Articolo metodologico

Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l'imaging Fisiologicamente parametri importanti In Vivo

DOI:

10.3791/54068

⸱

26 settembre 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

In questo articolo

Sommario

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Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.

Abstract

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Dimostriamo un metodo superiore di 2D immagini spettrali-spaziale di stabili molecole giornalista radicali a 250 MHz con una rapida scansione elettrone-paramagnetica risonanza (RS-EPR), che può fornire informazioni quantitative in vivo condizioni sulla concentrazione di ossigeno, pH, redox lo stato e la concentrazione di molecole di segnale (cioè, OH •, NO •). La tecnica RS-EPR ha una maggiore sensibilità, una migliore risoluzione spaziale (1 mm), e tempo di acquisizione più brevi rispetto alla tecnica standard onda continua (CW). Una varietà di configurazioni fantasma sono stati testati, con risoluzione spaziale variabile da 1 a 6 mm, e la larghezza spettrale delle molecole giornalista vanno da 16 mT (160 mg) a 5 mT (50 G). Un cross-loop risonatore bimodale disaccoppia eccitazione e rilevamento, riducendo il rumore, mentre l'effetto di scansione rapida permette più potenza da immettere nel sistema di spin prima saturazione, aumentando il segnale EPR. Questoporta ad un sostanziale alto rapporto segnale-rumore rispetto esperimenti CW EPR convenzionali.

Introduzione

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Rispetto ad altri modalità di imaging medico, imaging a risonanza paramagnetica elettronica (EPRI) è l'unica in grado di immagine quantitativamente proprietà fisiologiche tra cui pH 1-3, pO2 4-7 temperatura 8, la perfusione e la vitalità dei tessuti 9, microviscosità e la facilità di diffusione di piccole molecole 10 e lo stress ossidativo 11. Stima della facilità di disolfuro scissione dal glutatione (GSH) nei tessuti e cellule 12,13 può riferire sullo stato redox. Per l'imaging in vivo, EPR nella gamma di frequenza compresa tra 250 MHz e 1 GHz è scelto perché queste frequenze forniscono sufficiente profondità di penetrazione nel tessuto (fino a diverse cm) per generare immagini per piccoli animali in cui intensità non sono diminuite da effetti perdite dielettriche. Frequenze più elevate, ad esempio 9,5 GHz 14 (X-banda) e 17 GHz (K u -BAND) 15,16 possono essere usate per l'imaging di pelle e capelli o celle singoleRispettivamente. Il successo di EPRI a tutte le frequenze dipende sonde di spin paramagnetiche che sono specifici per i tessuti in modo che la loro posizione e il destino Può essere stampato.

Se l'ambiente di una sonda spin elettronico è spazialmente eterogenea, lo spettro EPR è la somma dei contributi di tutte le posizioni. Imaging Spectral-spaziale divide il volume del campione in una serie di piccoli segmenti spaziali e calcola lo spettro EPR per ciascuno di questi segmenti 17. Questo permette mappatura dell'ambiente locale misurando la variazione spaziale nello spettro EPR. gradienti di campo magnetico sono utilizzati per codificare informazioni spaziali in spettri EPR, che sono chiamati proiezioni. L'immagine spettrale-spaziale viene ricostruito da queste proiezioni 18,19.

In RS-EPR il campo magnetico viene analizzato attraverso la risonanza in un tempo che è breve rispetto al tempo di rilassamento spin elettronico (Figura 2) 20,21. D econvolution del segnale rapido scan dà allo spettro di assorbimento, che è equivalente al primo integrale convenzionale spettro CW prima derivata. Il segnale rapida scansione viene rilevato in quadratura, in modo che entrambi i componenti di assorbimento e dispersione della risposta del sistema di spin vengono misurati. Questo è essenzialmente raccogliendo il doppio della quantità di dati per unità di tempo. Saturazione del segnale in un esperimento scansione rapida avviene a potenze superiori che per CW, così potenze superiori possono essere usate senza preoccupazione per la saturazione. 20,22 Molte altre medie può essere fatto per unità di tempo rispetto a CW. maggiore potenza, rilevamento quadratura diretta e più medie per unità di tempo combinano per dare scansione rapida un migliore rapporto (SNR) del segnale-rumore, specialmente di proiezioni alto gradiente che definiscono separazione spaziale, portando a immagini di qualità superiore. Per raggiungere circa lo stesso SNR per l'immagine di un fantasma richiesto circa 10 volte più a lungo per CW come per la scansione rapida 23.

