Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly

Sommario

Questo protocollo utilizza Golden Gate Assembly e il plasmide pGR-blue per quantificare rapidamente la forza dei terminatori presenti nel silico.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è consentire la verifica rapida dei terminatori identificati bioinformaticamente. Inoltre, il plasmide (pGR-Blue) è progettato specificamente per questo protocollo e consente la quantificazione dell'efficienza del terminatore. Come prova di concetto, sei terminatori sono stati identificati bioinformaticamente nel micobatteriofago Bernal13. Una volta identificati, i terminatori sono stati quindi realizzati come oligonucleotidi con le estremità appiccicose appropriate e ricotti insieme. Utilizzando il Golden Gate Assembly (GGA), i terminator sono stati poi clonati in pGR-Blue. Alla luce visibile, le colonie false positive appaiono blu e le colonie trasformate positivamente sono bianche/gialle. Dopo l'induzione di un promotore inducibile dell'arabinosio (pBad) con arabinosio, la forza della colonia può essere determinata misurando il rapporto tra la proteina fluorescente verde (GFP) prodotta e la proteina fluorescente rossa (RFP) prodotta. Con pGR-Blue, il protocollo può essere completato in soli tre giorni ed è ideale in un contesto educativo. Inoltre, i risultati mostrano che questo protocollo è utile come mezzo per comprendere le previsioni in silico dell'efficienza del terminatore legate alla regolazione della trascrizione.

Introduzione

I grandi progetti di biologia sintetica richiedono l'uso di terminatori di trascrizione altamente efficaci per aiutare a regolare l'espressione genica. L'identificazione di nuovi terminatori richiede l'analisi bioinformatica di nuovi genomi. Tuttavia, man mano che vengono sviluppate quantità crescenti di software bioinformatico, ciascuno con un algoritmo unico utilizzato per la previsione, si verifica una maggiore discrepanza tra i risultati putativi. Poiché questo processo è in qualche modo soggettivo e viene eseguito in silico, queste previsioni necessitano di conferma biologica. ¹ Inoltre, il volume di terminatori putativi identificati attraverso l'analisi in silico richiede l'uso di strategie di clonazione che possono essere completate in un lasso di tempo relativamente breve.

Il plasmide PGR-Blue è una modifica del plasmide PGR che è stato riprogettato per utilizzare il Golden Gate Assembly (GGA) per semplificare la procedura di clonaggio consentendo di eseguire simultaneamente tutte le fasi di reazione in una provetta per microcentrifuga. ^2,3 La selezione del colore è stata incorporata nel plasmide per aumentare la facilità di identificazione delle colonie positive. Una legatura riuscita dovrebbe essere bianco/giallo alla luce visibile e fluorescente al verde sotto la luce blu (450 nm) o ultravioletta (UV) se coltivata su piastre contenenti arabinosio. Poiché il pGR-blue non tagliato contiene una proteina cromografica blu (amilCP), le colonie contenenti un plasmide non modificato sono blu sotto la luce visibile. Questa semplificazione, insieme al protocollo semplificato, consente ai ricercatori di procedere dall'identificazione bioinformatica alla conferma biologica in tre o quattro giorni. La natura progettuale di questo sistema può essere vantaggiosa sia nel laboratorio di ricerca che in contesti educativi.

Il plasmide pGR-Blue permette la quantificazione della forza del terminatore. ⁴ Un singolo promotore inducibile dell'arabinosio viene utilizzato per produrre la proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina fluorescente rossa (RFP). Il terminatore viene clonato nel plasmide dopo la sequenza GFP ma prima della sequenza RFP, interrompendo così la trascrizione della proteina RFP. La forza del terminatore è determinata dal rapporto tra GFP prodotto e RFP prodotto.

