Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Sommario

Viene presentato un protocollo che stabilisce cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal liquido sinoviale e dal midollo osseo di maialini e raccolte in modo non invasivo mediante aspirazione a siringa. La fenotipizzazione cellulare è stata eseguita utilizzando la citometria a flusso dopo l'isolamento cellulare e la coltura in vitro di midollo osseo e liquidi sinoviali derivati da MSC.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state stabilite dopo l'isolamento da varie fonti di tessuto, tra cui il midollo osseo e il liquido sinoviale. Recentemente, è stato riportato che le MSC derivate dal liquido sinoviale hanno un potenziale di differenziazione multi-lineage e caratteristiche immunomodulatorie, il che indica che queste cellule possono essere utilizzate per l'ingegneria tissutale e i trattamenti sistemici. Questo studio presenta un protocollo per l'isolamento semplice e non invasivo di MSC derivate dal midollo osseo e dal liquido sinoviale di maialini per analizzare i marcatori della superficie cellulare per la fenotipizzazione cellulare e la coltura in vitro. Utilizzando maialini di sei mesi sessualmente maturi, il midollo osseo è stato estratto dall'osso della cresta iliaca utilizzando un estrattore di midollo osseo e il liquido sinoviale è stato aspirato dall'articolazione femorotibiale. Le procedure per la raccolta di campioni da entrambe le fonti non erano invasive. Vengono forniti i protocolli per l'isolamento efficace delle MSC da fonti cellulari raccolte e per la creazione di condizioni di coltura in vitro per espandere le MSC stabili dai minipig e l'applicazione di trattamenti autologhi sistemici. Per la fenotipizzazione cellulare, i marcatori della superficie cellulare di entrambe le cellule sono stati analizzati utilizzando la citometria a flusso. Nei risultati, le MSC sono state isolate dal liquido sinoviale dei maialini e hanno dimostrato che le MSC derivate dal liquido sinoviale hanno una morfologia e un fenotipo cellulare simili alle MSC derivate dal midollo osseo. Pertanto, il liquido sinoviale ottenuto in modo non invasivo è una preziosa fonte di MSC.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali multipotenti (MSC) possono essere classificate in linee cellulari mesenchimali e le MSC sono state stabilite e isolate da varie fonti di tessuti, come il midollo osseo, i cordoni ombelicali, la placenta, il tessuto adiposo, la pelle dermica, il muscolo scheletrico, i follicoli piliferi, le membrane sinoviali e i denti^1-5. Attualmente, l'attenzione è stata rivolta alle MSC di derivazione sinoviale perché queste cellule possono aiutare a trattare le malattie articolari, come la frazione ossea, l'osteoartrite e l'artrite reumatoide (RA) e, grazie al potenziale rigenerativo delle MSC nella cartilagine o nell'osso danneggiati, p....

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati autorizzati dal Centro animali per Biomedica sperimentazione a Gyeongsang National University.

1. I preparativi per la Procedura di animali

1. Preparare l'adulto cavie di sesso femminile per la raccolta non invasiva delle cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo e nel liquido sinoviale. Eseguire l'esame clinico delle cavie un giorno prima anestesia e la raccolta del campione.
   1. Fornire animali clinicamente normali per gli esami fisici, che comprendono la temperatura corporea, frequenza respiratoria, e la frequenza cardiaca, e per l'osservazione del comportamento e....

Risultati

Istituzione di MSC derivate dal midollo osseo e nel liquido sinoviale di mini-pig

MSC sono state isolate con successo dal midollo osseo e delle articolazioni sinoviali articolari delle cavie ed espanse in vitro (Figura 2). Siringa aspirazione del liquido sinoviale è semplice, ed è possibile avere cellule aderenti sufficienti durante la coltivazione in vitro delle cellule prim.......

