Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

Summary

Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Abstract

Il recente sviluppo di una tecnica di analisi a singola cellula ad alto rendimento consente lo screening di nuovi enzimi basati su attività funzionali da una libreria metagenomica su larga scala¹. In precedenza abbiamo proposto un sistema di screening enzimatico genetico (GESS) che utilizza il regolatore del dimetilfenolo attivato dal fenolo o dal p-nitrofenolo. Poiché una grande quantità di reazioni enzimatiche naturali produce questi composti fenolici da substrati derivati dal fenolo, questo singolo sistema di screening genetico può essere teoricamente applicato per lo screening di oltre 200 diversi enzimi nel database BRENDA. Nonostante l'applicabilità generale della GESS, l'applicazione del processo di screening richiede una procedura specifica per raggiungere i segnali massimi della citometria a flusso. Qui, descriviamo in dettaglio il processo di screening sviluppato, che include la pre-elaborazione del metagenoma con GESS e il funzionamento di un selezionatore di citometria a flusso. Tre diversi substrati fenolici (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato) con GESS sono stati utilizzati per lo screening e l'identificazione di tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina), rispettivamente. Le attività enzimatiche metagenomiche selezionate sono state confermate solo con la citometria a flusso, ma il sequenziamento del DNA e diverse analisi in vitro possono essere utilizzate per un'ulteriore identificazione genica.

Introduction

Una tecnica saggio cella singola high-throughput recentemente sviluppato permette nuovi enzimi per essere sottoposti a screening da una libreria genetica su larga scala in base alla loro attività funzionali ^1. A livello di singola cellula, proteine ​​regolatrici della trascrizione sono impiegati per attivare l'espressione del gene reporter rilevando piccole molecole che sono prodotte come risultato di un'attività enzima bersaglio. Un primo approccio coinvolto l'isolamento di un operone fenolo-degradanti da Ralstonia eutropha E2 utilizzando l'espressione genetica substrato indotta metodo di retinatura (SIGEX), in cui il substrato induce l'espressione di una proteina reporter ^2. Nhar di Pseudomonas putida è stato utilizzato per selezionare benzaldeide deidrogenasi ^3, e LysG dal Corynebacterium glutamicum è stato utilizzato per lo screening high-throughput di un nuovo ceppo di L-lisina-produzione da diverse librerie di mutanti ^4.

In precedenza, un enzima screeni geneticaSistema ng (GESS) è stata proposta come una piattaforma di screening generalmente applicabile ^5. Questo sistema utilizza il regolatore dimetilfenolo fenolo-riconoscimento, DMPR, di P. putida. DMPR (E135K), e un mutante di DMPR, possono anche essere impiegati in GESS (pNP-GESS) per la rilevazione di p -nitrophenol (pNP). In presenza di enzimi bersaglio producono composti fenolici, GESS in E. coli emette un segnale di fluorescenza, consentendo il rapido isolamento di singole cellule utilizzando un cell sorter fluorescenza attivate (FACS). Ma l'espressione di enzima metagenomico sembra essere più debole di quella degli enzimi ricombinanti convenzionali; Pertanto, GESS è stato progettato per rilevare composti fenolici con la massima sensibilità per indagare la combinazione di ribosomiale sito di legame (RBS) e sequenze di terminazione con ottimali condizioni di funzionamento ^5.

Uno dei vantaggi fondamentali del GESS è che questo metodo unico permette teoricamente la proiezione di over di 200 diversi tipi di enzimi nel database BRENDA (Tabella 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) semplicemente utilizzando substrati diversi. E 'stato dimostrato che cellulasi, lipasi, e metil parathion idrolasi (MPH) può essere rilevato tramite PNP-GESS con substrati appropriati di p -nitrophenyl butirrato, p -nitrophenyl-cellotrioside, e parathion metile, rispettivamente, ^5. Recentemente, è stato dimostrato che una fosfatasi alcalina (AP), che è uno dei nuovi enzimi identificate utilizzando pNP-GESS, è il primo AP termolabile trovato in metagenomi marini adattati freddo ^6.