Il rapporto Vision and Change⁵ ha suggerito che l'educazione in Scienza, Tecnologia, Ingegneria e Matematica (STEM) incorpora esperienze basate sulla ricerca in classe. ⁶ Tuttavia, ciò richiede lo sviluppo di protocolli che possono essere eseguiti da studenti con competenze limitate in un periodo di tempo definito. Sebbene il protocollo possa essere completato in soli tre giorni, è stato anche progettato in modo che ogni passaggio principale possa essere completato in un periodo di laboratorio settimanale separato (2-3 ore) per creare un'esperienza di ricerca del corso (CRE). Se utilizzata in questo modo, la procedura richiederà tra le tre e le sei settimane ed è appropriata sia per i corsi introduttivi che per quelli avanzati di Genetica, Biologia Cellulare o Bioinformatica.

Protocollo

1. Progettazione e ordinare oligonucleotidi con le appropriate Sticky Ends

1. Identificare i potenziali terminatori Rho-indipendente attraverso l'analisi genomica utilizzando programmi che sono liberamente disponibili online. ⁷
2. Quando si lavora con DNA a doppio filamento, determinare l'orientamento del terminatore da testare. ⁷ Il plasmide PGR-Blue verifica solo terminatori legatura in 5 'a 3' sulla parte superiore (filamento in avanti).
   1. Convertire un fondo (reverse) Strand terminatore al suo complemento invertita per riorientare la sequenza di test in PGR-blu utilizzando il software gratuito on-line, ad esempio, scimmia.
3. Dopo l'orientamento è determinato per essere corretta, aggiungere alla fine appiccicoso "5'-CGAC-3 '" al 5' estremità del filo superiore. Aggiungere fine appiccicoso "5'-CCGC-3 '" al 5' estremità del filo inferiore. ⁸ Questo assicurerà che inserto legatura sarà inserito nell'appositoorientamento utilizzando GGA.
4. Una volta che le sequenze sono determinati, ordinare come singoli oligonucleotidi bloccati commercialmente.

2. ricottura oligonucleotidi (si applica solo a liofilizzato DNA)

1. Risospendere singoli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 pM.
2. Fare 10x tampone ricottura: 1 M NaCl e 100 mM Tris-HCl pH 7,4. buffer di ricottura può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. Una volta buffer di ricottura è fatto e oligonucleotidi sono ri-sospesi, iniziare la ricottura ^8.
3. Per ogni terminazione da testare, aggiungere 16 ml di acqua ultra-pura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
4. Aggiungere 2 ml di 10x tampone di ricottura ad ogni provetta.
5. Aggiungere 1 ml di oligonucleotide filo superiore (100 micron) dal terminatore desiderato.
6. Aggiungere 1 ml di oligonucleotide fondo filamento (100 micron) dal terminatore desiderato.
7. Creare un bollente ba acquaesimo con un bicchiere di 1.000 ml contenente circa 400 ml di acqua di rubinetto e posto su un piatto caldo.
8. Mettere le provette da microcentrifuga dal punto 2.6 in un galleggiante e far bollire per 4 minuti. Dopo 4 minuti, spegnere il calore a piastre, ma lasciare il tubo e galleggiare nel bagno d'acqua per raffreddare lentamente O / N (18 ore) ^8. Conservare le terminazioni ricotto a -20 ° C.

3. Golden Gate Assembly (Mix Standard - Costo efficiente)

1. Fare un nM diluizione dei terminatori ricotto 40. Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi di 1 ml di Terminator mix ricotto (100 micron).
   1. campioni di centrifugazione per 30 secondi a 10.000 xg e memorizzare sul ghiaccio.
2. In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore in uso, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi.
3. Aggiungere 1 ml di commerciale DNA Ligase Buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl _2, 100 mM DTT, e 10 mm ATP]. Eseguire tutti i passaggi successivi su ghiaccio.
4. Aggiungere1 ml di PGR-blu (35-50 ng / ml) plasmide destinazione alla provetta.
5. Aggiungere 1 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta.
6. Aggiungere 0,5 microlitri commerciale ad alta fedeltà BsaI endonucleasi di restrizione alla provetta.
7. Aggiungere 0,5 microlitri di DNA ligasi commerciale alla provetta.
8. Centrifugare la miscela di reazione a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore.
9. Eseguire il programma termociclatore: 20 cicli di 1 minuto a 37 ° C seguita da 1 min a 16 ° C, seguiti da 1 ciclo di 15 min a 37 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C. ⁸