tenda "> La maggiore SNR consente anche esperimenti a 250 MHz con bassa concentrazione di spin trap addotti formati dalla reazione di OH con 5-tert-butossicarbonil-5-metil-1-pyrroline- -oxide N (BMPO-OH), che sarebbe invisibili al metodo CW 24. Dinitroxides collegate con un linker disolfuro sono sensibili al clivaggio da glutatione, e così possono segnalare sullo stato redox cellulare. esiste Equilibrium, dipende dalla concentrazione di glutatione presente, tra le forme di- e mono-radicale. osservando questi cambiamenti richiede cattura dell'intero ampio spettro 5 mT, e può essere realizzato molto più velocemente con la scansione rapida EPR rispetto a intensificare il campo magnetico in un esperimento CW.

Un sistema completo di scansione rapida consiste di quattro parti: Lo spettrometro, il magnete principale campo, il conducente rapida della bobina di scansione e la scansione rapida cross-circuito risonatore. Lo spettrometro e la funzione principale campo magnetico stesso come in un esperimento CW, impostando il campo principale Zeemane raccogliendo i dati dal risonatore. Il driver rapida bobina scansione genera la scansione corrente sinusoidale che va in bobine scansione rapida appositamente progettati sulla scansione rapida cross-circuito risonatore. Le bobine di scansione rapidi alla scansione rapida risuonatore cross-ciclo generano un grande campo magnetico omogeneo, che viene spazzato a frequenze tra 3 e 15 kHz.

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Protocollo

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1. Installazione del driver Rapid Scan bobina a 250 MHz

  1. Calcolo del Rapid scansione condizioni sperimentali
    Nota: Il parametro più importante RS-EPR è velocità di scansione, α, che è il prodotto della frequenza di scansione e larghezza di scansione (Equazione 3). Per larghezze di scansione strette, velocità di scansione più veloce sono utilizzati, e per larghezze di sweep più ampi, vengono utilizzate velocità di scansione più lenti. Le seguenti istruzioni passo attraverso quest'ultimo caso e mostrano come arrivare ai parametri del driver bobina sperimentali di 7 mt di larghezza sweep e 6,8 kHz frequenza di scansione.
    1. Determinare la larghezza di banda risonatore (BW Res).
      figure-protocol-1 (1)
      dove v res è la frequenza di funzionamento del risonatore e Q è il fattore di qualità. Q = 90, è comune per il risonatore scansione rapida utilizzata per ottenere i dati in Risultati rappresentativi.
    2. Determinare la frequenza di scansione rapida, α, tuttodovuto dalla larghezza di banda risuonatore figure-protocol-2 (2)
      figure-protocol-3

