Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.
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Articolo metodologico
Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere le alterazioni molecolari in cornee diabetici umani e dimostrare come possono essere alleviati con la terapia genica adenovirale in cornee organo-colta. La malattia corneale diabetica è una complicanza del diabete con frequenti anomalie dei nervi corneali e epiteliali guarigione delle ferite. Abbiamo anche documentato l'espressione significativamente alterato di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi in cornee diabetici umani. Per alleviare questi cambiamenti, la terapia genica adenovirale è stato implementato con successo utilizzando la up-regolazione dell'espressione proto-oncogene c-met e / o la sottoregolazione di matrice proteinasi metalloproteinasi-10 (MMP-10) e catepsina F. Questa terapia accelerato la guarigione delle ferite nei diabetici cornee anche se solo il vano di cellule staminali limbari è stato trasdotto. I migliori risultati sono stati ottenuti con il trattamento combinato. Per possibile il trapianto del paziente di cellule staminali normalizzati, un esempio è presentato anche del optimizatisu di gene trasduzione in colture di cellule staminali arricchita utilizzando esaltatori policationici. Questo approccio può essere utile non solo per i geni selezionati, ma anche per gli altri mediatori di cicatrizzazione corneale epiteliale e gambo funzione delle cellule.
Introduzione
La malattia della cornea diabetica si traduce principalmente in epiteliale degenerativa (cheratopatia) e nervose modifiche (neuropatia). E 'spesso manifesta con le anomalie di epiteliale guarigione delle ferite e la riduzione dei nervi della cornea 1-4. Si stima che circa il 60-70% i diabetici hanno vari problemi corneali 1,3. I nostri studi hanno individuato una serie di proteine marker con alterata espressione in cornee diabetici umani, compresa la down-regulation di c-met proto-oncogene (recettore del fattore di crescita degli epatociti) e l'up-regolazione di metalloproteinasi della matrice-10 (MMP-10) e catepsina F 5, 6.....
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Protocollo
La malattia Nazionale delle Ricerche Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) ha fornito titolari di autorizzazione post mortem sani e diabetici occhi umani e cornee. protocollo di raccolta dei tessuti umani di NDRI è stato approvato dal comitato direttivo e soggetti a National Institutes of supervisione Salute. Questa ricerca è stata condotta sotto la omologato Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) protocollo esenti EX-1055. Collaborare chirurghi corneali, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, forniti cerchi corneosclerale di scarto per l'isolamento di colture di cellule epiteliali corneali arricchito staminali. Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del protoc....
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Risultati
Abbiamo precedentemente dimostrato che nelle culture organo corneali, le differenze nell'espressione di marcatori diabetici (per esempio, proteine della membrana basale e integrina α3β1) e la guarigione della ferita tra le cornee normali e diabetici sono conservati. Questo sistema di coltura è stato sottoposto alla terapia genica finalizzato a normalizzare i livelli dei marcatori diabete alterati, c-met, MMP-10 e catepsina F.
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Discussione
La cornea sembra essere un tessuto ideale per la terapia genica per la sua posizione superficie in cui il gene delivery, nonché la valutazione della efficacia e gli effetti collaterali, sono facili. Tuttavia, una traduzione clinica di questo approccio potente è ancora lento a causa della scarsa informazione sulle cause genetiche delle malattie corneali e gli obiettivi di terapia genica 24. Complicanze del diabete, tra cui alterazioni corneali possono essere in gran parte epigenetica in natura, che si traduce .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari.
Ringraziamenti
Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario di NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), la sovvenzione CTSI UL 1RR033176 (AVL) e le sovvenzioni del Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| terreno minimo essenziale | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM miscela antibiotico-antimicotica | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| collagene di pelle di vitello | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, grado per coltura tissutale | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-eptanolo | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. composto | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| terreno privo di siero per cheratinociti (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium con calcio | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium integratore, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium integratore, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| integratore per la crescita dei cheratinociti umani, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| tripsina 0,25% - EDTA 0,02% con rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| tripsina 0,25% con rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| inibitore della tripsina di soia... | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| siero fetale bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| integratore di insulina-transferrina-selenito (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| anticorpo contro cheratina 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| anticorpo contro cheratina 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| anticorpo contro cheratina 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| anticorpo contro Δ NP63&alfa; | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| anticorpo contro PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| anticorpo contro nidogen-1 | R& Sistemi D | MAB2570 | |
| anticorpi contro integrina e alfa; 3β 1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| fibronectina umana | BD Biosciences | 354008 | |
| laminina umana | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| collagene umano di tipo IV | Sigma-Aldrich | Adenovirus C6745-1ML | |
| che esprime MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | su misura | |
| che esprime catepsina F shRNA | Capital BioSciences | su misura | |
| che esprime shRNA strapazzato e GFP | Capital BioSciences | su misura | |
| che esprime c-met | OriGene (plasmide) | SC323278 | |
| adenovirus che esprime GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrato, 25 mg | Pfizer | da farmacia | |
| fattore di crescita epidermico. | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polibrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germania | 50301 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Spatola a punta tonda Corning | Dow Corning | 3005 | |
| Piastre di Petri da 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II vetrini per camera multipozzetto | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μ l puntali per pipette | Bioexpress | P-1233-200 | altri fornitori disponibili |
| microscopio invertito | Nikon | Diaphot | altri fornitori/modelli disponibili |
| umidificato CO2 incubatore | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | altri fornitori/modelli disponibili |
| microscopio fluorescente | Olympus, Giappone | BX-40 | altri fornitori/modelli disponibili |
| stereomicroscopio da dissezione | Leica, Germania | S4 E | altri fornitori/modelli disponibili |
Riferimenti
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2....
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Ristampe e permessi
