Un approccio per migliorare l'allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Abstract

La rigenerazione degli assoni è un processo caotico dovuto in gran parte all'allineamento non organizzato degli assoni. Pertanto, affinché un numero sufficiente di assoni rigenerati possa colmare il sito della lesione, è necessario un allineamento assonale adeguatamente organizzato. Poiché la demielinizzazione dopo una lesione nervosa compromette fortemente la capacità conduttiva degli assoni sopravvissuti, la rimielinizzazione è fondamentale per il buon funzionamento dei nervi rigenerati. In precedenza, abbiamo dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) si allineano su una superficie anisotropa indotta da pre-stiramento perché le cellule possono percepire una maggiore rigidità effettiva nella direzione allungata rispetto alla direzione perpendicolare. Abbiamo anche dimostrato che una superficie anisotropa derivante da una superficie meccanica pre-stirata influenza in modo simile l'allineamento, così come la crescita e la mielinizzazione degli assoni. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una superficie anisotropa pre-stirata, l'isolamento e la coltura dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) su una superficie pre-stirata e mostriamo il comportamento di mielinizzazione di una co-coltura di neuroni DRG con cellule di Schwann (SC) su una superficie pre-stirata.

Introduzione

In lesioni nervose, i monconi prossimali e distali del nervo sono spesso impedito di riallineamento diretta di fascicoli nervosi a causa del sito della lesione ^1-2. Normalmente, tratti di assoni sono composti da fasci altamente ordinate e allineate di assoni, che formano reti complesse di connettività. Tuttavia, la rigenerazione dei nervi è un processo caotico a causa di allineamento degli assoni mal organizzato ^3-4. Pertanto, per generare un numero sufficiente di rigenerare assoni che colmano il sito della lesione, è necessario per indurre ben organizzato allineamento assonale. Inoltre, demielinizzazione accompagna lesioni nervose a causa di morte delle cellule mielinizzanti presso il luogo di ferita. Dal momento che demielinizzazione compromette fortemente la capacità conduttiva di sopravvivere assoni, i trattamenti di targeting demielinizzazione o che promuovono la rimielinizzazione sono significativi per il recupero funzionale dopo lesione del nervo ^5. Così l'obiettivo di questo protocollo è quello di illustrare un approccio ingegneristico che affronta questi due problemidi rigenerazione nervosa.

Anisotropia di superficie, che è definito come la differenza, quando misurata lungo assi diversi, in proprietà fisiche e meccaniche di un materiale, è stato applicato per influenzare l'allineamento cellulare, la crescita e la migrazione ^6-7. Oltre alla topografia, ci sono altri metodi per indurre anisotropia. In precedenza, abbiamo studiato anisotropia superficie indotta dalla meccanica statica pre-tratto di poli-dimetil-silossano (PDMS) membrana. La teoria del "piccolo super-deformazione imposta su grandi", prevede che la rigidezza efficace le cellule percepiscono nella direzione allungata differisce dalla direzione perpendicolare, e questa differenza di rigidità efficace è dovuto alla superficie anisotropia ^8. Cellule staminali mesenchimali (MSC) coltivate su una membrana pre-stirato PDMS sono in grado di percepire l'anisotropia tirando attivamente la superficie e, di conseguenza, allineare in direzione prestirato ^9. Analogamente, una superficie ar anisotropoising da una superficie pre-stirato meccanico colpisce l'allineamento, così come la crescita e la mielinizzazione dei gangli delle radici dorsali (DRG) assoni ^10. Qui forniamo un protocollo per indurre anisotropia di superficie su un substrato di PDMS pre-stirato statico per migliorare la rigenerazione degli assoni ^10.

Per suscitare l'allineamento degli assoni, le caratteristiche topologiche con i modelli desiderati, segnalato per fornire una guida contatto attraverso fibre allineate e canali ^6,11-12, sono stati dimostrato di facilitare l'allineamento degli assoni ^11,13. Tuttavia, le tecniche per indurre l'allineamento assone attraverso le caratteristiche topologiche, come fibre, canali e patterning riportato, erano in grado di allungarsi e aumentare lo spessore degli assoni. Al contrario, graduale stiramento meccanico portato all'allineamento assone nella direzione di stiro con assoni più lunghi e più spessi che aumentano con la grandezza del tratto ^14. Tuttavia, incorporante un dispositivo motore alimentato in vivo non èfattibile. Al contrario, statica anisotropia indotta prestirato è meno complicato e può essere più facilmente incorporato in futuri disegni ponteggi per applicazioni in vivo.

