È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Modellazione Distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti C2C12

15.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54078

⸱

29 luglio 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo protocollo, vi presentiamo le procedure nella creazione di modelli miotonici mioblasti distrofia 1, tra cui ottimizzato manutenzione C2C12 cellule, geni trasfezione / trasduzione, e la differenziazione dei miociti.

Abstract

La distrofia miotonica 1 (DM1) è una comune forma di distrofia muscolare. Anche se diversi modelli animali sono stati stabiliti per DM1, modelli cellulari mioblasti sono ancora importanti perché offrono una valida alternativa cellulare per studiare gli eventi cellulari e molecolari. Anche se le cellule mioblasti C2C12 sono stati ampiamente utilizzati per studiare miogenesi, resistenza alla trasfezione del gene, o trasduzione virale, ostacola la ricerca nelle cellule C2C12. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato che include le procedure di manutenzione quotidiana, trasfezione e trasduzione per introdurre geni in mioblasti C2C12 e l'induzione della differenziazione dei miociti. Collettivamente, queste procedure consentono migliori efficienze di trasfezione / trasduzione, come pure risultati differenziazione coerenti. Il protocollo descritto nello stabilire modelli cellulari mioblasti DM1 beneficerebbero lo studio della distrofia miotonica, nonché altre malattie muscolari.

Introduzione

La distrofia miotonica (DM) è una malattia autosomica dominante che colpisce di più sistemi, i muscoli più considerevolmente cardiaco e scheletrico 1. Ci sono due sottotipi di questa malattia, DM1 e DM2. DM1 è più comune e ha una manifestazione più grave di DM2 2. La mutazione genetica sottostante DM1 è una espansione della tripletta ripetizioni CUG situato nella regione 3 'non tradotta (UTR) del DM gene della proteina chinasi (DMPK) 3. Il numero CUG repeat in individui sani varia da 5 a 37. Al contrario, aumenta di più di 50, e, a volte fino a migliaia di pazienti DM1 4. Di conseguenza, RNA-binding proteins, come muscleblind-simile 1 (MBNL1), CUGBP, e Elav-come la famiglia 1 (Celf1), sono misregulated. A causa del sequestro sulle ripetizioni CUG espanse, MBNL1 perde la sua capacità di regolare splicing alternativo 5. Celf1, invece, viene up-regolata 6,7. Sovraespressione di Celf1 è associata a perdita di massa muscolaree la debolezza, che non sono attribuiti alla perdita di funzione MBNL1. Modelli animali che simulano le alterazioni DM1, comprese l'DMPK 3'-UTR espansione CUG, perdita di MBNL1, e sovraespressione di Celf1, sono state stabilite. Tuttavia, la modellazione DM1 nei mioblasti offre una valida alternativa, soprattutto per sezionare gli eventi cellulari e molecolari DM1-correlati.

Linea di cellule mioblasti C2C12 è stato isolato dal muscolo C3H topo feriti e ampiamente usato per studiare miogenico 8,9 differenziazione. C2C12 rapidamente proliferano in siero fetale bovino (FBS) -contenenti media e facilmente subiscono differenziazione quando FBS è esaurito. Tuttavia, utilizzando questo modello di differenziazione dei mioblasti presenta due sfide: C2C12 sono spesso resistenti al gene trasfezione / trasduzione virale; e lievi variazioni nella gestione delle cellule e differenziazione procedura può portare a notevoli cambiamenti in formazione myotube.

Il nostro laboratorio utilizza abitualmente mioblasti C2C12 come ACmodello ell e ha sviluppato protocolli in grado di fornire in modo efficace i geni di plasmide trasfezione, trasduzione retrovirale, e lentivirale trasduzione nella linea cellulare C2C12 10. Nel video, dimostriamo le procedure ottimizzate per transfecting / trasduzione C2C12 cellule e mantenere la coerenza di differenziazione nella creazione di modelli di mioblasti DM1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. C2C12 coltura cellulare

  1. Mantenere C2C12 mioblasti di topo in un piatto di 100 mm di mezzo di crescita (media di Dulbecco modificato Eagle (DMEM)) integrato con il 20% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, e 2 mm L-glutammina. Consentono alle cellule C2C12 diversi passaggi a diventare circa il 50 - 60% confluenti.
  2. Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con soluzione fisiologica 3 ml di temperatura ambiente tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule. Posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore 3 - 5 min.
  3. Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura. Pipettare 6 - 8 volte per sospendere le cellule. Aggiungere 1 ml di cellule sospese in un piatto di 100 mm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2.

