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Articolo metodologico

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

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⸱

DOI:

10.3791/54058

⸱

7 aprile 2016

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere le alterazioni molecolari in cornee diabetici umani e dimostrare come possono essere alleviati con la terapia genica adenovirale in cornee organo-colta. La malattia corneale diabetica è una complicanza del diabete con frequenti anomalie dei nervi corneali e epiteliali guarigione delle ferite. Abbiamo anche documentato l'espressione significativamente alterato di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi in ​​cornee diabetici umani. Per alleviare questi cambiamenti, la terapia genica adenovirale è stato implementato con successo utilizzando la up-regolazione dell'espressione proto-oncogene c-met e / o la sottoregolazione di matrice proteinasi metalloproteinasi-10 (MMP-10) e catepsina F. Questa terapia accelerato la guarigione delle ferite nei diabetici cornee anche se solo il vano di cellule staminali limbari è stato trasdotto. I migliori risultati sono stati ottenuti con il trattamento combinato. Per possibile il trapianto del paziente di cellule staminali normalizzati, un esempio è presentato anche del optimizatisu di gene trasduzione in colture di cellule staminali arricchita utilizzando esaltatori policationici. Questo approccio può essere utile non solo per i geni selezionati, ma anche per gli altri mediatori di cicatrizzazione corneale epiteliale e gambo funzione delle cellule.

Introduzione

La malattia della cornea diabetica si traduce principalmente in epiteliale degenerativa (cheratopatia) e nervose modifiche (neuropatia). E 'spesso manifesta con le anomalie di epiteliale guarigione delle ferite e la riduzione dei nervi della cornea 1-4. Si stima che circa il 60-70% i diabetici hanno vari problemi corneali 1,3. I nostri studi hanno individuato una serie di proteine ​​marker con alterata espressione in cornee diabetici umani, compresa la down-regulation di c-met proto-oncogene (recettore del fattore di crescita degli epatociti) e l'up-regolazione di metalloproteinasi della matrice-10 (MMP-10) e catepsina F 5, 6. abbiamo anche documentato significativamente diminuita espressione di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi nelle cornee diabetici umani.

Negli studi precedenti, abbiamo sviluppato una terapia a base di adenovirale gene per normalizzare i livelli di marcatori diabete alterato con sistema di coltura di organi umani diabetica corneale, che mostra lenta guarigione delle ferite, diabeticomodifiche marcatori, e arginare la riduzione dell'espressione marker delle cellule simili alle ex vivo cornee 7,8. Questa persistenza di cambiamenti sembra essere dovuto alla presenza di epigenetica memoria metabolica 9. Questo sistema di coltura è stata ulteriormente utilizzati per la terapia genica. Gli obiettivi di questa terapia sono stati scelti da marcatori o con ridotta espressione in cornee diabetici (c-met proto-oncogene), o aumento dell'espressione (MMP-10 e catepsina F).

L'adenovirus (AV) la terapia è stata usata in tutto il cornee organo-colta o solo il corneosclerale vano limbare periferico. Questo comparto nutre le cellule staminali epiteliali che rinnovano l'epitelio corneale e partecipano attivamente alla guarigione delle ferite 4,10-15. Qui, i protocolli sono forniti per la cultura normale e diabetico umano corneale organo, epiteliale la guarigione delle ferite, l'isolamento e la caratterizzazione di cellule arricchita di colture di cellule staminali limbare, e la cella adenovirale e trasduzione corneale. Nostrorisultati dimostrano la fattibilità di questa terapia per normalizzare l'espressione marcatore e la guarigione delle ferite nei diabetici cornee per il trapianto possibile futuro. Essi inoltre suggeriscono che la terapia di combinazione è il modo più efficace per ripristinare il normale modello marcatore e la guarigione epiteliale nella cornea diabetica 16-18.

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Protocollo

La malattia Nazionale delle Ricerche Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) ha fornito titolari di autorizzazione post mortem sani e diabetici occhi umani e cornee. protocollo di raccolta dei tessuti umani di NDRI è stato approvato dal comitato direttivo e soggetti a National Institutes of supervisione Salute. Questa ricerca è stata condotta sotto la omologato Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) protocollo esenti EX-1055. Collaborare chirurghi corneali, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, forniti cerchi corneosclerale di scarto per l'isolamento di colture di cellule epiteliali corneali arricchito staminali. Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del protocollo IRB approvato Pro00019393.