In questo protocollo, un sistema di coltura cellulare prestirato statico viene utilizzato per indurre anisotropia superficie senza caratteristiche topologiche. Il sistema di coltura prestirato è composto da una membrana PDMS, un telaio estensibile e una fase di stretching, dopo di che la membrana è fissata sul telaio ed una grandezza tratto predeterminato viene applicato sulla scena stretching. Appena isolate neuroni DRG coltivate sulla superficie prestirato che fino a 21 giorni sono monitorati per l'allineamento assone e spessore. Successivamente, le cellule di Schwann (SC) co-coltura con gli assoni allineati vengono monitorati per mielinizzazione. Incorporando pre-stiro indotta anisotropia superficie siamo stati in grado di migliorare l'allineamento delle cellule-differenziazione e assone allineamento crescita delle cellule staminali mesenchimali e neuroni DRG ^9-10, rispettivamente.

Protocollo

Tutte le procedure per l'isolamento delle cellule sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa presso la Michigan State University.

1. Preparazione di pre-allungato anisotropico Surface

1. Mescolare un 10: 1 soluzione di base e catalizzatore e versare il composto in un piatto di coltura di tessuti (12 cm di diametro). Utilizzare 4.900 mg base e 490 mg di catalizzatore per la miscela totale reticolazione.
2. Mantenere la miscela gel sotto vuoto per 20 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
3. Mettere il composto gel nel forno per polimerizzazione durante la notte a 60 ° C.
4. Dopo le cure membrana PDMS, trattare la superficie con plasma di ossigeno utilizzando un sistema di pulizia / attacco in plasma per 3 min a 165 mTorr e 65 sccm flusso di O _2.
5. Tagliare un pezzo di membrana rettangolare (5 × 3,5 cm) dal piatto, pur essendo consapevoli che parte è l'ossigeno-trattati, assicurarsi che il lato di ossigeno trattato rivolto verso l'alto e fissare su un telaio di stretching. Posizionare il telaio su una allungamento fase e uniformemente allungare ruotando la manopola sulla scena fino a raggiungere il 10% di allungamento (o qualche altro tratto predeterminato, l'allungamento può essere letta direttamente dalla fase stretching) in asse maggiore ^9. Fissare il tratto serrando le viti sul telaio.
6. Rimuovere il telaio dal palco. Assicurarsi che la superficie della membrana è asciutto e privo di polvere, quindi posizionare una camera di silicone sulla membrana che permette la parte adesiva della camera per fissare saldamente alla membrana.
   Nota: La camera di silicone fornisce un pozzo per trattenere il mezzo cellulare sulla membrana PDMS. Il design del dispositivo è mostrato in Figura 1.
7. Sterilizzare la superficie con UV per 10 min.
8. Aggiungere 1 ml Poly-L-lisina (PLL) (0,01% in tampone fosfato isotonico) alla superficie PDMS all'interno della camera, entro 6 ore di trattamento al plasma e incubare per 2 ore a 37 ° C prima della semina neuroni DRG. Questo migliora l'adesione cellulare.