2. C2C12 cellule Trasfezione / trasduzione e Selezione

  1. C2C12 plasmide trasfezione
    1. 24 ore prima della trasfezione, pritardate 7,0 x 10 5 cellule C2C12 in un pozzetto di una piastra sei pozzetti per ogni trasfezione.
      Nota: Questo porta a 50 - 60% di confluenza al momento della transfezione.
    2. Lasciare che il reagente di trasfezione raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
    3. Aggiungere 2 mg di DNA plasmide (GFP-CUG5 o GFP-CUG200) in 200 ml di pre-riscaldato mezzo privo di siero e vortex brevemente. Aggiungere 6 ml di reagente di trasfezione al mezzo e miscelare immediatamente per 30 secondi usando un vortice. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente.
    4. Cambiare il supporto di cellule C2C12 a 2,5 ml terreni di coltura privo di siero. Aggiungere la miscela di trasfezione di cellule dopo incubazione. Riportare le piastre per un 5% di CO 2, 37 ° C incubatore.
    5. Mantenere le cellule in miscela di trasfezione / terreni di crescita senza siero per 4 ore o fino a notte. Cambiare i media indietro ai media di crescita il giorno successivo o quando citotossicità è evidente.
      Nota: La citotossicità è valutata mediante ispezione microscopica del ceLLS. Osservare i cambiamenti nella morfologia cellulare e il distacco delle cellule. Fino a quando non vi è alcuna citotossicità palese, l'incubazione durante la notte in terreni di crescita privo di siero migliora trasfezione.
    6. Selezionare le celle 48 ore dopo la trasfezione con l'aggiunta di 1,2-1,6 mg / ml G418 per ~ 10 giorni fino a quando la cultura del controllo (transfettate senza i plasmidi) non ha cellule vive. Modificare i media ogni due giorni con mezzi di crescita integrato con G418.
    7. Mantenere le cellule resistenti G418 in mezzo di crescita e 5% di CO 2 a 37 ° C per esperimenti successivi.
  2. preparazione Retrovirus e C2C12 retrovirale trasduzione
    1. Preparare HEK 293 terreno di coltura DMEM completandolo glucosio con il 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina.
      1. Circa 24 ore prima della trasfezione, piatto 4,0 x 10 cellule di packaging HEK 293 basati su 6 ecotropic in un 100 mm Piastra (80% di confluenza a trasfezione) cmezzo di coltura cellulare ontaining.
    2. Lasciare che il reagente di trasfezione raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
    3. Mescolare 15 mcg plasmide DNA (pMSCV-Puro o pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml di terreno di coltura privo di siero. brevemente Vortex. Aggiungere 30 ml di reagente di trasfezione dal punto 2.2.2 in / tubo di terreno di coltura privo di siero del DNA, e mescolare bene con vortex. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Aggiungere trasfezione miscela goccia a goccia per le cellule di confezionamento ecotropic HEK 293-based. Mescolare delicatamente i piatti e li tornare al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. Dopo 24 ore, cambiare i mezzi di comunicazione per mezzo di crescita fresco 10 ml di pre-riscaldato.
    5. Raccogliere il surnatante (contenente retrovirus) 48 ore dopo la trasfezione con una pipetta e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml di nuovi media caldi alla piastra e restituirlo al incubatrice. Mantenere il surnatante a 4 ° C.
      Nota: Il supporto viene aggiunto delicatamente per tegli lato del pozzo in modo da non disturbare il monostrato cellulare.
    6. Raccolto il secondo lotto di surnatante 60 ore dopo la trasfezione e piscina con il surnatante da 2.2.5. Centrifugare a 500 xg, a 4 ° C per 7 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
    7. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Utilizzare retrovirus di trasdurre cellule C2C12 a questo punto procedendo al punto 2.2.9 o aliquotare e conservare il surnatante a -20 ° C per un uso futuro.
    8. Scongelare il retrovirus da 2.2.7 a temperatura ambiente, se un titolo congelato è qui utilizzato.
      Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
    9. Piastra cellule C2C12 lo stesso giorno di trasduzione puntando 30 - 40% di confluenza.
      1. Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con temperatura ambiente 3 ml di PBS. Rimuovere la PBS, aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA e incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore 3 - 5 min.
      2. Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di 3 ml med crescitaIUM. Pipettare 6 - 8 volte per sospendere le cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e aggiungere 8,0 x 10 5 cellule C2C12 ad una piastra 60 mm.
    10. Aggiungere 0,5 ml retrovirus di infettare un piatto 60 mm di cellule in 3 ml di mezzi di crescita. Riportare la piastra per l'incubatore.
    11. Sostituire con 3 supporti ml freschi integrato con selezione antibiotica (puromicina 1 - 3 mg / ml) 48 ore dopo l'infezione. Sostituire 3 ml di mezzo con antibiotici ogni giorno per ~ 5 giorni fino a quando la cultura del controllo C2C12 non trasdotte spegne.
  3. preparazione lentivirus e C2C12 lentiviral trasduzione
    Nota: eseguire tutte le procedure lentivirus legati a livello di biosicurezza 2 mobile e seguire le linee guida di sicurezza biologica. I rifiuti liquidi contenenti il ​​virus devono essere disinfettati prima dello smaltimento.
    1. Piatto 4,0 x 10 6 cellule 293T in un piatto 100 mm (~ 80% di confluenza al giorno di trasfezione) con HEK 293 terreno di coltura cellulare (DMEM alti livelli di glucosio, integrato con il 10% del fetosiero bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina) 24 ore prima della transfezione.
    2. Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Mescolare i vettori lentivirali di confezionamento (4 mg pMD2.G e 6 mcg psPAX2) insieme con 8 mg di trasferimento vettori lentivirali (Celf1 shRNA o strapazzate controllo shRNA) in 1 ml di siero mezzo di coltura cellulare gratuito. brevemente Vortex.
    3. Aggiungere 36 ml di pre-riscaldato reagente di trasfezione al tubo DNA / DMEM e mescolare bene dal vortice. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Rimuovere le cellule 293T dal termostato e aggiungere la miscela di trasfezione alla piastra. Agitare delicatamente la piastra e tornare di nuovo al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. Dopo 24 ore, sostituire la miscela di trasfezione con 10 ml di terreno di coltura fresco.
    5. Raccogliere il surnatante contenente lentivirus 48 ore dopo la trasfezione e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml nuovi media caldi alla piastra e restituirloper incubatrice. Conservare il surnatante a 4 ° C.
    6. Raccogliere il secondo lotto di surnatante 60 ore dopo la trasfezione e combinarlo con il surnatante da 2.3.5. brevemente Centrifugare a 500 xg, a 4 ° C per 7 minuti.
    7. Trasferire il surnatante in un tubo da 50 ml centrifuga fresca. Se si utilizza il virus fresco, procedere al punto 2.3.9. Per l'uso futuro, negozio di virus contenenti surnatante a -20 ° C in aliquote di 10 ml.
    8. Scongelare il virus da 2.3.7 a temperatura ambiente prima dell'uso, se si utilizza un magazzino congelato.
      Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
    9. cellule piastra C2C12-CUG200 (ottenuti nella sezione 2.1), come descritto nella 2.2.9 lo stesso giorno di trasduzione.
      Nota: Obiettivo per 30 - 40% di confluenza.
    10. Aggiungere 0,5 ml di virus di infettare una piastra 60 mm C2C12-CUG200 e riportare la piastra per l'incubatore.
    11. Sostituire il terreno di coltura con mezzi freschi integrati con l'antibiotico selezione (puromicina 1 - 3 mg / ml) 72 ore dopo la trasduzione.Aggiornare mezzi di coltura di tutti i giorni con l'antibiotico selezione di ~ 5 giorni fino a quando tutta la cultura di controllo C2C12-CUG200 non trasdotte spegne.
    12. Utilizzare Western Blot per verificare atterramento Celf1 in cellule trasfettate GFP-CUG200.