4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - tempo efficiente)

1. Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi a 1 l di 100 micron terminazioni creato nel passaggio 2. Questo diluisce la concentrazione di DNA di terminazione a 40 nm ricottura.Eseguire questo passaggio in una nuova, etichettato 1,5 ml provetta.
2. In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore, aggiungere 14 ml di acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che il nuovo tubo è etichettato di conseguenza.
3. Aggiungere 2 ml di Commercial Master Mix Buffer alla provetta.
4. Aggiungere 1 ml di PGR-Blue plasmide (35-50 ng / mL) alla provetta.
5. Aggiungere 2 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta.
6. Aggiungere 1 ml di Commercial Master Mix alla provetta.
7. Centrifugare il tubo di 40 Nm a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore.
8. Eseguire il programma termociclatore: 1 ciclo di 60 min a 37 ° C seguita da 1 ciclo di 15 min a 55 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C.

5. Trasformazione e selezione Colony

1. Preparare Luria Base (LB) piastre di agar Petri contenenti 1 mM concentratione di ampicillina (Amp) e una concentrazione di 10 mM di arabinosio (ARB). Preparare almeno 10 ml di 1 M L -arabinose soluzione madre perché questa soluzione madre verrà utilizzato nei passaggi successivi.
2. Utilizzare qualsiasi alta efficienza (10 ⁸ - 10 ⁹ trasformanti / mg) E. chimicamente competente coli (JM109), le cellule per la trasformazione. ⁹ Per ottenere i migliori risultati, aggiungere 3-5 ml della reazione legatura a 50 ml di cellule competenti. Quando si usano le cellule chimici competenti, seguire il protocollo di trasformazione specifico per le cellule utilizzate.
3. Stendere la metà (25 ml) delle cellule trasformate sul pre-riscaldato LB (Amp / ARB) piastre di agar utilizzando una sterile forma di L "bastone da hockey" e incubare O / N a 37 ° C. A causa del rapido tasso ampicillina di decomposizione, non incubare a 37 ° C superiore a 24 ore.
4. Eseguire la selezione delle colonie in base al colore mediante ispezione visiva. Una legatura di successo deve essere di colore bianco / giallo in luce visibile e fluorescenza verde undeR blu (450 nm) o la luce UV. Una legatura successo produrrà una colonia che è di colore blu sotto la luce visibile dopo 18 - 20 ore.

6. Verifica e quantificazione dei Terminator

1. Preparare 5 ml sterili tubi LB-brodo con 1 mM ampicillina e 10 mm arabinosio. Il numero di tubi necessari dipende dal numero di terminatori essere testati più controlli (cellule con resistenza all'ampicillina che non fluorescenti e cellule contenenti l'uncut plasmide PGR-blu).
2. Sotto la luce visibile raccogliere 2-3 colonie bianche / gialle (passo 5,4) utilizzando un'ansa sterile. Permettere ai campioni di incubare in brodi su un agitatore a 37 ° C e 160 rpm per 16-18 ore. Non incubare questi campioni per più di 24 ore.
   1. Facoltativamente, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità cellulare ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ per garantire un'adeguata crescita cellulare. In generale, un diametro esterno ₆₀₀ di ~ 0,8-1,0 si osserva dopo 16-18 ore di crescita.
3. Usouna piastra a 96 pozzetti sterili per i passaggi rimanenti. Eseguire questi passaggi in un ambiente asettico e in triplicato. Aggiungere 199 ml di brodo sterile LB + Amp / arabinosio (1 mM ampicillina / 10 mM arabinosio) in ciascun pozzetto. Includere camera sul piatto per tre comandi separati.
   1. Utilizzare i seguenti tre controlli: solo un bene (1) contenente brodo / arabinosio LB + Amp e un pozzo (2) per le cellule competenti non trasformate (vuote) per servire come un vuoto. Per la quantificazione (3) della forza terminatore, cellule contenenti non tagliati PGR originale o contenenti PGR-blu legatura con un non-terminazione sequenza dovrebbero essere incluse (controllo di riferimento per la quantificazione). Vedere la Figura 1 per il layout lettore di piastre.
4. Pipettare 1 ml di soluzione di cella dal O / N brodi in singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
5. piastre di tenuta con una copertura traspirante e agitare per 18-20 ore a 37 ° C e 160 giri al minuto.
6. Utilizzando un lettore di piastre, determinare OD ₆₀₀ con la letturaassorbanza a 600 nm. Misurare la fluorescenza GFP come segue: eccitazione 395 ed emissione 509. Misura RFP fluorescenza come segue: eccitazione 575 ed emissione 605. Dopo 18-20 ore, l'OD ₆₀₀ deve essere di circa 0,5.
7. Per normalizzare le variazioni nella crescita, utilizzare l'equazione: sia per la GFP e RFP.
8. Dopo la normalizzazione, determinare la resistenza di terminazione relativa utilizzando l'equazione