1. umana corneale Cultura Organo

Nota: cornee normali e diabetici o gli occhi interi vengono ricevuti nel supporto di memorizzazione della cornea raffreddato (ad esempio, Optisol GS) entro 48 ore dopo la morte dal fornitore nazionale NDRI.

  1. Rimuovere le cornee da contenitore di stoccaggio con una pinza e lavarli due volte in il (ABAM) miscela antibiotico-antimicotico. In caso di occhi interi, tagliare le cornee fuori dai globi con forbici curve. Lasciare almeno 5 mm Cerchio congiuntivale e anche lavare le cornee in ABAM.
  2. Preparare la miscela da collocare nella concavità corneale. Consiste in mezzo privo di siero minimo essenziale (MEM) contenente ABAM, 1 mg / ml di vitello collagene della pelle (fatto da una soluzione stock di 10 mg / ml di acido 0,1 N acetico), 1% agar, e insulina-transferrina selenite integrare 7.
  3. Microwave questa miscela all'ebollizione per la sterilizzazione e dissoluzione agar. Si può richiedere fino a 1 minuto per ogni cosa a sciogliere. Lasciare il tappo della provetta parzialmente aperta, perché la miscela trabocca facilmente quando bolle. Per questa ragione, possono essere necessari più cicli ebollizione, ciascuno per 10-15 sec. Raffreddare il composto di 37-39 ° C.
  4. Posizionare le cornee lato epiteliale nel sterili 60 mm piatti. Riempire la concavità corneale con circa 0,5 ml della miscela descritta in 1.2. Ilmiscela solidifica sulle cornee all'interno 2 min.
  5. Posizionare le cornee lato agar verso il basso in piatti sterili da 60 mm e aggiungere il supporto completo contenente MEM con ABAM, e insulino-transferrina-selenite supplemento 7 (37 ° C) per mantenere il suo livello approssimativamente al limbus per la cultura interfaccia aria-liquido. Il volume medio è di 7-8 ml per piatto.
  6. Porre le capsule con le cornee in un incubatore CO 2 5% umidificata con una vaschetta dell'acqua (in questo modo, il livello di umidità è mantenuta pari o superiore al 95%) a 35 ° C (temperatura normale corneale). Aggiungere 100 microlitri di media (due gocce) ogni giorno sul dell'epitelio per inumidire le cornee.
  7. Monitorare la morfologia corneale e la vitalità delle cellule epiteliali microscopio in luce trasmessa utilizzando un microscopio standard con un obiettivo di 4X. Farlo una volta al giorno.
  8. Cambiare la media ogni tre giorni. Le cornee possono essere coltivate per almeno tre settimane. Per gli esperimenti di terapia genica, la cultura le cornee per 3-5 giorni, poi transduce con i geni di interesse (4,1-4,4), lascia per altri 3-5 giorni a seconda del transgene e soggetti al protocollo guarigione delle ferite (2.1-2.4).

2. La guarigione delle ferite epiteliale

Nota: Nelle cornee diabetici, il debridement epiteliale raschiamento meccanico non è fattibile perché la fragile membrana basale dell'epitelio si stacca nel processo, che non avviene nelle cornee normali. Pertanto, per mantenere le cornee normali e diabetici in condizioni simili di guarigione delle ferite, rimozione chimica dell'epitelio con n-eptanolo viene utilizzato 19. Questa procedura rimuove l'epitelio ma lascia dietro una membrana basale intatta in entrambe le cornee normali e diabetici.

  1. Per eseguire centrale epiteliale sbrigliamento 20, inserire un disco di carta filtro di 5 millimetri imbevuta di n-eptanolo sulla superficie anteriore della cornea centrale per 75 sec.
  2. Rimuovere il filtro e lavare le cornee in piena media. Riempire la concavità con 0,5 ml di agar-collagenemiscela e della cultura come in 1.4. Dopo debridement, le cellule epiteliali di solito muoiono e slough off lasciando intatto microscopio membrana basale 7.
  3. Utilizzare 8,5 mm dischi per creare grandi ferite epiteliali negli esperimenti con solo terapia genica limbare. Ciò garantirà il coinvolgimento delle cellule staminali del limbus nel processo di guarigione.
  4. Monitorare la guarigione della cornea al microscopio. Fare fotografie a 4X e 10X ogni giorno fino a quando il difetto epiteliale è completamente guarita. Il processo di guarigione può richiedere da 2 a 15 giorni a seconda dello stato (normale o diabetica) e le dimensioni della ferita.
    Nota: Durante il processo di guarigione, le cellule simili a ragni neri sono stati osservati sul piano focale superiore. Queste cellule sono apoptotici cheratociti stromali che sono morti dopo la rimozione dell'epitelio 4. La guarigione è determinato per essere completo quando queste cellule morte sono ricoperte da epitelio guarigione e non sono più visibili (Figura 2, nel riquadro).
  5. dopo la guarigionecompletamento, tagliare le cornee a metà, li incorporare in OCT compound e di processo per immunofluorescenza indiretta su sezioni al criostato o per Western blot 16,21.

