In questo protocollo, vi presentiamo le procedure nella creazione di modelli miotonici mioblasti distrofia 1, tra cui ottimizzato manutenzione C2C12 cellule, geni trasfezione / trasduzione, e la differenziazione dei miociti.
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Articolo metodologico
Modellazione Distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti C2C12
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La distrofia miotonica 1 (DM1) è una comune forma di distrofia muscolare. Anche se diversi modelli animali sono stati stabiliti per DM1, modelli cellulari mioblasti sono ancora importanti perché offrono una valida alternativa cellulare per studiare gli eventi cellulari e molecolari. Anche se le cellule mioblasti C2C12 sono stati ampiamente utilizzati per studiare miogenesi, resistenza alla trasfezione del gene, o trasduzione virale, ostacola la ricerca nelle cellule C2C12. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato che include le procedure di manutenzione quotidiana, trasfezione e trasduzione per introdurre geni in mioblasti C2C12 e l'induzione della differenziazione dei miociti. Collettivamente, queste procedure consentono migliori efficienze di trasfezione / trasduzione, come pure risultati differenziazione coerenti. Il protocollo descritto nello stabilire modelli cellulari mioblasti DM1 beneficerebbero lo studio della distrofia miotonica, nonché altre malattie muscolari.
Introduzione
La distrofia miotonica (DM) è una malattia autosomica dominante che colpisce di più sistemi, i muscoli più considerevolmente cardiaco e scheletrico 1. Ci sono due sottotipi di questa malattia, DM1 e DM2. DM1 è più comune e ha una manifestazione più grave di DM2 2. La mutazione genetica sottostante DM1 è una espansione della tripletta ripetizioni CUG situato nella regione 3 'non tradotta (UTR) del DM gene della proteina chinasi (DMPK) 3. Il numero CUG repeat in individui sani varia da 5 a 37. Al contrario, aumenta di più di 50, e, a volte fino a migliaia di pazienti DM1 4. Di conseguenza, RNA-binding proteins, come muscl....
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Protocollo
1. C2C12 coltura cellulare
- Mantenere C2C12 mioblasti di topo in un piatto di 100 mm di mezzo di crescita (media di Dulbecco modificato Eagle (DMEM)) integrato con il 20% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, e 2 mm L-glutammina. Consentono alle cellule C2C12 diversi passaggi a diventare circa il 50 - 60% confluenti.
- Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con soluzione fisiologica 3 ml di temperatura ambiente tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule. Posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore....
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Risultati
C2C12 sono state trasfettate con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Dopo la selezione farmaco-resistenza, sono stati stabiliti piscine stabili, che può essere visualizzato mediante espressione GFP (Figura 1A). Formazione myotube nei mioblasti differenziati è stato rilevato dal catena pesante della miosina immunocolorazione 10 (Figura 1B). La quantificazione di myotube formazione ha dimostrato che gli indici di fusione sono stati diminuiti da 35,4 ± 4,1% a.......
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Discussione
Linea cellulare C2C12 è stata utilizzata come modello per lo studio miogenesi 11-14. Queste cellule mantengono uno sguardo fibroblasti-like, proliferano rapidamente in supporti contenenti il 20% di siero fetale bovino e prontamente si differenziano nel supporto contenente 2% di siero equino 15. La rapida crescita e la differenziazione sono caratteristiche vantaggiose in un modello cellulare miogenesi. Qui, dimostriamo l'uso di plasmide, retrovirale, e vettori lentivirali per introdurre cDNA, 3&.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i dottori Tom Cooper del Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan dell'Università del Wisconsin-Madison e Didier Trono dell'Università di Ginevra per i reagenti. Questo lavoro è supportato da un fondo per le startup dell'Università di Houston (YL), da una sovvenzione dell'American Heart Association (YL, 11SDG5260033) e dalla National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM, alto glucosio | Life Technologies | 11965-084 | per terreno di coltura |
| Fetale Siero bovino - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | per terreno di coltura |
| Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x) | Life Technologies | 10378-016 | per terreno di coltura |
| Insulina da pancreas bovino | Sigma Aldrich | I6634-100MG | per terreno di derivazione |
| siero equino | Atlanta Biologicals | S12150 | per mezzo di differenziazione |
| FuGENE reagente di trasfezione HD | Promega | E2311 | per trasfezione |
| G418 solfato | Biotecnologia dell'oro | G-418-10 | per la selezione resistente ai farmaci |
| Puromicina dicloridrato | Sigma Aldrich | sc-108071 | per la selezione resistente |
| ai farmaci NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzetti | Life Technologies | NP0323BOX | per western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | per western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | per western blot |
| Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | per western blot |
| MF 20 | Banca di ibridomi dello sviluppo | MF 20 | Ab primario per immunocolorazione |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-topo, Texas Red-X coniugato | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondario Ab per immunocolorazione |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | per qRT-PCR |
| Reagente di isolamento TriPure | Roche | per l'isolamento dell'RNA | |
| Anticorpo CUG-BP1 (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primario Ab western blot |
| Actina Anticorpo | santa cruz | sc-1615 | capra policlonale IgG per il controllo del carico |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cellule per la preparazione del retrovirus |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | vettore retrovirale vuoto per la preparazione del retrovirus |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | non disponibile | vettore retrovirale codificante Celf1Flag, utilizzato nella preparazione del retrovirus |
| psPAX2 | regalo di Didier Trono | non disponibile | per la preparazione del lentivirus |
| pMD2.G | regalo di Didier Trono | non disponibile | per la preparazione di lentivirus |
| GFP-CUG5 | regalo di M.S. Mahadevan | non disponibile | dettagli in riferimento 10 |
| GFP- CUG200 | regalo da M.S. Mahadevan | non disponibile | dettagli nel riferimento 10 |
| Tritone X-100 | Sigma Aldrich | X100 | per l'immunocolorazione |
| della paraformaldeide | Sigma Aldrich | P6148 | per l'immunocolorazione |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | per immunocolorazione |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | per immunocolorazione |
Riferimenti
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
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Ristampe e permessi