Le "> 2. Isolamento di DRG

1. Preparare terreno di coltura standard per i neuroni DRG.
2. Prima l'isolamento, l'apparecchiatura autoclave isolamento e reagenti filtranti. Aggiungere 5 ml di tampone isolamento in un pozzetto di un 6-pozzetti e posizionare la piastra su ghiaccio. Preparare 10 ml di terreno di dissociazione aggiungendo 1 ml di collagenasi A (500 U / ml) in 9 ml di 0,05% tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtrare le soluzioni con un filtro da 0,22 um e posto sul ghiaccio.
3. Utilizzare dieci a dodici 5 - 7 ratti Sprague-Dawley giorni 'per l'isolamento. Spruzzare i cuccioli con il 75% di isopropanolo, e il sacrificio per decapitazione.
4. Tagliare via la pelle sovrastante il midollo spinale dal retro e rimuovere il tessuto in eccesso intorno alla spina dorsale. Sotto una lente di ingrandimento chirurgica con i faretti chirurgici su, fare la prima incisione dal collo e poi un taglio lungo la colonna vertebrale su entrambi i lati con le forbici. Rimuovere il rachide dal corpo dei cuccioli e rimuovere i muscoli eccesso. Quindi, usare le forbici per tagliare lungo la long asse della colonna vertebrale e di uso delle pinzette per aprire la colonna vertebrale completamente ed estrarre il midollo cord.Remove la punta da una pipetta per creare una maggiore apertura per il trasferimento dei DRG con tampone di isolamento in una provetta sterile 15 ml.
5. Usando un bel paio di pinzette, rimuovere il ganglio dalla tasca ossea e raccogliere circa 10 - 16 DRG da entrambi i lati. Tagliare le radici nervose e trasferire gangli al buffer isolamento ghiacciato.
6. Rimuovere la punta da una pipetta per creare una maggiore apertura per il trasferimento dei DRG con tampone di isolamento in una provetta sterile 15 ml. Dopo la dissociazione chimica, centrifugare i gangli a 900 xg e 4 ° C per 5 min.
7. Lasciate che i tessuti si depositano sul fondo della provetta e rimuovere delicatamente il buffer di isolamento sulla parte superiore e aggiungere 10 ml di terreno di dissociazione nel tubo.
8. Incubare i tessuti sezionati nel mezzo di dissociazione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 1 ora agitando il tubo ogni 5 - 10 min.
9. Dopola dissociazione chimica, centrifugare i gangli a 900 xg e 4 ° C per 5 min.
10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreni di crescita standard e vortice.
11. Centrifugare le cellule dissociate come indicato nel paragrafo 2.9, ancora una volta.
12. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 12 ml di mezzi di crescita standard e vortice.

3. Cultura di DRG sulla superficie Pre-allungato

1. Prima di semina delle cellule, rimuovere le soluzioni PLL dalla camera e risciacquare la superficie PDMS con acqua sterile e asciugare all'aria.
2. Dopo ri-sospensione le cellule, lasciare che il set sospensione per 1 - 2 min per permettere i detriti di depositarsi sul fondo della provetta. Aggiungere 1,5 ml di sospensione cellulare in ciascuna camera elasticizzato e incubare a 37 ° C in 5% CO _2.
3. Per eliminare le cellule gliali, a 1 giorno di vitro (DIV), aggiungere 10 ml (o 15 ml) miscela di fluoro-2-deossi uridina e uridina (FDU-U) stock solutisu (Vedi Tabella dei Materiali) in ciascun pozzetto. Dopo 7 ore, sostituire questo mezzo con mezzo di crescita standard di fresco e posizionare il dispositivo di pre-stirato cultura in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO _2.
4. Durante il periodo di coltura cellulare (2 - 3 settimane), cambiare i media ogni due giorni, sostituendo la metà del mezzo trascorso con terreno fresco. Nota: Dopo coltura sulle superfici tese e non deformato per 2 settimane, SC purificati vengono aggiunti alla camera e coltivate per un'altra settimana (passo 4.7).

