Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di amiloide Ap placche in modelli murini della malattia di Alzheimer con metossi-X04, che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega alla beta-pieghe fogli trovati nella fitta principali placche Ap selettivamente. Esso consente di pre-screening delle sezioni di tessuto placca contenenti prima dell'immunocolorazione ed elaborazione per la microscopia elettronica.
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Articolo metodologico
Correlativo luce e microscopia elettronica allo Studio microgliali Interazioni con placche beta-amiloide
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un protocollo dettagliato è fornito qui per identificare amiloidi Ap placche nelle sezioni del cervello di modelli murini della malattia di Alzheimer prima pre-embedding immunostaining (in particolare per ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1 (Iba1), un calcio proteina legante espressa da microglia) e la lavorazione dei tessuti per microscopia elettronica (EM). Metossi-X04 è un colorante fluorescente che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega ai fogli beta a pieghe si trovano in fitto nucleo placche Ap selettivamente. Iniezione degli animali con metossi-X04 prima del sacrificio e la fissazione del cervello consente di pre-screening e selezione delle sezioni di cervello placca contenenti per l'ulteriore elaborazione con manipolazioni in termini di tempo. Ciò è particolarmente utile quando si studia la patologia AD presto all'interno delle regioni specifiche del cervello o strati che possono contenere pochissime targhe, presenti in solo una piccola frazione delle sezioni. trattamento post-mortem di sezioni di tessuto con Rosso Congo, Thioflavin S, e ThioflAvin T (o anche con metossi-X04) possono etichettare fogli beta-pieghe, ma richiede una compensazione con etanolo per rimuovere colorante in eccesso e queste procedure sono incompatibili con la conservazione ultrastrutturali. Sarebbe anche inefficiente per realizzare un'etichettatura per Ap (e altri marcatori cellulari quali Iba1) su tutte le sezioni di cervello dalle regioni di interesse, solo per produrre una piccola frazione contenente placche Ap nella posizione giusta. È importante sottolineare che, placche Ap sono ancora visibili dopo la lavorazione dei tessuti per EM, permettendo una precisa identificazione delle aree (in genere fino a pochi millimetri quadrati) esaminare con il microscopio elettronico.
Introduzione
Amiloide Ap formazione della placca è il principale segno distintivo neuropatologici della malattia di Alzheimer (AD). Tuttavia crescente evidenza suggerisce un ruolo importante del sistema immunitario nella progressione della malattia 1,2. In particolare, i nuovi dati provenienti da studi preclinici e clinici stabiliti disfunzione immunitaria come un driver principale e collaboratore di AD patologia. Con questi risultati, le cellule immunitarie centrali e periferiche sono emersi come bersagli terapeutici promettenti per AD 3. Il seguente protocollo combina luce e microscopia elettronica (EM) per generare nuove intuizioni sulla relazione tra la ....
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Protocollo
Nota: Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in base alle direttive del comitato etico degli animali istituzionale, in conformità con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali come amministrato dal Comitato Animal Care di Université Laval. APP-PS1 topi maschi tra i 4 ei 21 mesi di età sono stati utilizzati. Questi animali sono stati alloggiati in un ciclo luce-buio 12 ore a 22 - 25 ° C, con libero accesso a cibo e acqua.
1. Metossi-X04 Solution Preparazione
- Preparare a 5 mg / ml soluzione di metossi-X04 9 sciogliendo metossi-X04 in una soluzione contenente il 10% dimetilsolfossido (D....
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Risultati
Questa sezione illustra i risultati ottenibili in diverse fasi critiche del protocollo. In particolare, i risultati mostrano esempi di sezioni del cervello che contengono metossi-X04 placche macchiati della regione specifica e strati di interesse: il CA1 dell'ippocampo, radiatum strati, e lacunosum-moleculare. Le placche e l'organizzazione regionale / lamellare dell'ippocampo sono successivamente visualizzati utilizzando una combinazione di filtri UV e in campo chiaro
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Discussione
Questo protocollo spiega un approccio correlativo per il targeting denso nucleo placche Ap con EM. Metossi-X04 a iniezione vivo permette una rapida selezione di sezioni del cervello che contengono placche Ap all'interno di particolari regioni e strati di interesse, ad esempio, il CA1 dell'ippocampo, radiatum strati, e lacunosum-moleculare. Nel presente esempio, metossi-X04 pre-screening è stato combinato con pre-embedding immunocolorazione per Iba1 per studiare come i diversi fenotipi microglia.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati alla dottoressa Sachiko Sato e a Julie-Christine Lévesque della piattaforma di bioimaging del Centre de recherche du CHU de Québec per la loro assistenza tecnica. Le sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, della Banting Research Foundation e della Scottish Rite Charitable Foundation of Canada a M.E.T hanno sostenuto questo lavoro.
H.E.H. ha ricevuto una borsa di studio dal Ministero dell'Istruzione e dell'Istruzione Superiore libanese, e K.B. dalla Faculté de médecine dell'Université Laval.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | substrato da 10 mg per compressa |
| Glicole propilenico | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Attenzione: tossico |
| Cloruro di sodio NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodio fosfato monobasico monoidrato | Sigma | S9638 | |
| Sodio fosfato bibasico | Sigma | S0876 | |
| Tris cloridrato | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acroleina | Sigma | 110221 | Attenzione: Microscopia |
| elettronica | granulare con paraformaldeide | Scienze 19210 | Attenzione: |
| Carta da filtro | Fisher | 09-790-14F | |
| Pompa peristaltica con tubo | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Set per la raccolta del sangue alato Aghi 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Pinza extrafine | F.S.T | 11152-10 | Forma della punta: curva |
| Forbici | F.S.T | 14090-09 | Forma della punta: dritta |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Forma della punta: curva |
| Forbici chirurgiche | F.S.T | 14004-16 | Forma della punta: dritta |
| Forbici per micro dissezione | ROBOZ negozio chirurgico | 5818 | |
| Fiale di scintillazione in vetro | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Microtomo a lama vibrante Leica VT1000 S | Leica Biosystems | ||
| Lame del vibratomo | Microscopia elettronica Scienze | 71990 | |
| Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Piastre per colture tissutali a 24 pozzetti | Fisher Scientific | 353047 | |
| Glicole etilenico | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glicerolo | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Perossido di idrogeno, 30% | J.T.BAKER | gatto: 2186-01 | |
| Boroidruro di sodio | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Albumina sierica bovina (BSA), frazione V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Coniglio | WAKO | 019-19741 | |
| Capra Anti-Coniglio IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidina tetra-cloridrato (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Attenzione: |
| tetrossido di osmio tossico, soluzione al 4% | Microscopia elettronica Scienze | 19150 | Attenzione: |
| tossico Durcupan&commercio; Resina ACM monocomponente A | Sigma | 44611 | Attenzione: |
| Durcupan tossico ACM monocomponente B | Sigma | 44612 | Indurente Attenzione: Durcupan tossico |
| &commercio; Plastificante monocomponente ACM C | Sigma | 44613 | Attenzione: |
| Durcupan tossico ACM monocomponente D | Sigma | 44614 | Acceleratore Attenzione: |
| Etanolo | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Ossido di propilene | Sigma | 110205 | Attenzione: corrosivo |
| Alluminio pesare piatti | Microscopia elettronica Scienze | 70048-01 | |
| ACLAR® – Pellicole di fluoropolimeri Microscopia | elettronica Sciences | 50425 | |
| Forno/Incubatore | VWR |
Riferimenti
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher,....
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Ristampe e permessi