Risultati

Questo protocollo produrrà cellule contenenti PGR-blu con un terminatore legatura tra la GFP e RFP utilizzando il Golden Gate di montaggio (Figura 2). colonie positive contenenti inserto legatura possono essere selezionati in base al colore. Alla luce visibile colonie positive saranno bianco / giallo e falsi positivi produrranno colonie blu dopo 18-20 ore di incubazione a 37 ° C (Figura 3).

Do...

Discussione

Il passo più importante in questo protocollo è corretta progettazione oligonucleotide prima di ordinare. Gli oligonucleotidi devono avere le estremità coesive opportune aggiunte alla estremità 5 'della parte superiore e inferiore trefoli per garantire che GGA incorporazione è possibile. Inoltre, è importante cambiare l'orientamento delle terminazioni rivolto verso sinistra (terminatori che fermano la trascrizione sul filamento basso) a quella di destra di fronte (termina la trascrizione sul filo alto) terminator...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pGR-Blue Plasmid	Addgene	68374
pGR-Plasmid	Addgene	46002
AeraSeal-(Fogli sterili)	Excel Scientific	BS-25	Fogli sterili solo
10x T4 DNA ligasi Buffer	NEB
BsaI-HF	NEB	R3535S	L'enzima non HF funzionerà ma è meno stabile al calore.
NEB Golden Gate Assembly Mix	NEB	E1600S	Commerial Master Mix a cui si fa riferimento nel protocollo.
T4 DNA ligasi	NEB	M0202S
Rotondo Microcentrifuga Floating Rack	Nova Tech International	F18875-6401
Ampicillina sale sodico	Sigma Aldrich	A9518
L-(+)-Arabinosio	Sigma Aldrich	A-3256	D-Arabinosio non indurrà il promotore pBAD
Luria Base (LB) - Brodo, Miller	Sigma Aldrich	L1900
Luria Base (LB) - Agar, Miller	Sigma Aldrich	L2025
Tecan-Infinite M200 Plate Reader	Tecan
Mix & Go Competent Cells - Ceppo JM109	Zymo Research	T3005	Utilizzare il protocollo di trasformazione raccomandato dall'azienda
ApE: Un software di editor di plasmidi	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, cloruro	Promega	H5121
(cristallino/biologico, certificato)	Fisher Chemical	S671
Sintesi commerciale di oligonucleotidi	Tecnologie integrate del DNA (IDT)		http://www.idtdna.com/site
Piastre per colture tissutali per microtest - 96 pozzetti (sterile)	Micobatteriofago Falcon	35-3072
"Bernal13"	Banca	genetica KJ510413
Acqua libera da nucleasi	Tecnologie integrate del DNA (IDT)	IDT004
Sterile, a forma di L Hockey-Stick Cell Life	Science Products	6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	2000c
ARNold: uno strumento web per la previsione di terminatori di trascrizione Rho-indipendenti.