Articolo metodologico

Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

DOI:

10.3791/54050

⸱

26 giugno 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo include protocolli dettagliati per la marcatura genetica della pelle di topo, la denervazione chirurgica, la biopsia cutanea e la visualizzazione di epiteli marcati mediante colorazione con β-galattosidasi a montaggio intero. Questi metodi possono essere utilizzati per testare il fabbisogno di nervi in modelli murini di pelle normale e patologica.

Abstract

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I nervi somatosensoriali cutanei funzionano per rilevare diversi stimoli che agiscono sulla pelle. Oltre ai loro ruoli sensoriali consolidati, studi recenti hanno suggerito che i nervi possono anche modulare i disturbi della pelle tra cui la dermatite atopica, la psoriasi e il cancro. Qui, descriviamo i protocolli per testare il requisito dei nervi nel mantenimento di un organo meccanosensoriale cutaneo, la cupola tattile (TD). In particolare, discutiamo i metodi per la marcatura genetica, la raccolta e la visualizzazione dei TD mediante colorazione a montaggio intero e per l'esecuzione della denervazione chirurgica unilaterale sulla pelle dorsale del dorso del topo. Insieme, questi approcci possono essere utilizzati per confrontare direttamente la morfologia della TD e l'espressione genica nella pelle denervata e simulata dello stesso animale. Questi metodi possono anche essere facilmente adattati per esaminare il fabbisogno di nervi in modelli murini di patologia cutanea. Infine, la capacità di campionare ripetutamente la pelle offre l'opportunità di monitorare la progressione della malattia in diverse fasi e momenti dopo l'inizio.

Introduzione

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Negli ultimi anni, c'è stato un crescente apprezzamento per l'influenza dei nervi su malattie non tipicamente considerate come neuropatie classiche1-4. Nella pelle, recenti evidenze sperimentali hanno suggerito che i nervi sensoriali possono modulare diverse patologie che vanno dalla psoriasi al cancro5-9. Ciò è stato dimostrato utilizzando tecniche come la denervazione chirurgica e l'inibizione farmacologica della funzione neurale nei roditori. Nel caso della psoriasi, questi studi hanno fornito un quadro meccanicistico per comprendere perché le placche psoriasiche umane regrediscono in seguito alla perdita della funzione neurale7,10-12.

I nervi cutanei possono anche influenzare l'espressione genica13,14 e sono fondamentali per il meccanosensing nella pelle normale15. In particolare, gli epiteli touch dome (TD) sono costituiti da una chiazza di cellule epidermiche colonnari in giustapposizione con cellule di Merkel neuroendocrine innervate da fibre nervose di tipo 1 (SA1)16-18 che si adattano lentamente. I TD mediano la sensazione di tocco leggero e hanno dimostrato di mostrare l'attività del percorso di Hedgehog5,19. Il mantenimento della TD dipende dall'innervazione20,21, poiché i nervi secernono ligandi Hedgehog per sostenere i TD normali e le cellule di Merkel associate19. Inoltre, l'innervazione promuove la formazione di tumori Hedgehog-dipendenti dall'epitelio TD5. Insieme, questi studi rafforzano l'idea che le complesse interazioni molecolari che si verificano tra i nervi e le cellule circostanti nella loro nicchia sono cruciali per la normale fisiologia della TD e per la malattia.

Per interrogare la natura di queste interazioni, descriviamo qui una serie di tecniche in vivo per manipolare l'espressione genica nel TD, così come per raccogliere biopsie cutanee per la visualizzazione TD dopo il tracciamento del lignaggio. Infine, descriviamo le procedure per l'esecuzione della denervazione chirurgica unilaterale, in cui i nervi vengono rimossi da un lato della pelle dorsale del topo, lasciando intatto il lato controlaterale come un finto controllo interno. Diverse settimane dopo l'intervento chirurgico, la pelle di controllo denervata e fittizia viene confrontata per valutare i cambiamenti che si verificano quando i nervi vengono ablati. Sebbene queste tecniche siano descritte nel contesto dei TD normali, la procedura di denervazione è stata utilizzata per esaminare il fabbisogno di nervi in modelli murini di psoriasi6, guarigione delle ferite13 e tumorigenesi5. Infine, poiché la pelle è suscettibile di biopsie ripetute, ciò offre l'opportunità di monitorare il destino a lungo termine delle cellule marcate o di valutare la progressione della malattia in più punti temporali.

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Protocollo

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Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità alle norme stabilite dalla University of Michigan Unità per la Medicina di Laboratorio degli animali.

