Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

Summary

Questo articolo include protocolli dettagliati per la marcatura genetica della pelle di topo, la denervazione chirurgica, la biopsia cutanea e la visualizzazione di epiteli marcati mediante colorazione con β-galattosidasi a montaggio intero. Questi metodi possono essere utilizzati per testare il fabbisogno di nervi in modelli murini di pelle normale e patologica.

Abstract

I nervi somatosensoriali cutanei funzionano per rilevare diversi stimoli che agiscono sulla pelle. Oltre ai loro ruoli sensoriali consolidati, studi recenti hanno suggerito che i nervi possono anche modulare i disturbi della pelle tra cui la dermatite atopica, la psoriasi e il cancro. Qui, descriviamo i protocolli per testare il requisito dei nervi nel mantenimento di un organo meccanosensoriale cutaneo, la cupola tattile (TD). In particolare, discutiamo i metodi per la marcatura genetica, la raccolta e la visualizzazione dei TD mediante colorazione a montaggio intero e per l'esecuzione della denervazione chirurgica unilaterale sulla pelle dorsale del dorso del topo. Insieme, questi approcci possono essere utilizzati per confrontare direttamente la morfologia della TD e l'espressione genica nella pelle denervata e simulata dello stesso animale. Questi metodi possono anche essere facilmente adattati per esaminare il fabbisogno di nervi in modelli murini di patologia cutanea. Infine, la capacità di campionare ripetutamente la pelle offre l'opportunità di monitorare la progressione della malattia in diverse fasi e momenti dopo l'inizio.

Introduction

Negli ultimi anni, c'è stato un crescente apprezzamento per l'influenza dei nervi su malattie non tipicamente considerate come neuropatie classiche^1-4. Nella pelle, recenti evidenze sperimentali hanno suggerito che i nervi sensoriali possono modulare diverse patologie che vanno dalla psoriasi al cancro^5-9. Ciò è stato dimostrato utilizzando tecniche come la denervazione chirurgica e l'inibizione farmacologica della funzione neurale nei roditori. Nel caso della psoriasi, questi studi hanno fornito un quadro meccanicistico per comprendere perché le placche psoriasiche umane regrediscono in seguito alla perdita della funzione neurale^7,10-12

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità alle norme stabilite dalla University of Michigan Unità per la Medicina di Laboratorio degli animali.

1. Indurre ricombinazione genetica nei topi

Nota: Il Gli1 ^{TM3 (CRE / ERT2) Alj} / J ceppo di topi (Gli1-CreERT2) ¹³ permette di mira di ricombinazione genetica tamoxifene indotta a TD epiteli. Attraversare questo ceppo con B6.129S4-Gt (ROSA) topi reporter 26Sor ^tm1Sor / J (LacZ) ²² per generare Gli1, animali LacZ di visualizzare le....

Results

Dai topi che esprimono generando tamoxifene-inducibile Gli1-CreERT2 e un allele LacZ giornalista, è possibile visualizzare TD epiteli e tracciare le sorti di queste cellule nel corso del tempo. L'intera procedura di denervazione in genere può essere completata entro 1 ora per mouse e dovrebbe causare disagio minimo per l'animale.

I nostri studi precedenti hanno indicato che i nervi sono cruciali per mantenere.......

Discussion

I nervi svolgono funzioni cruciali non solo nella sensazione, ma anche nello sviluppo degli organi dei mammiferi, la manutenzione e la rigenerazione ^13,24-27. Come nervi sono stati recentemente implicati in malattie della pelle diversi, le tecniche qui descritte possono essere utilizzati per studiare il requisito di innervazione in una varietà di modelli di malattia degli animali. Infatti, la tecnica denervazione unilaterale consente il raffronto diretto di pelle sia con nervi integri o interrotti dalla stess.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamponi per la preparazione dell'alcol	PDI	B339
AnaSed (xilazina)	Lloyd	NADA 139-236
Anticorpo, anti-cheratina 8	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank	TROMA-I	anticorpo di ratto, uso a concentrazione 1:500
Anticorpo, anti-cheratina 17	Cell Signaling	#4543	anticorpo di coniglio, uso a concentrazione 1:1.000
Anticorpo, anticorpo di coniglio anti-Neurofilamento	Cell Signaling	C28E10	, utilizzare a concentrazione 1:500
Betadine prep pads	Medline	MDS093917
Carprofen (Rimadyl)	Zoetis
Tagliacapelli ricaricabile senza fili	Wahl	trimmer modello 8900
Olio di mais	Sigma-Aldrich	C8267
Cryostat	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306	uso a concentrazione 1:1.000
Desossicolato	Sigma-Aldrich	D6750
Crema depilatoria		Nair N/A
Dimetilforamide	Sigma-Aldrich	319937
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Glutaraldeide	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Ketamina HCl	Hospira	NDC 0409-2051-05
Cloruro di magnesio	Sigma	M8266
Micro vetro di copertura	VWR	48404-454
Micro vetrini	VWR	48311-703
10% Formalina tamponata neutra	VWR	BDH0502-4LP
6-0 suture in nylon	DemeTECH	NL166012F4P
Ottilfenil-polietilenglicole	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. Composto	Sakura Tissue-Tek	4583
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Pottasium ferrocianuro	Sigma-Aldrich	P9387
Ferricianuro di Pottasio	Sigma-Aldrich	702587
Fosfato di sodio monobasico	Sigma-Aldrich	P9791
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	S5136
Saccarosio	Sigma-Aldrich	84097
Tamoxifene	Sigma-Aldrich	T5648-1G
Pinze ultra fini	Dumont	0103-5-PO
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	Disolve in dimetilforamide per creare 50x stock prima dell'uso