3. Isolamento di cellule del limbus e manutenzione di colture cellulari staminali arricchita

Nota: Preparare la cellula primaria limbare epiteliali stelo (LESC) culture -enriched dai cerchi corneosclerale. I cerchi provenienti da donatori sani e scartati dopo trapianti di cornea vengono ricevuti dai chirurghi che collaborano nel supporto di memorizzazione della cornea standard (ad esempio, Optisol). Altrimenti, le culture LESC arricchita possono essere ottenuti dai cerchi asportati dalle normali e diabetici cornee interi o globi ricevuti dal NDRI nel supporto di memorizzazione corneale.

  1. Se si utilizzano le intere cornee o globi, prima di isolare le zone limbari. Per fare ciò, posizionare la cornea su un piatto di plastica sterile con lato epiteliale e rimuovere la zona centrale con un trapano 9 mm (coltello corneale circolare).Eliminare questa parte centrale. Poi asportare la zona limbare utilizzando un trapano da 13 mm e scartare la parte esterna congiuntivale. Per isolare le cellule utilizzano il bordo limbare bagel-like. Prima di isolamento delle cellule, rimuovere le cellule endoteliali e aderenti resti dell'iride dal lato interno della cornea opposta all'epitelio superficie con un tampone di cotone sterile.
  2. Isolare fogli di cellule del limbus con trattamento dispasi. Incubare ciascun bordo corneosclerale con 2.4 U / ml dispasi II in 1,5 ml di cheratinociti mezzo privo di siero (KSFM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS) a 37 ° C per 2 ore 22.
  3. Delicatamente facilitare strato di cellule epiteliali limbari dal cerchio sotto un microscopio da dissezione stereo con una pinza e dissociare le cellule in 1 ml di 0,25% tripsina - soluzione EDTA 0,02% per 30 minuti a temperatura ambiente.
  4. Lavare le cellule in 10 ml di terreno (ad esempio, Epilife) e pellet a 300 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Risospendere °e le cellule in terreno di coltura: media con N2, B27 e integratori di crescita dei cheratinociti umani, e 10 fattore ng / ml di crescita epidermico (EGF).
  6. Seme le cellule a 3.000-5.000 cellule / ml in flaconi o 60 piatti mm rivestiti con una miscela di proteine ​​di membrana basale umana compresa fibronectina, collagene di tipo IV e laminina (FCL), a 0,5-1 mg / cm 2, in KSFM medie.
  7. Cultura le cellule in un umidificata (95% o superiore umidità) CO 2 incubatore a 37 ° C fino a formare monostrati confluenti completamente. Questa operazione potrebbe richiedere 1-2 settimane.
    Nota: Regolarmente confermare l'identità delle cellule con colorazione immunocitochimica positivo per i marcatori LESC putativi tra cui PAX6, la cheratina (K) 14, K15, K17, e ΔNp63α. I dettagli di colorazione tra cui gli anticorpi primari sono stati pubblicati 8,16-18,22.
  8. Per passare le cellule confluenti, trattarli in un 1 ml 0,05% tripsina (1: 5 diluizione della soluzione di 0,25%) per 10 min a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di soia trsoluzione inibitore ypsin (10 mg / ml) diluito 1: 4 in media, e centrifugare le cellule come in 3.5.
  9. Lavare il pellet cellulare in 3 ml di soia soluzione diluita inibitore della tripsina. Piastra le cellule su FCL-rivestito (vedi 3.7) piatti o le diapositive da camera in vetro a 2 x 10 4 cellule / ml.