1. Indurre ricombinazione genetica nei topi

Nota: Il Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J ceppo di topi (Gli1-CreERT2) 13 permette di mira di ricombinazione genetica tamoxifene indotta a TD epiteli. Attraversare questo ceppo con B6.129S4-Gt (ROSA) topi reporter 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 per generare Gli1, animali LacZ di visualizzare le cellule TD di tutto il montaggio colorazione di seguito.

  1. Preparare la soluzione tamoxifene ad una concentrazione di 12,5 mg / ml in olio di mais.
    1. In una provetta da 1,5 ml, aggiungere fino a 20 mg di tamoxifene cristallini, e quindi 1 ml di olio di mais. Saldamente nastro il tubo di un vortex e vortex in continuo con l'impostazione più alta a temperatura ambiente fino a quando il tamoxifene si è completamente dissolto (2-4 ore), comeconfermata esaminando il tubo sotto un microscopio da dissezione per l'assenza di particolato tamoxifene.
    2. Trasferire la soluzione in una provetta da 15 ml e diluire le tamoxifene ad una concentrazione finale di 12,5 mg / ml di olio di mais aggiuntivo. Mescolare vortexando la soluzione viscosa per un ulteriore 30 sec. Conservare questa soluzione per 1 settimana a 4 ° C al buio.
  2. Iniettare la soluzione tamoxifene via intraperitoneale nel Gli1; ​​topi LacZ, ad un volume di 200 microlitri per 20 g di peso corporeo del mouse, per una dose tamoxifene efficace di 2,5 mg per 20 g di peso mouse.

2. biopsie cutanee Harvest

NOTA: a seconda dell'esperimento, biopsie cutanee raccolto parecchi giorni o settimane dopo l'induzione tamoxifene. Per tutti gli interventi chirurgici, seguire protocolli standard per la chirurgia roditori, tra cui l'uso dei guanti sterili, indossando una maschera o di capelli chirurgica rete, e che copre l'animale con un telo chirurgico sterile durante la procedura.

  1. Preparare 10x soluzione madre di anestetico miscelando 90 mg / ml di ketamina e 6,5 mg / ml in acqua xilazina. Diluire questa soluzione 1:10 in PBS sterile al momento dell'uso, e conservare a temperatura ambiente al buio per un massimo di 8 mesi.
    1. In alternativa, anestetizzare topi per inalazione isoflurano, iniziando con una concentrazione di gas del 4% con l'ossigeno per anestetizzare completamente l'animale, e successivamente abbassare tale al 1-2% per la durata della procedura.
  2. Iniettare la soluzione di anestetico per via intraperitoneale alla dose di 200 ml per 20 g di peso corporeo del mouse. Verificare che l'animale ha raggiunto il corretto piano di sedazione mediante test punta pizzico, e confermare che il cuore e la frequenza respiratoria sono normali (circa 600 battiti e 160 respiri al minuto, rispettivamente).
  3. Utilizzare un tagliatore elettrico per rimuovere i capelli dal sito della biopsia sulla pelle dorsale posteriore, facendo attenzione a non intaccare o danneggiare la pelle sottostante.
  4. Preparare il sito chirurgico pulendo la rasaturaArea D in senso antero-a-posteriore con Betadine e alcool salviette. Assicurarsi che tutti i ritagli di capelli vengono rimossi dal sito.
  5. Outline al sito biopsia con un pennarello nero, collocare l'animale su un blocco di riscaldamento in una zona chirurgica asettica, e coprire con un telo chirurgico sterile (per scopi dimostrativi, telino sterile è stata omessa per aumentare la visibilità).
    Nota: Per ottenere sezioni longitudinali dei follicoli piliferi, il bordo più lungo della biopsia (il bordo da sezionare per istologia, ~ 1 cm) dovrebbe funzionare in direzione anteriore-posteriore (parallela alla direzione dei follicoli piliferi), parasagital per linea mediana dorsale (Figura 1A).
  6. Utilizzare uno sterile # 11 bisturi per fare una escissione tutto spessore lungo l'area contrassegnata senza danneggiare la fascia muscolare sottostante.
    Nota: Il tessuto della pelle asportato comprende l'epidermide, derma, grasso sottocutaneo e pannicolo carnosus. Il sanguinamento è in genere minima.
  7. appiattire tha asportato campione di pelle su un tovagliolo di carta a secco, derma lato verso il basso, assetto via il tovagliolo di carta in eccesso, e conservare il campione in PBS freddo per un massimo di 1 ora se altri campioni devono essere raccolti. Quando si è pronti, procedere ai passaggi 3.1 o 3.2 per elaborare i campioni per l'istologia, o il punto 4 per β-galattosidasi (LacZ) colorazione tutto il montaggio.
  8. Sutura chiudere il sito di biopsia con 6-0 punti di sutura in nylon, in un modello semplice interrotto distanziati di circa 3 mm.
  9. Non restituire i topi che hanno subito un intervento chirurgico nella stessa gabbia, come gli altri animali fino a dopo il pieno recupero.
  10. Monitorare gli animali subito dopo l'intervento chirurgico fino a che riprendano conoscenza, e anche tutti i giorni fino a quando l'area chirurgica è guarita, in genere entro 1 settimana. Utilizzare analgesici in conformità con le linee guida per la cura degli animali e uso istituzionale designati se i topi mostrano segni di dolore o disagio. Rimuovere suture entro 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
    Nota: Se necessario, preparare la soluzione analgesica diluendo Carprofen (50 mg / ml di solution) 1: 100 in acqua sterile. Iniettare la soluzione per via sottocutanea tra le scapole vicino alla collottola, ad una dose di 200 ml per 20 g di peso corporeo (5 mg / kg di peso corporeo del mouse).