      dove N è una costante spesso conservativamente selezionata per essere in 5-6, ΔB pp è la larghezza di riga derivata picco-picco in mT, e la velocità di scansione se T / s per un linewidth Lorentzian.
      Nota: Un valore comune per i radicali nella sezione rappresentante figure-protocol-4 = 0,1 mt. In confronto con meno letteratura scansione rapida; Equazione 2 deriva impostando la larghezza di banda del segnale (BW sig) pari a BW Res.
    3. Determinare la frequenza di scansione rapida massimo consentito dal tasso.
      figure-protocol-5 (3)
      figure-protocol-6
      dove w è la larghezza della scan ed f è la frequenza di scansione. Una larghezza di spazzata 7 mT coprirà il 100% dello spettro per sonde di corrente utilizzati in vivo. Utilizzare questo valore e il tasso calcolato (Equazione 2) per determinare la frequenza di scansione.
      figure-protocol-7
  2. Selezione di condensatori di sintonia e messa a punto di una rapida conducente bobina di scansione
    Nota: Il driver di rapida serpentina di scansione è in genere funzionano in modo risonante generare un'onda sinusoidale. Risonanza avviene ad una frequenza di scansione dove reattanze induttivi e capacitivi sono di ampiezza e opposti segni uguali, in modo che la reattanza totale è vicino a zero.
    1. Determinare la capacità corretta per la frequenza determinata 1.1.3 utilizzando l'induttanza, L, delle bobine di scansione rapida e (Equazione 4).
      figure-protocol-8
      figure-protocol-9
    2. Dividere C TOT da (Equazione 4) a metà per ottenere i valori dei condensatori per ciascun lato della scatola condensatore conducente bobina.
      figure-protocol-10
      figure-protocol-11
      Nota: Il driver rapido bobina di scansione è dotato di due amplificatori. Quando si seleziona un condensatore, la casella condensatore deve essere bilanciato con una capacità uguale su ciascun lato della scatola. Le due parti sono in serie.
    3. Svitare il coperchio superiore della scatola del condensatore e inserire condensatori su entrambi i lati che sono uguali al valore determinato nella fase 1.2.2.
    4. Sostituire la parte superiore della scatola condensatore e avvitare verso il basso per assicurarsi che rimane acceso.
    5. Utilizzando il pannello frontale del conducente coil risonante, regolare la frequenza di uscita fino a che la forma d'onda sinusoidale ha la massima ampiezza.