4. trasduzione adenovirale delle cornee organo-colta

Nota: I adenovirus ricombinanti (AV) includono AV-vettore (nessun gene inserito), AV-CMET (con il gene aperta griglia di lettura c-met), AV-shM10 (con shRNA di MMP-10), e AV-shCF ( con shRNA di catepsina F). Sono E1 / E3-cancellato Tipo 5 AV esprimere geni sotto il controllo del grande promotore immediato precoce citomegalovirus. I virus AV-CMET sono generati utilizzando AV vettore pad / CMV / V5-DEST 16. I virus AV-shRNA sono personalizzati generati da subcloning di sequenze shRNA con HH1 promotore e GFP sequenza di tag da iLenti-EGFP vettore in una Huma replica-incompetente (E1 / -E3)n tipo AV 5 genoma utilizzando adeno-4 sistema di espressione 17.

  1. Trasdurre una cornea organo-colta di ogni coppia con AV-vettore e un altro cornea, con un AV espressione genica-modulante. Utilizzare l'AV-CMET a 0,8 a 1,25 x 10 8 unità formanti placca (PFU) per cornea in terreno di coltura per 48 ore a 37 ° C mantenendo le cornee sotto la superficie del terreno ciascuno in un pozzo di un piatto da 24 pozzetti. Utilizzare i virus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu per cornea.
  2. Utilizzare i virus per la trasduzione in piena media integrato con 75 mg / ml sildenafil citrato. Questo reagente attiva il trasporto caveolina facilitare l'assorbimento virale da parte delle cellule epiteliali 21. A causa della breve emivita del sildenafil in soluzioni acquose, aggiungere nuovamente la stessa quantità al mezzo 4-5 hr tardi. Il trattamento standard è per 48 ore.
  3. Trasferimento cornee a nuovi piatti con un finale rotondo spatola sterile e cultura nel mezzo senza AV mantenere il livello medio al limbus. Dopo l'addtransi- 4-8 giorni all'interfaccia liquido-aria, processo le cornee AV-trattati per varie analisi o di prova per epiteliale guarigione della ferita (vedi sopra). Ordinariamente inumidire le cornee in coltura aggiungendo 100 microlitri di media (due gocce) sulla parte superiore della cornea.
  4. Per la trasduzione delle sole cellule del limbus, incubare i virus con le cornee all'interfaccia aria-liquido con livello medio al limbus, per evitare trasduzione dell'epitelio centrale.

5. Trasduzione adenovirale di cellule in coltura limbare

  1. Mantenere le culture LESC-arricchito nel mezzo con 10 ng / ml EGF (vedi 3.5) su piatti di plastica rivestiti con la miscela FCL a 0,5 mg / cm 2.
  2. Trasdurre cellule in coltura che hanno raggiunto il 70-80% di confluenza con l'AV ospitare il gene della proteina fluorescente verde (AV-GFP) o AV-strapazzate shRNA-GFP in una serie di molteplicità di infezione (MOI: 1-300 pfu / cell) , nel mezzo con 2 ng / ml EGF. Eseguire la transduction per 4 ore a 37 ° C in un volume minimo (0,2 ml), seguita da 20 ore in 0,5 ml di mezzo. La caveolina sildenafil trasporto attivatore non è necessaria per la trasduzione coltura cellulare.
  3. Utilizzare uno dei seguenti reagenti che facilitano il legame alla superficie cellulare AV per migliorare l'efficienza AV trasduzione: o policationi (1 mg / ml di poli-L-lisina o 5 mg / polibrene ml), o 6 microlitri / ml trasduzione reattivo ( ad esempio, ViraDuctin), o 20 microlitri / ml enhancer trasduzione (ad esempio, ibiBoost).
  4. Dopo aver sostituito il mezzo per una senza l'AV, incubare cellule coltivate per 4 giorni, nella umidificata CO 2 incubatore e valutare il livello di espressione GFP usando un microscopio a fluorescenza invertito.
  5. Utilizzare il test la guarigione della ferita zero per valutare la migrazione delle cellule nelle colture AV-trasdotte. Far crescere le cellule nelle diapositive da camera pozzetti. Effettuare le ferite in un monostrato da graffi cellule in un movimento lineare dritto con un PI 200 plPette punta. Dopo ferendo, cambiare il mezzo per una fresca per rimuovere le cellule staccate.
  6. Fotografare le ferite ogni giorno con una fotocamera digitale collegata ad un microscopio invertito a 4X ingrandimento. Registra il tempo in cui la guarigione è completa (ai bordi della ferita vengono a contatto lungo tutta la ferita).