3. C2C12 cellule Differenziazione

  1. Piastra 2 x 10 6 cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2,5 ml terreni di crescita 24 h prima apertura di differenziazione.
    Nota: la densità di placcatura può essere regolata in modo che la piena confluenza viene raggiunto in 24 ore.
    1. Lavare le cellule confluenti con PBS e aggiungere 2,5 ml di terreno di differenziamento basso siero (modificato mezzo di Eagle integrato con 2% di siero equino, 100 U / ml penicillina Dulbecco, 100 ug / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1 pM insulina) . Sostituire la media ogni due giorni.
      Nota: Mantenere magazzino insulina congelati e aggiungerlo ai media ad ogni cambio medio.
  2. Durante la differenziazione C2C12, raccogliere campioni per quanquantita- RT-PCR (vedi sezione 4) presso i seguenti punti di tempo: Day0, 1, 2, 4 e 6. Processo per la cultura immunocolorazione al giorno 6-8 (vedi sezione 5).

4. RNA Isolamento e RT-PCR quantitativa

  1. Utilizzare il protocollo del produttore per l'isolamento di RNA. Dopo l'isolamento, risospendere il pellet di RNA in 30 acqua priva di RNasi ml e pipettare su e giù parecchie volte.
    Nota: I campioni possono procedere alla RT-PCR quantitativa o possono essere conservati a -80 ° C.
  2. Utilizzare un kit RT qPCR per RT-PCR quantitativa 10 e seguire le istruzioni del produttore. Preparare la miscela di reazione in base alla tabella 1.
Componente Volume (ml) Concentrazione finale
tampone di reazione 2x 10 1x
Primer forward 0.5 200 nm
primer reverse 0.5 200 nm
Sonda 0.5 200 nm
Trascrittasi inversa e RNase Inhibitor 0.1 0,25 U / ml
Modello 1 100 ng RNA totale
acqua libera RNase 7.4 N / A
Mix totale 20

Tabella 1. RT-PCR Master Mix Preparazione

  1. Eseguire un 20 microlitri reazione RT-qPCR con profilo termico Tabella 2.
fase di trascrizione inversa 30 min, 48 ° C
polimero DNAAttivazione ase / trascrittasi inversa inattivazione 10 min, 95 ° C
40 cicli 15 sec, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabella profilo termico 2. RT-PCR quantitativa

5. immunocolorazione

  1. Fissare la coltura monostrato in 2.5 ml preparato fresco 4% paraformaldeide / PBS a temperatura ambiente per 10 min.
  2. Permeabilize i campioni in 2.5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
  3. Trasferire i campioni ad una camera umidificata. Bloccare i campioni in 2,5 ml di tampone di bloccaggio (tensioattivo non ionico 0,1% / PBS, 10% siero di capra normale) per 30 minuti a 37 ° C.
  4. Scartare tampone bloccante e applicare 800 microlitri anticorpo primario contro catena pesante della miosina diluito in tampone di bloccaggio (1: 100). Incubare in una camera umidificata notte a temperatura ambiente.
  5. Lavare la piastra 3 times (10 min ciascuna) con 2,5 ml di tampone di lavaggio (0,1% polisorbato 20 / PBS) il giorno 2.
  6. Rimuovere il tampone di lavaggio e applicare 800 microlitri anticorpo secondario (goat anti-topo IgG, 1: 500 diluito in PBS). Incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 1 ora.
  7. Lavare due volte (10 minuti ciascuno) con tampone di 2,5 ml di lavaggio.
  8. Incubare con 800 microlitri DAPI (1 ug / ml, diluito in acqua distillata deionizzata H 2 O) per 5 min.
  9. Lavare con 2,5 ml di tampone di lavaggio ancora per 10 min.
  10. Modificare il buffer di lavaggio a 2,5 ml di PBS e utilizzare un microscopio a fluorescenza per catturare le immagini.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

