Un approccio per migliorare l'allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Abstract

La rigenerazione degli assoni è un processo caotico dovuto in gran parte all'allineamento non organizzato degli assoni. Pertanto, affinché un numero sufficiente di assoni rigenerati possa colmare il sito della lesione, è necessario un allineamento assonale adeguatamente organizzato. Poiché la demielinizzazione dopo una lesione nervosa compromette fortemente la capacità conduttiva degli assoni sopravvissuti, la rimielinizzazione è fondamentale per il buon funzionamento dei nervi rigenerati. In precedenza, abbiamo dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) si allineano su una superficie anisotropa indotta da pre-stiramento perché le cellule possono percepire una maggiore rigidità effettiva nella direzione allungata rispetto alla direzione perpendicolare. Abbiamo anche dimostrato che una superficie anisotropa derivante da una superficie meccanica pre-stirata influenza in modo simile l'allineamento, così come la crescita e la mielinizzazione degli assoni. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una superficie anisotropa pre-stirata, l'isolamento e la coltura dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) su una superficie pre-stirata e mostriamo il comportamento di mielinizzazione di una co-coltura di neuroni DRG con cellule di Schwann (SC) su una superficie pre-stirata.

Introduzione

In lesioni nervose, i monconi prossimali e distali del nervo sono spesso impedito di riallineamento diretta di fascicoli nervosi a causa del sito della lesione ^1-2. Normalmente, tratti di assoni sono composti da fasci altamente ordinate e allineate di assoni, che formano reti complesse di connettività. Tuttavia, la rigenerazione dei nervi è un processo caotico a causa di allineamento degli assoni mal organizzato ^3-4. Pertanto, per generare un numero sufficiente di rigenerare assoni che colmano il sito della lesione, è necessario per indurre ben organizzato allineamento assonale. Inoltre, demielinizzazione accompagna lesioni nervose a causa di mo....

Protocollo

Tutte le procedure per l'isolamento delle cellule sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa presso la Michigan State University.

1. Preparazione di pre-allungato anisotropico Surface

1. Mescolare un 10: 1 soluzione di base e catalizzatore e versare il composto in un piatto di coltura di tessuti (12 cm di diametro). Utilizzare 4.900 mg base e 490 mg di catalizzatore per la miscela totale reticolazione.
2. Mantenere la miscela gel sotto vuoto per 20 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
3. Mettere il composto gel nel forno per polimerizzazione durante la notte a 60 ° C.
4. Dopo le cure membrana....

Risultati

Il sistema di coltura pre-stirato cellule promosso DRG allineamento assone ^10. neuroni DRG sono stati coltivati ​​su superfici pre-stirato e non deformato per 12 giorni. Gli assoni sono state colorate per β-III-tubulina per dimostrare la loro allineamento. La figura 2 confronta orientamento assone sulle PDMS pre-stirato e non deformato substrati dopo 12 giorni di coltura. Gli assoni DRG allineati parallelamente alla direzione allungata, che hanno mostrato alli.......

Discussione

Per indurre l'allineamento assone sulla superficie pre-stirato, ci sono due passaggi critici: 1) la membrana PDMS deve essere piana e di spessore omogeneo; e 2) cellule gliali devono essere rimossi dal DRG. Dopo la miscelazione il PDMS e reticolante e cottura in forno, il gel PDMS reticolato dovrebbe essere mantenuto su un banco piana e maneggiato con cura per evitare qualsiasi inclinazione. Il trattamento al plasma di ossigeno della membrana PDMS dovrebbe essere seguita entro 6 ore mediante rivestimento PLL, poiché.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Integratore 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillina-streptomicina	GibcoBRL	15140-122
0,05% Tripsina-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poli-L-Lisina	Trevigen	3438-100-01
Poli-D-Lisina	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deossi-uridina	Sigma	F0503
Uridina	Sigma	U3003
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Tampone di isolamento
Tipo I Collagenasi	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Siero fetale bovino inattivato termicamente	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetici	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Camera in silicone	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Sistema di pulizia/incisione al plasma	March Instruments	PX-250
Anticorpo Anti-Thy 1.1	Sigma- Aldrich	M7898
Complemento di coniglio	Sigma- Aldrich	S-7764
Terreno			di crescita standardPer 500 ml di Neurobasal Medium 1x, aggiungere 10 ml di B-27 50x, 5 ml di Glutamax-I 100x, 2,5 ml di Penicillina/Streptomicina (Penn/Streptomic), 1 ml di Albumax-I e 1 μ l di NGF-- 7S (50 μ g/ml).
FDU Soluzione madre			FDU 100 mg in 10 ml di ddH2O (10 mg/ml), filtrare nella cappa e diviso in 500 μ l. aliquote e conservare a -20 °C. Uridina 5 g in 166,7 ml di ddH2O (33 mg/ml), filtrare in cappa, dividere in 200 & l aliquote e conservare a -20 ºC. Prendi 61.5 μ l di FDU (10 mg/ml) e 20,5 μ l di uridina (33 mg/ml) e aggiungere 4,918 μ l di ddH2O fino alla concentrazione finale di madre, quindi dividere in aliquote da 1 ml e conservare a -20 ºC.

di uridina