Qui, i dettagli del processo di screening è presentato con PNP-GESS rilevare le attività di tre diversi tipi di lipasi enzymes-, cellulasi, e fosfatasi alcalina -e identificare rapidamente nuovi enzimi candidati da una libreria metagenomica ^5,6. I processi includono metagenoma pre-elaborazione con PNP-GESS e la gestione di un flOW citometria sorter. Mentre dovranno essere sequenziato per ulteriore identificazione i successi ottenuti, questo protocollo riguarda la procedura fino ai gradini di conferma dell'attività enzimatica citometria a flusso.

Protocol

1. Preparazione della biblioteca metagenomica con PNP-GESS

1. Costruire una libreria metagenomica in E. coli con un vettore fosmid utilizzando un kit fosmid produzione biblioteca secondo il protocollo ⁵ del produttore.
2. Aliquotare 100 microlitri della libreria per conservazione a -70 ° C, che è una fonte di cellule libreria metagenomiche.
   Nota: La densità ottica di un campione misurato ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD ₆₀₀₎ di questa libreria stock è di circa 100.
3. Scongelare 100 ml di dotazione della biblioteca metagenomica sul ghiaccio e inoculare in un pallone da 500 ml contenente 50 ml di Luria-Bertani (LB) e 12,5 mcg / ml cloramfenicolo seguito da 37 ° C di incubazione per 2 ore.
4. Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 1.000 xg per 20 min a 4 ° C.
5. Risospendere il pellet rapidamente in 50 ml di acqua ghiacciata distillata (DW) e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C di nuovo.
6. resuspend il pellet in 50 microlitri DW ghiacciata con 10% (v / v) di glicerolo. Utilizzare 50 ml di questa aliquota cella per elettroporazione.
7. Mettere il composto di cellule electrocompetent 50 pl e pGESS (E135K) ⁵ DNA (100 ng) in una cuvetta elettroporazione ghiacciata e l'elettroporazione (1,8 kV / cm, 25 uF) la miscela.
8. Aggiungere rapidamente 1 ml di brodo eccellente ottimale con cataboliti repressione (SOC) di media e risospendere le cellule delicatamente.
9. Trasferire le cellule nel tubo 14 ml a fondo rotondo con una pipetta e incubare a 37 ° C per 1 ora.
10. Distribuire 500 ml di cellule recuperate su un LB di 20 x 20 cm Piatto quadrato contenente 12,5 mg / ml cloramfenicolo e 50 mg / ml di ampicillina. Incubare la piastra a 30 ° C per 12 ore.
11. Raschiare le colonie utilizzando un raschietto cellulare e raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml utilizzando supporti di memorizzazione cella ghiacciata.
12. Centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 10 ml di supporti di memorizzazione delle cellule gelideper raggiungere un OD ₆₀₀ di 100.
13. Aliquotare 20 ml di cellule per lo stoccaggio a -70 ° C.