3. I campioni di processo per Istologia

Nota: Per risolvere ed elaborare il tessuto asportato, utilizzare entrambi i metodi qui di seguito a seconda dell'applicazione.

  1. Per generare campioni istologici inclusi in paraffina, fissare la pelle in 3,7% di formalina in PBS O / N a temperatura ambiente e conservare in etanolo al 70% per un massimo di 2 settimane. Rimuovere il tovagliolo di carta prima di incorporare in paraffina.
  2. Per la generazione di campioni istologici congelati, immergere il tessuto a freddo paraformaldeide 4% in PBS e agitare delicatamente per 1 ora. Rimuovere la soluzione e lavare il campione con 3 cambi di PBS, circa 5 minuti ciascuno. Successivamente, immergere il campione nel 30% di saccarosio in PBS per cryoprotect tessuto ( "sinking saccarosio").
  3. Incubare con dolce O agitazione / N a 4 ° C. Il giorno successivo, rimuovere il rimorchio di cartael e tagliare via il tessuto adiposo in eccesso dal lato dermico della pelle. Incorporare il tessuto direttamente in Office e memorizzare il blocco congelato a -80 ° C.
    Nota: Dopo aver sezionato, sia paraffina o campioni congelati possono essere colorati mediante immunoistochimica per identificare TD, cellule di Merkel e nervi che utilizzano gli anticorpi contro rispettivamente cheratina 17, cheratina 8 e Neurofilament, come descritto in precedenza 5,19.

4. I campioni Visualizza per tutto il montaggio colorazione LacZ

  1. Preparare soluzione colorante X-gal.
    1. Combinare 0,94 g sodio fosfato monobasico, e 2,6 g di sodio fosfato bibasico in 250 ml di acqua sterile. Regolare il pH a 7,3. Per questo, aggiungere 0,5 ml di 1 M di cloruro di magnesio, 0,528 g di ferrocianuro di potassio, e 0,412 g di ferricianuro di potassio. Aggiungere 250 ml di glicole ottilfenil-polietilene e 125 mg di desossicolato. La soluzione di base può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi al buio.
    2. Preparare 50x Stock X-gal solution aggiungendo dimetilformammide nel X-gal magazzino bottiglia per generare una soluzione 50 mg / ml. Conservare la soluzione a -20 ° C al buio.
    3. Appena prima di utilizzare, diluire soluzione madre X-gal 01:50 nella soluzione di base di X-gal per generare soluzione colorante. Per biopsie piccole (<1 cm 2), aliquote 1-2 ml di soluzione colorante per campione.
  2. Fissare il campione di pelle raccolto nel passaggio 2.7 in una soluzione contenente 2% paraformaldeide / 0,2% glutaraldeide in PBS freddo per 30 minuti, agitando delicatamente su ghiaccio. Per biopsie più piccoli (<1 cm 2), usare 1-2 ml di soluzione fissativa per campione.
    Nota: In alternativa, fissare campioni 2-4% paraformaldeide solo, o in 0,5% solo glutaraldeide. condizioni di fissaggio ottimali dipendono dal tessuto, grado di espressione LacZ e applicazione.
  3. Rimuovere la soluzione fissativo, e risciacquare i campioni con 3 cambi di PBS, 5 minuti ciascuna, su un agitatore a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere il tovagliolo di carta sotto il campione e tagliare via excess tessuto adiposo dal lato dermico della pelle afferrando il grasso con una pinza smussato e taglio con le forbici dissezione.
  5. Immergere il campione in soluzione colorante X-gal, e incubare a 37 ° CO / N. Espressione LacZ sarà visibile come una macchia blu sotto un microscopio da dissezione (Figura 1B).
    Nota: Se l'intensità del segnale è debole, sostituire la soluzione colorante il giorno successivo e ripetere l'/ incubazione O N. Se la colorazione di fondo è troppo intenso, ridurre il tempo di colorazione o incubare il campione a RT invece di 37 ° C.
  6. Rimuovere la soluzione colorante e lavare i campioni in 3 cambi di PBS contenente 3% DMSO per circa 5 minuti, scuotendo delicatamente a temperatura ambiente.
  7. Lavare i campioni in 2-3 cambi di etanolo al 70% per 5 minuti ciascuna. Conservare i campioni in etanolo al 70%.