2. Preparazione dei reagenti e fantasmi

  1. Preparazione di radicals
    1. Rimuovere 15 N-PDT dal congelatore e consentire il contenitore di venire a temperatura ambiente (10-15 min).
    2. Pesare 1,4 mg di 15 N-PDT utilizzando una bilancia analitica.
    3. Aggiungere 1,4 mg di 15 N-PDT a 15 ml deionizzata (DI) H 2 O per una concentrazione finale di 0,5 mM.
      Nota: 4-oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) metil-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-carbamoil-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metil-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) e 3-carbossi-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metil-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-Proxyl) 25 (Figura 1E-G) radicali hanno stabilità a lungo termine (2 anni) in soluzione acquosa e a temperatura ambiente. Le loro forme solide sono generalmente memorizzati in un congelatore o frigorifero per mantenere questi radicali stabile per anni.La stabilità dei radicali nitrossidi generalmente li rendono non tossico, e la loro preparazione può essere fatto su un banco normale quando il solvente è acqua. Quando si usano solventi organici, preparare soluzioni nitrossidi all'interno di una cappa di aspirazione, mentre equipaggiato con il corretto dispositivo di protezione individuale (DPI).
  2. Preparazione del pH sensibile radicali trityl
    1. Pesare 0,7 mg di triaril radicale metile (ATAM 4) 26 radicale (1.400 g / mol) e sciogliere in 200 ml di etanolo assoluto.
    2. Pesare 0,00,681 mila g di KH 2 PO 4 (136,1 g / mol) e sciogliere in 50 ml di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 1 mM.
    3. Pesare 2,8 g di KOH (56 g / mol) e sciogliere in 50 ml di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 1 M.
    4. Aggiungere KOH goccia saggio tampone fosfato (2.2.2) per regolare il pH di 7,0.
    5. Aggiungere 800 ml di tampone fosfato 1 mm e 200 ml di Atam 4 in etanolo assoluto per un conc finaleentration di 0,5 mM in 80:20 buffer: etanolo.
    6. Ripetere i punti 2.2.1-2.2.5 per creare il campione 4 ATAM a pH = 7,2.
    7. Posizionare il ATAM 4, pH = 7.0 e ATAM 4, pH = 7,2 in provette dei campioni di quarzo separati da 6 mm.
    8. Posizionare entrambi i tubi di quarzo EPR 6 mm in un tubo di quarzo EPR 16 mm, con da 2 mm distanziale spessore di polistirolo in mezzo.
      Nota: Le pareti del tubo campione di quarzo sono spessi 0,5 mm, e in aggiunta ai 2 mm distanziale produrre una separazione 3 mm campioni ATAM. I radicali trityl sensibili pH utilizzati sono stati sintetizzati presso l'Ohio State University 26. L'esempio che è stato utilizzato per l'imaging si chiama ATAM 4. La reazione che rappresenta la sensibilità pH è mostrato nella Figura 1A.
  3. Generazione di BMPO-OH
    1. Pesare 680 mg di KH 2 PO 4 e si sciolgono in 100 ml di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 50 mM.
    2. Aggiungere 1 M KOH cadere saggioil tampone fosfato a pH = 7,3.
    3. Pesare 50 mg di BMPO (199,25 g / mol).
    4. Combinare il 50 mg di BMPO con 5 ml di tampone fosfato in un tubo di quarzo irradiazione 16 mm.
    5. Aggiungere 100 ml di acqua ossigenata a 300 mM.
    6. Irradiare la miscela nel tubo di quarzo di irradiazione da 16 mm con una pressione di 450 W lampada media UV per 5 min.
    7. Usando una pipetta di vetro, trasferire 2,5 ml di soluzione irradiato BMPO-OH fuori del tubo di quarzo irraggiamento e in un lato di un tubo campione di quarzo da 16 mm con 3 millimetri divisore.
    8. Trasferire il restante 2,5 ml di irradiato BMPO-OH nell'altro lato della provetta di quarzo da 16 mm con 3 millimetri divisore.
  4. Preparazione di dinitroxide radicale
    1. Pesare 24,7 mg di 2 H, dinitroxide 15 N-disolfuro (Figura 1C) in 1 ml di DMSO per una soluzione stock di 47,5 mm.
    2. Preparare 10 mM tampone Tris e regolare a pH 7,2.
    3. prendere 40ul dinitroxide soluzione madre e diluire con tampone Tris ad una concentrazione finale di 1 mm.
    4. Mettere 250 ml di soluzione dinitroxide in tampone in una provetta di quarzo da 16 mm con un divisore di 10 mm al centro.
    5. Pesare 154 mg di glutatione e aggiungere a 5 ml di tampone Tris per una concentrazione finale di 100 mM.
    6. Aggiungere 5 ml di soluzione 100 mM glutatione per 250 ml di soluzione 1 mM dinitroxide su un lato del divisore 10 mm convertire il diradicale in monoradical.
  5. Preparazione di nitronyl nitrossido
    1. Rimuovere il radicale dal congelatore e consentire il contenitore di venire a temperatura ambiente (10-15 min).
    2. Pesare 1,9 mg di nitronyl (390 g / mol).
    3. Pesare 0,56 mg di KOH e si sciolgono in 10 ml di acqua DI per una concentrazione finale di 1 mM.
    4. Mescolare il 1,9 mg di nitronyl in 10 ml di soluzione 1 mM KOH per una concentrazione finale di 0,5 mM nitronyl.
      Nota: Se necessary, utilizzare un vortex o sonicatore alla velocità solvatazione del nitronyl.