Discussione

Maialino sono stati usati per stabilire l'isolamento MSC da midollo osseo e nel liquido sinoviale. Per eliminare varie condizioni fisiologiche, quali l'età, il sesso, e la malattia, maialino da sfondo isogenici donatori sono stati scelti per valutare con precisione la caratterizzazione dipendente fonte delle cellule. I maiali sono noti per essere anatomicamente, fisiologicamente, geneticamente simili agli esseri umani, e in particolare, maialino in grado di produrre organi dimensioni abbinati; Pertanto, essi pos.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco' avanzato s modificato Eagle medium (ADMEM)	Gibco	12491-023	MSC terreno di coltura
Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)	Gibco	14190-144	Terreno di lavaggio cellulare, privo di Ca2+/Mg2+
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	16000-044	Componente del terreno MSC
Glutamax	Gibco	35050-061	Componente del medio MSC
Penicillina/streptomicina	Gibco	10378-016	Componente del terreno MSC
Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF)	Simga	F0291	Componente delle MSC medio
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A6003	Componente delle MSC medie
Tripsina-EDTA	Gibco	25200-072	Reagente di dissociazione cellulare
β-mercaptoetanolo	Sigma	M7522	Componente delle MSC medio
Anticorpo isotipo	BD Pharmingen	550616 Controllo dell'isotipo
Anticorpo CD29	BD Pharmingen	BD 552369	Integrina beta-1 Marker MSC
Anticorpo CD44	BD Pharmingen	BD 553133	Glicoproteina della superficie cellulare Marker MSC
Anticorpo CD45	Pharmingen	BD 340664	Marcatore delle cellule staminali ematopoietiche
Anticorpo CD34	BD Pharmingen	BD 555821	Marcatore delle cellule staminali ematopoietiche
Anticorpo CD90	BD Pharmingen	BD 555595	Glicoproteina di membrana Thy-1 Marker MSC
Anticorpo MHC Classe II	Santa Cruz	SC-32247	Marcatore delle cellule presentanti l'antigene
Anticorpo Vimentina	Sigma	Sigma-S6389	Filamento intermedio di tipo III Marcatore MSC
Fosfatasi alcalina	Promega	S3841	Miscela di 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e nitro blu tetrazolio (NBT)
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Centrifugazione a gradiente di densità
Filtro cellulare	BD Falcon	352340	40 &; m Filtro cellulare in nylon
Tubo conico in polistirene da 15 ml	BD Falcon	351095	Raccolta dei campioni e isolamento cellulare
Piastre da 35 mm	Nunc	153066	Piatto per coltura cellulare
Estrattore di midollo osseo	GmbH Medizintechnologie, Germania	1145-1W010	TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Camera per ematocrito	Marinfeld	640130	Camera
Atropina	Jeil Pharmaceutical Co, Corea		Atropina solfato Idrato
Acepromazina	Samu Median, Corea		Farmaco sedativo e antiemetico pre-anestetico
Medetomidina	Pfizer		Farmaco anestetico e analgesico
Enrofloxacina	Bayer Healthcare, Germania		Anti-biotici
Meloxicam	Over Veterinary Medicine, Argentina		Farmaco antinfiammatorio e analgesico
Isoflurano	Hana pharm, Corea		Anestesia inalatoria
Povidone iodio	Corea Pharma, Corea		Agente di sterilizzazione
Etanolo	Sigma	E7023	Agente di sterilizzazione
Eparina	Sigma	H3393	Agente anticoagulante
Formaldeide	Sigma	F8775	Agente di fissazione cellulare
Unguento oftalmologico	Pfizer		Ossitetraciclina HCl con polimixina B solfato
Coperta d'acqua circolante	Gaymar Industries		Sistema di riscaldamento durante e dopo l'anestesia
Suturatrice	Covidien, USA		Sutura Chiusura cutanea
CO2 Incubatore	Thermo Forma	3111	Attrezzatura per colture cellulari
Citometro a flusso	BD Biosciences		Analizzatore cellulare
Minipig	PWG Genetics Korea, Ltd.	Maiale in miniatura	di tipo T

BD BD per conteggio cellulare del Sud del Sud del Sud del Sud