5. denervazione chirurgica

  1. Anestetizzare l'animale come al punto 2.2 e la barba tutta la pelle dorsale.
  2. Preparare l'area chirurgica of indietro la pelle con Betadine e cotone imbevuto di alcol, e coprire l'animale con un telo chirurgico sterile (per scopi dimostrativi, telino sterile è stata omessa per aumentare la visibilità). Tenere il caldo animale con una piastra elettrica durante il funzionamento in una zona chirurgica asettica.
  3. Fare un'incisione utilizzando una sterile # 11 bisturi lungo la linea mediana dorsale dalla base del collo per circa 0,5 cm sopra la coda.
  4. Utilizzando pinze smussato, riflette delicatamente la pelle sul lato sinistro di distanza dal fianco di visualizzare il tessuto sottostante dai cuscinetti adiposi scapolare vicino al collo appena sopra il arto posteriore.
    Nota: nervi cutanei dorsali appaiono filamenti come bianchi che viaggiano caudalmente attraverso la fascia trasparente della parete tronco prima di effettuare curve strette e inserendo il tessuto connettivo lasso sotto la pelle (Figura 2).
  5. Utilizzando una pinza ultrafini sotto un microscopio ottico dissezione, rimuovere i nervi esclusivamente dal lato sinistro della animal situata in siti anatomici T3-12 pizzicando da dove la curva segmenti alla parete tronco ai loro siti di ingresso nella pelle (Figura 2).
    1. Pinze Orient verticalmente e rimuovere i nervi afferrando circa 0,5 cm sotto i loro siti di piegatura e tirando verso l'alto, causando il nervo per allungare e separare dal tessuto circostante (Figura 2C - E). Fare attenzione ad evitare la rottura dei vasi sanguigni adiacenti.
    2. Continuare finché tutti i nervi che si estendono dalla parete tronco alla pelle vengono rimossi. Non disturbare i nervi all'interno della fitta fascia della parete tronco. Mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura applicando periodicamente gocce di soluzione salina sterile allo 0,9%.
    3. In alternativa, rimuovere i nervi afferrando loro estremità prossimali vicino alla parete tronco con una pinza e snipping con le forbici sottili. Successivamente, tagliare le estremità distali vicino alla pelle (figure 2F - H). Infine, rimuovere il intsegmenti nervosi ervening (Figura 2i).
  6. Rimuovere eventuali nervi dal lembo di pelle esposta al punto 5.4. Queste fibre comprendono i rami distali delle dorsali nervi cutanei e appaiono come bianche ciocche di ramificazione si trovano sporadicamente all'interno del tessuto connettivo dermico sul lato del lembo cutaneo (figure 2J - K).
    1. Per rimuovere queste belle rami, posizionare la pinza sottile approssimativamente parallelo alla superficie cutanea, afferrare i nervi e cogliere verso l'alto per evitare di interrompere i vasi sanguigni e pungere la pelle. Continuare fino a quando tutti i nervi visibili sono stati rimossi.
  7. Utilizzando smussa, riflettere la pelle sul lato destro della dorsale incisione mediana, ma non rimuovere i nervi. Questo servirà come il controlaterale di controllo sham-operated.
  8. Sutura lungo la linea mediana dorsale in un semplice schema interrotto per chiudere l'incisione. Monitorare l'animale durante il recupero e post-opertivamente come precedentemente dimostrato (Piazza di 2,8-10). Rimuovere suture entro 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  9. Per valutare funzionalmente stabile denervazione fino a diverse settimane dopo l'intervento, rimuovere i capelli dalla pelle dorsale con un tagliatore elettrico.
  10. pungere delicatamente la zona della pelle denervato usando un ago ipodermico, e notare se l'animale risponde, in genere un brivido o girare la testa. Se l'area di pelle è stato stabilmente denervato, l'animale esporrà poca o nessuna risposta.
  11. Con un pennarello nero, delimitare l'area di risposta, nonché una zona di dimensioni e posizione simile sul lato controlaterale sham.
  12. Raccogliere biopsie di questi siti, come nei passaggi 2.1-2.9 per l'analisi.
    Nota: In alternativa, tutta la schiena dorsale della pelle, comprese le regioni denervati e sham-operati, può essere rimosso come un singolo foglio per tutto il montaggio colorazione, simile a quanto descritto al punto 4.