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Risultati

Abbiamo precedentemente dimostrato che nelle culture organo corneali, le differenze nell'espressione di marcatori diabetici (per esempio, proteine ​​della membrana basale e integrina α3β1) e la guarigione della ferita tra le cornee normali e diabetici sono conservati. Questo sistema di coltura è stato sottoposto alla terapia genica finalizzato a normalizzare i livelli dei marcatori diabete alterati, c-met, MMP-10 e catepsina F.

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Discussione

La cornea sembra essere un tessuto ideale per la terapia genica per la sua posizione superficie in cui il gene delivery, nonché la valutazione della efficacia e gli effetti collaterali, sono facili. Tuttavia, una traduzione clinica di questo approccio potente è ancora lento a causa della scarsa informazione sulle cause genetiche delle malattie corneali e gli obiettivi di terapia genica 24. Complicanze del diabete, tra cui alterazioni corneali possono essere in gran parte epigenetica in natura, che si traduce ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari.

Ringraziamenti

Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario di NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), la sovvenzione CTSI UL 1RR033176 (AVL) e le sovvenzioni del Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
terreno minimo essenzialeThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS Bausch & Lomb50006-OPT
ABAM miscela antibiotico-antimicoticaThermo Fisher Scientific15240062
collagene di pelle di vitello Sigma-Aldrich C9791
agar, grado per coltura tissutaleSigma-Aldrich A1296
n-eptanoloSigma-Aldrich 72954-5ML-F
O.C.T. composto VWR International25608-930
Dispase IIRoche Applied Science4942078001
terreno privo di siero per cheratinociti (KSFM) Thermo Fisher Scientific17005042
EpiLife medium con calcioThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 medium integratore, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 medium integratore, 50xThermo Fisher Scientific17504-044
integratore per la crescita dei cheratinociti umani, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
tripsina 0,25% - EDTA 0,02% con rosso fenoloThermo Fisher Scientific25200056
tripsina 0,25% con rosso fenoloThermo Fisher Scientific15050065
inibitore della tripsina di soia...Sigma-Aldrich T6414
siero fetale bovinoThermo Fisher Scientific26140079
integratore di insulina-transferrina-selenito (ITS)Sigma-Aldrich I3146-5ML
anticorpo contro cheratina 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253
anticorpo contro cheratina 15Santa Cruz Biotechnologysc-47697
anticorpo contro cheratina 17Santa Cruz BiotechnologySC-58726
anticorpo contro Δ NP63&alfa;Santa Cruz Biotechnologysc-8609
anticorpo contro PAX6BioLegendPRB-278P-100
anticorpo contro nidogen-1R& Sistemi DMAB2570
anticorpi contro integrina e alfa; 3β 1EMD MilliporeMAB1992
fibronectina umanaBD Biosciences354008
laminina umanaSigma-Aldrich L4445
collagene umano di tipo IVSigma-Aldrich Adenovirus C6745-1ML
che esprime MMP-10 shRNACapital BioSciencessu misura
che esprime catepsina F shRNACapital BioSciencessu misura
che esprime shRNA strapazzato e GFPCapital BioSciencessu misura
che esprime c-metOriGene (plasmide)SC323278
adenovirus che esprime GFPKeraFASTFVQ002
sildenafil citrato, 25 mgPfizerda farmacia
fattore di crescita epidermico.Thermo Fisher ScientificPHG0311
poli-L-lisinaSigma-Aldrich P4707
polibreneSigma-Aldrich 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Germania50301
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Spatola a punta tonda Corning Dow Corning3005
Piastre di Petri da 60 mmThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II vetrini per camera multipozzetto Sigma-AldrichC6807
200 μ l puntali per pipetteBioexpressP-1233-200altri fornitori disponibili
microscopio invertito NikonDiaphotaltri fornitori/modelli disponibili
umidificato CO2 incubatore Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)altri fornitori/modelli disponibili
microscopio fluorescenteOlympus, GiapponeBX-40altri fornitori/modelli disponibili
stereomicroscopio da dissezioneLeica, GermaniaS4 Ealtri fornitori/modelli disponibili
adenovirus adenovirus adenovirus

Riferimenti

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