3. Installazione dello strumento rapido di scansione a 250 MHz

Nota: sintonizzazione del risonatore con un campione acquoso del nitrossido radicale, che ha un effetto simile a risuonatore Q e messa in soluzione tampone, è un buon modo per impostare per il campione per essere ripreso

  1. Tune il risonatore con un campione acquoso di nitrossido radicale.
    1. Inserire i 15 ml di 0,5 mm 15 N-PDT in campione di acqua in un tubo di quarzo EPR 16 mm.
    2. Inserire il tubo di quarzo nel lato rilevamento della croce-loop RS-EPR risonatore.
    3. Cambiare la frequenza della sorgente strumento finché non corrisponde alla frequenza del lato rilevamento che contiene il campione. modificare manualmente la frequenza portante della sorgente 250 MHz inserendo il valore desiderato nel software.
    4. Cambiare la frequenza del lato di eccitazione per abbinare i frequencie della sorgente dell'esperimento e lato rilevamento del risonatore. Cambiare la frequenza del lato di eccitazione ruotando un condensatore variabile all'interno della cavità del risonatore secondo il protocollo del produttore.
  2. Impostare Strumento Console e principale Magnete
    1. Accendere lo spettrometro e scegliere un esperimento che registra i dati temporanei nel tempo in ascissa.
    2. All'interno del software, impostare il numero di punti da 65.536 e la base tempo di 10 nsec.
    3. Impostare il numero di calze a 10.000 per un segnale forte o stretto, e 45.000 per un segnale larga o debole.
    4. Premere il tasto "impegnarsi" nel software per inviare i parametri sperimentali dal software alla console ed energizzare il magnete principale campo.
    5. Impostare il campo magnetico principale a 9 mT.
    6. Impostare la manopola di potere attenuazione a 50 dB, e accendere l'amplificatore ad alta potenza 7 W.

4. EsecuzioneEsperimento di Rapid Scan

Nota: le istruzioni specifiche relative all'analisi dei fantasmi contenenti BMPO-OH 24, pH sensibili radicali TAM 19,27 e dinitroxides sensibili redox 28 sono previste in letteratura.

  1. La saturazione di alimentazione di campione nitrossido di serie
    Nota: È vantaggioso fare una curva di saturazione di potenza su un nitrossido campione radicale norma nelle medesime condizioni sperimentali che saranno utilizzati per guardare radicali sensibili al pH o stato redox.
    1. Accendere il driver rapida serpentina di scansione, con i valori dalla sezione 1 (frequenza di scansione di 6,8 kHz e larghezza di scansione di 7 mt).
    2. A partire da 50 dB, raccogliere uno spettro di scansione rapida con 100k medie. Diminuire l'attenuazione di 3 dB e ripetere la misurazione. Continuare fino un'impostazione attenuatore di 0 dB, o finché la misura di isolamento sul display a ponte è <0.
    3. Trasferimento tegli prime dati di scansione rapida in un programma di deconvoluzione (ad esempio scritto in Matlab) ed elaborare i dati grezzi in spettro di assorbimento.
    4. Inserire la frequenza di scansione, la larghezza spazzata, il numero di punti e base dei tempi nel programma, ed eseguire il programma per elaborare il segnale di scansione rapida grezzo in un segnale di assorbimento.
    5. Tracciare l'ampiezza del segnale di assorbimento in funzione della potenza radice quadrata (in Watt) incidente sul risonatore. Nel regime di non saturare, l'ampiezza è linearmente dipendente dalla radice quadrata della potenza incidente.
    6. Montare una linea di tendenza a partire da 0,0 e includere tutti i punti di dati che rientrano nella regione risposta lineare. Nella regione risposta lineare, segnale di ampiezza aumenta proporzionale alla radice quadrata della potenza a microonde.
    7. Estrapolare questa tendenza a potenze superiori, e confrontare l'intensità del segnale EPR. Utilizzare la potenza massima per la quale l'ampiezza del segnale non si discosti più del 3% dalla linea di tendenza estrapolata. in order per la deconvoluzione del segnale di scansione rapida funzioni correttamente, il segnale deve essere ancora nella regione risposta lineare rispetto alla potenza incidente.
      Nota: Il trasferimento dei dati di scansione rapide grezzi può essere fatto tramite una connessione di rete o tramite pen drive. In questo caso il trasferimento è necessario perché il programma per elaborare dati grezzi (Matlab) non è sullo stesso computer che ha software di raccolta dati. L'algoritmo di deconvoluzione che elabora dati grezzi è descritto nel 29.