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Risultati

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Dai topi che esprimono generando tamoxifene-inducibile Gli1-CreERT2 e un allele LacZ giornalista, è possibile visualizzare TD epiteli e tracciare le sorti di queste cellule nel corso del tempo. L'intera procedura di denervazione in genere può essere completata entro 1 ora per mouse e dovrebbe causare disagio minimo per l'animale.

I nostri studi precedenti hanno indicato che i nervi sono cruciali per mantenere...

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Discussione

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I nervi svolgono funzioni cruciali non solo nella sensazione, ma anche nello sviluppo degli organi dei mammiferi, la manutenzione e la rigenerazione 13,24-27. Come nervi sono stati recentemente implicati in malattie della pelle diversi, le tecniche qui descritte possono essere utilizzati per studiare il requisito di innervazione in una varietà di modelli di malattia degli animali. Infatti, la tecnica denervazione unilaterale consente il raffronto diretto di pelle sia con nervi integri o interrotti dalla stess...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Autumn Peterson per l'assistenza con la fotografia dei topi, Daniel Thoresen per l'assistenza con i topi e i dottori Nicole Ward e Abdelmadjid Belkadi per l'assistenza con la denervazione chirurgica. Questi studi sono stati sostenuti da finanziamenti dell'Istituto Nazionale di Artrite e Malattie Muscoloscheletriche e della Pelle (sovvenzioni R00AR059796 e R01AR065409); il Dipartimento di Dermatologia dell'Università del Michigan; il programma di studiosi di scienze biologiche; il Centro per l'Organogenesi; il Comprehensive Cancer Center dell'Università del Michigan; e il John S. e Suzanne C. Munn Cancer Fund. S.C.P. è stato sostenuto da un finanziamento dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali (sovvenzione T32 GM007315). Questo lavoro è stato supportato anche dal NIH Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tamponi per la preparazione dell'alcolPDIB339
AnaSed (xilazina)LloydNADA 139-236
Anticorpo, anti-cheratina 8Studi sullo sviluppo Hybridoma BankTROMA-Ianticorpo di ratto, uso a concentrazione 1:500
Anticorpo, anti-cheratina 17Cell Signaling#4543anticorpo di coniglio, uso a concentrazione 1:1.000
Anticorpo, anticorpo di coniglio anti-NeurofilamentoCell SignalingC28E10, utilizzare a concentrazione 1:500
Betadine prep padsMedlineMDS093917
Carprofen (Rimadyl)Zoetis
Tagliacapelli ricaricabile senza filiWahltrimmer modello 8900
Olio di maisSigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306uso a concentrazione 1:1.000
DesossicolatoSigma-AldrichD6750
Crema depilatoriaNair N/A
DimetilforamideSigma-Aldrich319937
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GlutaraldeideSigma-AldrichG5882
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000
Ketamina HClHospiraNDC 0409-2051-05
Cloruro di magnesioSigmaM8266
Micro vetro di coperturaVWR48404-454
Micro vetriniVWR48311-703
10% Formalina tamponata neutraVWRBDH0502-4LP
6-0 suture in nylonDemeTECHNL166012F4P
Ottilfenil-polietilenglicoleSigma-AldrichI8896
O.C.T. CompostoSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
Pottasium ferrocianuroSigma-AldrichP9387
Ferricianuro di PottasioSigma-Aldrich702587
Fosfato di sodio monobasicoSigma-AldrichP9791
Fosfato di sodio bibasicoSigma-AldrichS5136
SaccarosioSigma-Aldrich84097
TamoxifeneSigma-AldrichT5648-1G
Pinze ultra finiDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001Disolve in dimetilforamide per creare 50x stock prima dell'uso

Riferimenti

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