2. Rimozione falsi positivi dalla libreria metagenomiche

1. Scongelare lo stock cellule biblioteca metagenomiche (dal punto 1.13) contenenti metagenomica fosmid DNA e pGESS (E135K) su ghiaccio.
2. Seminare 10 ml di cellule in 2 ml LB contenenti 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 4 ore.
3. Nel frattempo, accendere la macchina FACS e aprire il software di default FACS. Utilizzare le seguenti impostazioni: diametro della punta dell'ugello, 70 micron; Forward Scatter Area (FSC-A) sensibilità, 300 V-logaritmica di amplificazione; Side Scatter Area (SSC-A) sensibilità, 350 V-logaritmica di amplificazione; Fluoresceina isotiocianato Area (FITC-A) sensibilità, 450 V-logaritmica di amplificazione; parametro di soglia, FSC Un valore 5.
   Nota: Le impostazioni tipiche sono dateper il dispositivo FACS menzionata nella tabella dei materiali. Regolare le impostazioni per altri dispositivi FACS.
4. Diluire le cellule biblioteca metagenomiche dal punto 2.2 con l'aggiunta di 5 ml di campione in una provetta a fondo tondo da 5 ml contenente 1 ml di PBS.
5. Mettere il campione biblioteca diluito sul porto di carico dello strumento FACS e fare clic sul pulsante Carica sul Acquisizione Dashboard del software FACS.
6. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 1.500 eventi / sec facendo clic e il controllo dei pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto.
7. Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione di un foglio globale facendo clic sul pulsante Plot Dot nella barra degli strumenti. Regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi di singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono Porta nella barra degli strumenti.
8. Tracciare un istogramma con conta delle cellule contro log in scala FITC-A sul foglio di lavoro facendo clic sul pulsante Istogramma. Poi, regolare la tensione di CIC dal Cytomescheda Impostazioni ter sulla finestra di ispezione controllo tale che il picco della distribuzione a campana è inferiore a 10 ² di FITC-A.
9. Creare un registro in scala FSC-A vs. il registro FITC-Una trama cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale. Impostare un ordinamento cancello R2 del terreno con il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che il cancello si trova tra le cellule + 5% e -5% dal centro della distribuzione (cellule totali 10% intorno al picco della campana curva a forma).
10. Posizionare un tubo di raccolta contenente 1,2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo all'uscita dello strumento FACS e sort out 10 ⁶ cellule soddisfano sia la R1 e R2 cancelli.
11. Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice.

3. metagenomiche Enzyme Screening

1. Incubare le cellule ordinati (dal punto 2.11) a 37 ° C con agitazione a 200 giri al minuto fino a quando la OD ₆₀₀ raggiunge 0,5.
2. Aggiungere 1 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm.
3. Per preparare cellule selezionare, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate e un substrato (p -nitrophenyl acetato, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, oppure fenile fosfato) in una provetta da 14 ml a fondo rotondo a una concentrazione finale di 100 pM.
   1. Per un campione di controllo, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate da Passaggio 3.2 in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passo 3.3.
4. Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore.
5. Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come punto 2.3.
6. Aggiungere 5 ml di cellule (per l'ordinamento) e cellule di controllo a due provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente.
7. Collocare la provetta contenente cellule di controllo Onto tegli caricamento porto delle FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto.
8. Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale del software e regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono porta sul barra degli strumenti.
9. Creare log in scala FSC-A vs log in scala coniugati con un grafico a dispersione, cliccando sul pulsante Plot Dot sul foglio di lavoro e impostare un ordinamento porta R2 sulla trama utilizzando il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che meno dello 0,1% di cellule negative vengono rilevati all'interno del cancello R2.
10. Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione di smistamento, e regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto.
11. Posizionare un tubo di raccolta contenente 0,5ml LB all'uscita dello strumento FACS e sort out 10 ⁴ cellule soddisfano entrambe le porte R1 e R2.
    Nota: Il criterio di ordinamento può variare da cima 0,1% al 5% di FITC-A nel cancello R2. In questo protocollo, top cellule 1% sono state raccolte come positivi.
12. Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice.
13. Distribuire i 0,5 ml campioni raccolti su due piastre di agar (90 mm piatti Petri) contenenti LB, 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.
14. Se necessario, eseguire ulteriori cicli di smistamento per FITC-A arricchimento ripetendo i passaggi 3.1-3.14.