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Risultati

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Il prodotto dell'esperimento è una serie di sporgenze che vengono ricostruiti in immagini bidimensionali (uno spettrale, uno spaziale) con una scala di falsi colori per rappresentare l'ampiezza del segnale. blu profondo denota linea di base in cui è presente alcun segnale, il verde è bassa ampiezza e il rosso è più alto. Fette lungo l'asse x (dimensione spettrale) raffigurano il segnale EPR (EPR transizione) su un asse del campo magnetico. Lungo l'asse y (dimensione spaziale), la separaz...

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Discussione

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segnali Rapid-scansione hanno componenti di frequenza superiore rispetto CW, e richiedono una larghezza di banda più ampia risuonatore seconda linewidths, tempi di rilassamento, e la velocità dei rapidi-scan. La larghezza di banda richiesta per un dato esperimento si basa sulla larghezza di riga e la frequenza di scansione del campo magnetico (Equazione 2). A seconda dei tempi di rilassamento della sonda in studio (T 2 e T 2 *), e la velocità di scansione, oscillazioni possono apparire sul bordo di...

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Dichiarazioni

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Supporto parziale di questo lavoro da NIH concede NIBIB EB002807 e CA177744 (GRE e SSE) e P41 EB002034 di GRE, Howard J. Halpern, PI, e dall'Università di Denver è riconosciuto con gratitudine. Mark Tseytlin è stato sostenuto da NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Gli autori sono grati a Valery Khramtsov, ora presso la University of West Virginia, e Illirian Dhimitruka presso l'Ohio State University per la sintesi delle sensibili radicali TAM pH, e Gerald Rosen e Giuseppe Kao presso l'Università del Maryland per la sintesi del mHCTPO , proxyl, BMPO e radicali nitronyl.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-osso-2,2,6,6-tetra(2H3)metil-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT)Isotopi CDN M-232798% atomo 15N, 98% atomo D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoil-2,2,5,5-tetra(2H3)metil-3-pirrolinililossil (15N-mHCTPO)N/AN/ASintetizzato presso U. Maryland e descritto nel riferimento 29
3-carbossi-2,2,5,5-tetra(2H3)metil-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pirrolidinyloxyl (15N-Proxyl)N/AN/ASintetizzato presso U. Maryland e descritto in Reference 25
4 mm Quartz EPR TubesWilmad Glass707- SQ-100M
4-osso-2,2,6,6-tetra(2H3)metil-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinilossil (14N-PDT)CDN IsotopiD-232898% atomo D, Quebec Canada
Radicale tritile sensibile al pH (aTAM4)Ohio State UniversityN/Asintetizzato presso lo Stato dell'Ohio Università e descritto nel riferimento 26
Potassum Phosphate, MonobasicJ.T. Baker Chemicals1-3246
6 mm Quarzo EPR TubiWilmad GlassQ-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quarzo EPR TubesWilmad GlassQ-7M-8M-0-250/RB
5-terz-butossicarbonil-5-metil-1-pirrolina-N-ossido (BMPO)N/AN/ASintetizzato presso l'U. Maryland e descritto nel riferimento 30
Perossido di idrogenoSigma AldrichH1009 SIGMA30%
16 mm Tubo EPR al quarzoWilmad Glass16-7PP-11QTZ
Media pressione 450 W Lampada UVHanovia679-A36Fairfield, NJ
L-Glutatione, ridottoSigma AldrichG470-5
NitronylNAN / ASintetizzato presso l'U. Maryland e descritto nel riferimento 31
Idrossido di sodio J.T. Baker Prodotti chimici1-3146

Riferimenti

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