4. La co-coltura di cellule di Schwann (SCS) con DRG neuroni sulla superficie Pre-allungato

1. Isolare SC come descritto dal gruppo del Dr. Campana in precedenza ^15.
   1. In breve, isolare la SC da un 1 giorno di età cucciolo. Raccogliere e dissociare i nervi sciatico sia chimicamente (tripsina-EDTA e Collagenasi A) e meccanicamente (18 gauge / siringa da 10 ml) ^15.
   2. Seme le cellule dissociate in poli-D-lisina (PDL) copallone ated T25 e la cultura a 37 ° C al 5% di CO _2. Il giorno 5, purificare le cellule attraverso la selezione di anticorpi con Anti-thy 1.1 anticorpi e complemento di coniglio e sottocultura le cellule purificate al passaggio 2 - 4. mezzo di Utilizzo di coltura contenente Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 10% di siero fetale bovino (FBS) , 1% penicillina / streptomicina (Penn / Strep), 21 mg / ml Bovine Pituitary Extract (BPE), e 4 micron Forskolin.
2. Rimuovere il terreno di coltura dalla SC, e aggiungere 5 ml 0,05% tripsina-EDTA nel pallone. Incubare le cellule a 37 ° C al 5% di CO ₂ per 2 - 3 min.
3. Controllare cellule sotto il microscopio ottico utilizzando un obiettivo 10X per vedere se essi sollevano dal pallone, quindi aggiungere 5 ml di terreno di coltura e mescolare con le cellule nel pallone.
4. Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 200 xg e 20 ° C per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 7 ml di DRG serie med crescitaia.
6. Prendere 10 ml di sospensione cellulare in una provetta da 0,5 ml, mescolare con 10 ml di trypan blu, e poi contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro al microscopio ottico con un obiettivo 10X. Diluire la sospensione cellulare a 5.000 cellule per ml aggiungendo terreni di crescita DRG.
7. Rimuovere 0,5 ml di terreno dalla coltura DRG nella camera allungata e aggiungere 0,5 ml di sospensione SC alla cultura DRG.
8. Coltivare le cellule per 1 settimana a 37 ° C e 5% di CO _2. Modificare i media ogni due giorni, sostituendo la metà del mezzo trascorso con terreno di coltura standard di fresco per DRG. Dopo 1 settimana co-coltura, le cellule processo di immunoistochimica ^10.

Risultati

Il sistema di coltura pre-stirato cellule promosso DRG allineamento assone ^10. neuroni DRG sono stati coltivati ​​su superfici pre-stirato e non deformato per 12 giorni. Gli assoni sono state colorate per β-III-tubulina per dimostrare la loro allineamento. La figura 2 confronta orientamento assone sulle PDMS pre-stirato e non deformato substrati dopo 12 giorni di coltura. Gli assoni DRG allineati parallelamente alla direzione allungata, che hanno mostrato alli...

Discussione

Per indurre l'allineamento assone sulla superficie pre-stirato, ci sono due passaggi critici: 1) la membrana PDMS deve essere piana e di spessore omogeneo; e 2) cellule gliali devono essere rimossi dal DRG. Dopo la miscelazione il PDMS e reticolante e cottura in forno, il gel PDMS reticolato dovrebbe essere mantenuto su un banco piana e maneggiato con cura per evitare qualsiasi inclinazione. Il trattamento al plasma di ossigeno della membrana PDMS dovrebbe essere seguita entro 6 ore mediante rivestimento PLL, poiché...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Integratore 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillina-streptomicina	GibcoBRL	15140-122
0,05% Tripsina-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poli-L-Lisina	Trevigen	3438-100-01
Poli-D-Lisina	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deossi-uridina	Sigma	F0503
Uridina	Sigma	U3003
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Tampone di isolamento
Tipo I Collagenasi	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Siero fetale bovino inattivato termicamente	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetici	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Camera in silicone	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Sistema di pulizia/incisione al plasma	March Instruments	PX-250
Anticorpo Anti-Thy 1.1	Sigma- Aldrich	M7898
Complemento di coniglio	Sigma- Aldrich	S-7764
Terreno			di crescita standardPer 500 ml di Neurobasal Medium 1x, aggiungere 10 ml di B-27 50x, 5 ml di Glutamax-I 100x, 2,5 ml di Penicillina/Streptomicina (Penn/Streptomic), 1 ml di Albumax-I e 1 μ l di NGF-- 7S (50 μ g/ml).
FDU Soluzione madre			FDU 100 mg in 10 ml di ddH2O (10 mg/ml), filtrare nella cappa e diviso in 500 μ l. aliquote e conservare a -20 °C. Uridina 5 g in 166,7 ml di ddH2O (33 mg/ml), filtrare in cappa, dividere in 200 & l aliquote e conservare a -20 ºC. Prendi 61.5 μ l di FDU (10 mg/ml) e 20,5 μ l di uridina (33 mg/ml) e aggiungere 4,918 μ l di ddH2O fino alla concentrazione finale di madre, quindi dividere in aliquote da 1 ml e conservare a -20 ºC.

di uridina