Questo protocollo utilizza Golden Gate Assembly e il plasmide pGR-blue per quantificare rapidamente la forza dei terminatori presenti nel silico.
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Articolo metodologico
Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è consentire la verifica rapida dei terminatori identificati bioinformaticamente. Inoltre, il plasmide (pGR-Blue) è progettato specificamente per questo protocollo e consente la quantificazione dell'efficienza del terminatore. Come prova di concetto, sei terminatori sono stati identificati bioinformaticamente nel micobatteriofago Bernal13. Una volta identificati, i terminatori sono stati quindi realizzati come oligonucleotidi con le estremità appiccicose appropriate e ricotti insieme. Utilizzando il Golden Gate Assembly (GGA), i terminator sono stati poi clonati in pGR-Blue. Alla luce visibile, le colonie false positive appaiono blu e le colonie trasformate positivamente sono bianche/gialle. Dopo l'induzione di un promotore inducibile dell'arabinosio (pBad) con arabinosio, la forza della colonia può essere determinata misurando il rapporto tra la proteina fluorescente verde (GFP) prodotta e la proteina fluorescente rossa (RFP) prodotta. Con pGR-Blue, il protocollo può essere completato in soli tre giorni ed è ideale in un contesto educativo. Inoltre, i risultati mostrano che questo protocollo è utile come mezzo per comprendere le previsioni in silico dell'efficienza del terminatore legate alla regolazione della trascrizione.
Introduzione
I grandi progetti di biologia sintetica richiedono l'uso di terminatori di trascrizione altamente efficaci per aiutare a regolare l'espressione genica. L'identificazione di nuovi terminatori richiede l'analisi bioinformatica di nuovi genomi. Tuttavia, man mano che vengono sviluppate quantità crescenti di software bioinformatico, ciascuno con un algoritmo unico utilizzato per la previsione, si verifica una maggiore discrepanza tra i risultati putativi. Poiché questo processo è in qualche modo soggettivo e viene eseguito in silico, queste previsioni necessitano di conferma biologica. 1 Inoltre, il volume di terminatori putativi identificati attravers....
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Protocollo
1. Progettazione e ordinare oligonucleotidi con le appropriate Sticky Ends
- Identificare i potenziali terminatori Rho-indipendente attraverso l'analisi genomica utilizzando programmi che sono liberamente disponibili online. 7
- Quando si lavora con DNA a doppio filamento, determinare l'orientamento del terminatore da testare. 7 Il plasmide PGR-Blue verifica solo terminatori legatura in 5 'a 3' sulla parte superiore (filamento in avanti).
- Convertire un fondo (reverse) Strand terminatore al suo complemento invertita per riorientare la sequenza di test in PGR-blu utilizzando il software gratuito on-line, <....
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Risultati
Questo protocollo produrrà cellule contenenti PGR-blu con un terminatore legatura tra la GFP e RFP utilizzando il Golden Gate di montaggio (Figura 2). colonie positive contenenti inserto legatura possono essere selezionati in base al colore. Alla luce visibile colonie positive saranno bianco / giallo e falsi positivi produrranno colonie blu dopo 18-20 ore di incubazione a 37 ° C (Figura 3).
Do.......
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Discussione
Il passo più importante in questo protocollo è corretta progettazione oligonucleotide prima di ordinare. Gli oligonucleotidi devono avere le estremità coesive opportune aggiunte alla estremità 5 'della parte superiore e inferiore trefoli per garantire che GGA incorporazione è possibile. Inoltre, è importante cambiare l'orientamento delle terminazioni rivolto verso sinistra (terminatori che fermano la trascrizione sul filamento basso) a quella di destra di fronte (termina la trascrizione sul filo alto) terminator.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere Malcolm Campbell e Todd Eckdahl con il Genome Consortium per l'insegnamento attivo (GCAT) e il HHMI-Science Education Alliance - Cacciatori fagi Avanzando Genomica e Evolutionary Science programma (SEA-fagi).
Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Center for Research Resources (P20RR016460) e l'Istituto Nazionale di General Medical Sciences (P20GM103429) dal National Institutes of Health. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla National Science Foundation sotto concessione # IIA-1.457.888. (Ouachita Baptist University) fondi Inoltre ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Fogli sterili) | Excel Scientific | BS-25 | Fogli sterili solo |
| 10x T4 DNA ligasi Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | L'enzima non HF funzionerà ma è meno stabile al calore. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix a cui si fa riferimento nel protocollo. |
| T4 DNA ligasi | NEB | M0202S | |
| Rotondo Microcentrifuga Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillina sale sodico | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinosio | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinosio non indurrà il promotore pBAD |
| Luria Base (LB) - Brodo, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Ceppo JM109 | Zymo Research | T3005 | Utilizzare il protocollo di trasformazione raccomandato dall'azienda |
| ApE: Un software di editor di plasmidi | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, cloruro | Promega | H5121 | |
| (cristallino/biologico, certificato) | Fisher Chemical | S671 | |
| Sintesi commerciale di oligonucleotidi | Tecnologie integrate del DNA (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Piastre per colture tissutali per microtest - 96 pozzetti (sterile) | Micobatteriofago Falcon | 35-3072 | |
| "Bernal13" | Banca | genetica KJ510413 | |
| Acqua libera da nucleasi | Tecnologie integrate del DNA (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, a forma di L Hockey-Stick Cell Life | Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: uno strumento web per la previsione di terminatori di trascrizione Rho-indipendenti. |
Riferimenti
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability....
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Ristampe e permessi
