione. Tuttavia, isolare l'RNA batterico da cellule o tessuti infetti è un compito impegnativo, poiché l'RNA dei mammiferi domina principalmente i lisati delle cellule infette. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per l'isolamento dell'RNA dei batteri Listeria monocytogenes che crescono all'interno di cellule macrofagiche derivate dal midollo osseo. Dopo l'infezione, le cellule vengono leggermente lisate e rapidamente filtrate per scartare la maggior parte delle proteine e dell'RNA dell'ospite, mantenendo intatti i batteri. Successivamente, l'RNA batterico viene isolato mediante estrazione a caldo con fenolo-SDS seguita dal trattamento con DNasi. L'RNA estratto è adatto per l'analisi della trascrizione genica con diverse tecniche. Questo metodo è impiegato con successo nei nostri studi sulla regolazione del gene di Listeria monocytogenes durante l'infezione delle cellule macrofagiche ^1-4. Il protocollo può essere facilmente modificato per studiare altri patogeni batterici e tipi di cellule.

Introduzione

Intracellulari batteri patogeni ─ batteri che causano malattie infettive e in grado di crescere e riprodursi all'interno delle cellule di ospiti umani ─ sono un grave problema di salute in tutto il mondo ^5. Per invadere e replicarsi all'interno di una cellula di mammifero, patogeni intracellulari hanno acquisito sofisticati meccanismi di virulenza e fattori. Mentre questi meccanismi sono fondamentali per la capacità di causare una malattia, si sa poco circa la loro regolazione e la dinamica. Dal momento che i profili di espressione genica di batteri coltivate in mezzi liquidi non riflettono l'ambiente reale all'interno di cellule ospiti, vi....

Protocollo

Nota: Durante l'intero esperimento, macrofagi vengono incubate a 37 ° C in un incubatore CO ₂ ad aria forzata 5% e il prelievo delle dell'incubatore solo per manipolazioni sperimentali, che vengono eseguite in una cappa di sicurezza biologica Classe II. Lavorare con L. batteri monocytogenes è in base al livello di sicurezza biologica 2 regolamenti.

1. Preparazione e cellulare infezione batterica (giorno 1 e 2)

1. Giorno 1
   1. Cellule Seed 2.0 x 10 ⁷ midollo osseo derivate macrofagi (BMDM) su un piatto 145 millimetri in 30 ml BMDM + Pen-Strep supporti (Tabella 2). Seed 3 piastre per ....

Risultati

Il sistema modello è illustrato nella figura 1 e comprende cellule di macrofagi infettati con L. monocytogenes batteri, che replicano nel citoplasma dei macrofagi. La figura 2 rappresenta lo schema sperimentale. Figura 3 rappresenta i risultati tipici di tale analisi RT-qPCR di geni di virulenza durante WT L. monocytogenes crescita nei macrofagi in confronto alla crescita ricca di laboratorio medio BHI. I risultati most.......

Discussione

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo ottimizzato per l'isolamento di RNA batterico da L. monocytogenes batteri che crescono intracellulare nelle cellule macrofagi. Questo protocollo si basa su lisi differenziale cellulare e comprende due fasi principali per l'arricchimento di RNA batterico: macrofago sedimentazione nuclei mediante centrifugazione ed un rapido accumulo di batteri per filtrazione. Questi passaggi sono seguiti da un procedimento di estrazione di RNA standard. Mentre questo pro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Listeria monocytogenes 10403S			20
Macrofagi derivati dal midollo osseo preparati da topi			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	L'acqua trattata con DEPC può essere utilizzata
DMEM	Gibco	41965039
Glutammina	Gibco	25030081
Piruvato di sodio	Gibco	11360-088
β-Mercaptoetanolo	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Infusione di cuore cerebrale (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Fenolo saturo pH 4,3	Fisher	BP1751I-400
Cloroformio	Fisher	BP1145-1
Alcool iso-amilico	Sigma-Aldrich	W205702
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Etanolo assoluto	Merck Millipore	1070174000
37 gradi C, 5% CO2 incubatore ad aria forzata	Thermo Scientific	Model 3111
Raschiatori per celle	Nunc	179693
Kontes portabicchieri per filtri da 45 mm	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filtri 45  mm, 0,45  µ m	Merck Millipore	HAWP04700
sistema SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Modello G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
Piastre per colture cellulari da 145 mm	Greiner	639 160
provette da 1,7 ml, senza RNasi	Axygen	MCT-175-C
30 gradi incubatore C	Thermo Scientific
65 ° C blocco termico	Thermo Scientific
4 gradi Centrifuga da tavolo C	Eppendorf	5417R
Pipette sterili, provette	Greiner
azoto
Greiner			50 ml

femmina C57B/6W302406Falcon da 25 ml, liquidoda