C2C12 sono state trasfettate con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Dopo la selezione farmaco-resistenza, sono stati stabiliti piscine stabili, che può essere visualizzato mediante espressione GFP (Figura 1A). Formazione myotube nei mioblasti differenziati è stato rilevato dal catena pesante della miosina immunocolorazione 10 (Figura 1B). La quantificazione di myotube formazione ha dimostrato che gli indici di fusione sono stati diminuiti da 35,4 ± 4,1% a...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Linea cellulare C2C12 è stata utilizzata come modello per lo studio miogenesi 11-14. Queste cellule mantengono uno sguardo fibroblasti-like, proliferano rapidamente in supporti contenenti il 20% di siero fetale bovino e prontamente si differenziano nel supporto contenente 2% di siero equino 15. La rapida crescita e la differenziazione sono caratteristiche vantaggiose in un modello cellulare miogenesi. Qui, dimostriamo l'uso di plasmide, retrovirale, e vettori lentivirali per introdurre cDNA, 3&...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i dottori Tom Cooper del Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan dell'Università del Wisconsin-Madison e Didier Trono dell'Università di Ginevra per i reagenti. Questo lavoro è supportato da un fondo per le startup dell'Università di Houston (YL), da una sovvenzione dell'American Heart Association (YL, 11SDG5260033) e dalla National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM, alto glucosioLife Technologies11965-084per terreno di coltura
Fetale Siero bovino - PremiumAtlanta BiologicalsS11150per terreno di coltura
Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x)Life Technologies10378-016per terreno di coltura
Insulina da pancreas bovinoSigma AldrichI6634-100MGper terreno di derivazione
siero equinoAtlanta BiologicalsS12150per mezzo di differenziazione
FuGENE  reagente di trasfezione HDPromegaE2311 per trasfezione
G418 solfato Biotecnologia dell'oro G-418-10per la selezione resistente ai farmaci
Puromicina dicloridratoSigma Aldrichsc-108071per la selezione resistente
ai farmaci NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzettiLife TechnologiesNP0323BOXper western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life TechnologiesNP00061per western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesNP0002per western blot
Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 mGE healthcare life science10600015per western blot
MF 20Banca di ibridomi dello sviluppoMF 20Ab primario per immunocolorazione
Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-topo, Texas Red-X coniugatoThermo Fisher ScientificT-862secondario Ab per immunocolorazione
One step qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xper qRT-PCR
Reagente di isolamento TriPureRocheper l'isolamento dell'RNA
Anticorpo CUG-BP1 (3B1)santa cruzsc-20003primario Ab western blot
Actina Anticorposanta cruzsc-1615capra policlonale IgG per il controllo del carico
293T EcopackClontech631507cellule per la preparazione del retrovirus
pMSCV-puroClontech634401vettore retrovirale vuoto per la preparazione del retrovirus
pMSCV-Celf1Flag-purohouse-constructednon disponibilevettore retrovirale codificante Celf1Flag, utilizzato nella preparazione del retrovirus
psPAX2regalo di Didier Trononon disponibileper la preparazione del lentivirus
pMD2.Gregalo di Didier Trononon disponibileper la preparazione di lentivirus
GFP-CUG5regalo di M.S. Mahadevannon disponibiledettagli in riferimento 10 
GFP- CUG200regalo da M.S. Mahadevannon disponibiledettagli nel riferimento 10 
Tritone X-100Sigma AldrichX100per l'immunocolorazione
della paraformaldeideSigma AldrichP6148per l'immunocolorazione
TWEEN  20Sigma AldrichP9416per immunocolorazione
DAPISigma AldrichD9542per immunocolorazione
11667165001

Riferimenti

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
  3. Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
  7. Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
  8. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  9. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  10. Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
  11. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
  12. Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
  13. Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
  14. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
  15. Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
  16. Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Mioblasti C2C12Trasfezione plasmidicaTrasduzione retroviraleTrasduzione lentiviraleDifferenziamento dei miocitiAnalisi Western BlotAnalisi fluorescenteUp regulation di Celf1Knockout genico
Modellazione Distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti C2C12
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.