4. Hit Selezione e Enzyme Activity Conferma

1. Citometria a flusso
   1. Dalla piastra di incubazione a Passo 3.14, selezionare una colonia mostrando alcuna fluorescenza utilizzando un selettore colonia sotto l'osservazione di 488 nm lunghezza d'onda di un illuminatore a LED.
   2. Inoculare la colonia selezionata in un 14-ml round fondo provetta contenente 2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo a 37 ° C con agitazione a 200 rpm fino alla sua OD ₆₀₀ raggiunge 0,5.
   3. Aggiungere 2 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm.
   4. Preparare un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere 1 ml di cellule in coltura (Fase 4.1.3). Aggiungere un substrato (acetato p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, oppure fenile fosfato) ad una concentrazione finale di 100 mM.
      1. Per un controllo, aggiungere i 1 ml cellule coltivate dal punto 4.1.3 in un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passaggio 4.1.4.
   5. Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore.
   6. Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come Passo 2.3.
   7. Aggiungere 5 ml di cellule di controllo e supporto trattato di provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente.
   8. Mettere le cellule di controllo tubo contenente il porto di carico del dispositivo FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto.
   9. Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A.
   10. Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione substrato trattato. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto.
   11. Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A.
   12. Confrontare la fluorescenza dei due gruppi di cellule tracciando un istogramma del numero di cellule vs. log scalata FITC-A.
2. Altri test per confermare l'attività enzimatica
   1. Per ulteriore identificazione dei candidati enzimi selezionati, estrarre il DNA fosmid usando l'estrazione pro di serieprocedure dei kit di estrazione commerciali e analizzare la sequenza nucleotidica, o testare l'attività enzimatica in vitro ^6,7.

Results

I tre substrati fenolici sono stati esaminati per identificare gli enzimi metagenomiche nuovi da una libreria metagenoma di sedimenti piane oceaniche delle maree a Taean, Corea del Sud, seguendo il protocollo proposto. Per la costruzione della libreria, medi 30 - 40 kb sequenze metagenoma sono stati inseriti fosmidi, che si basano sul E. coli F fattore replicone e presentato come una singola copia in una cella. Si noti che fosmidi sono stati ampiamente utilizzati per la costruzi...

Discussion

Aumentare l'efficienza della produzione di biocatalizzatori è una chiave per il successo di bio-chimico a base industria ⁹ e metagenoma è considerato uno dei migliori fonte enzima naturale. In questo senso, è essenziale lo screening di nuovi enzimi dalla metagenome dove la maggioranza delle risorse genetiche non sono state esplorate ^10. Diversi metodi di screening sono stati sviluppati che rilevano direttamente i prodotti enzimatici utilizzando attivatori trascrizionali ^{11, 12} ma que...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
libreria CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid
Soluzione di induzione CopyControl	Epicentre	CCIS125	Soluzione di induzione di copie Fosmid
EPI300	Epicentre	EC300110	Cella elettrocompetente
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	vettore Fosmid
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Sistema di elettroporazione per cuvette ed elettroporazione
FACSAria III	Becton Dickinson		Citometria a flusso (macchina FACS)
Nikon		AZ100M
UltraSlim	Illuminatore LED	per estrogeni
Tubo conico da 50 ml	BD Falcon
Tubo a fondo tondo da 14 ml.	BD Falcon
5-ml tubo a fondo tondo	BD Falcon
p-nitrofenil fosfato	Sigma-Aldrich	N7653	Substrato
p-nitrofenile β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrato
p-nitrofenil butilato	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp;	substrato
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Triptone 10 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, Cloruro di sodio 10 g/L
Brodo Super Optimal (SOB)	BD Difco	244310	Triptone 20 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, Cloruro di sodio 0,5 g/L, Solfato di magnesio 2,4 g/L, Cloruro di potassio 186 mg/L
Brodo Super Optimal con repressione dei cataboliti (SOC)		SOB, 0,4 %
glucosio 2x Estratto di lievito Triptone (2xYT)	BD Difco	244020	Digestato pancreatico di caseina 16 g/L, estratto di lievito 10 g/L, estratto di lievito 5 g/L
Terreni			2x brodo YT, 15% glicerolo, 2% glucosio
pGESS(E135K)			Un vettore di DNA contenente i geni dmpR, egfp con i loro promotori appropriati, RBS e terminator. Vedere il riferimento 5 nel manoscritto per Maggiori dettagli.
Cloramfenicolo	Sigma	C0378
Ampicillina	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Citometria a flusso Versione software 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4