Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

Dorrelyn P. Martin; Jharna Miya; Julie W. Reeser; Sameek Roychowdhury

doi:10.3791/54090

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Articolo metodologico

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

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DOI:

10.3791/54090

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4 agosto 2016

Dorrelyn P. Martin¹ , Jharna Miya¹ , Julie W. Reeser¹ , Sameek Roychowdhury¹^,²

¹Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, ²Department of Pharmacology, The Ohio State University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo mirato basato sul sequenziamento dell'RNA che include la preparazione di librerie di cDNA indicizzate, l'ibridazione e la cattura con sonde personalizzate e l'analisi dei dati per interrogare i trascritti selezionati per l'espressione genica, le mutazioni e le fusioni geniche. L'RNAseq mirato consente una valutazione rapida ed economica di trascritti selezionati su un sequenziatore desktop.

Abstract

RNA sequencing (RNA-Seq) è un metodo versatile che può essere utilizzato per rilevare e caratterizzare l'espressione genica, mutazioni, fusioni geniche e RNA non codificanti. Standard RNA-Seq richiede 30-100.000.000 sequenziamento legge e può includere più prodotti di RNA, come mRNA e RNA non codificanti. Dimostriamo come mirato RNA-Seq (cattura) permette uno studio focalizzato su prodotti di RNA selezionati usando un sequencer desktop. cattura RNA-Seq può caratterizzare le trascrizioni non annotate, bassi, o transitoriamente espressi che potrebbero altrimenti essere perse con metodi tradizionali RNA-Seq. Qui si descrive l'estrazione di RNA da linee cellulari, l'esaurimento di RNA ribosomiale, la sintesi del DNA, preparazione di librerie di codice a barre, l'ibridazione e la cattura di trascrizioni mirate e sequenziamento multiplex su un sequencer desktop. Abbiamo inoltre delineare la pipeline analisi computazionale, che comprende la valutazione di controllo della qualità, l'allineamento, la rilevazione di fusione, l'espressione genica quantificazione e identificazione dei singoli NUCvarianti leotide. Questo test permette di sequenziamento mirato trascrizione per caratterizzare l'espressione genica, fusioni geniche e mutazioni.

Introduzione

Il sequenziamento dell'intero trascrittoma o RNA (RNAseq) è un metodo di sequenziamento imparziale per valutare tutti i prodotti a base di RNA. L'obiettivo dell'RNAseq mirato (cattura) è una valutazione mirata di trascritti selezionati con maggiore sensibilità, intervallo dinamico, costo o scala ridotti e maggiore produttività rispetto all'RNAseq standard. Analogamente all'RNAseq standard, gli approcci di arricchimento mirato possono essere utilizzati per valutare l'espressione genica, più specie di RNA come mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA¹, altri RNA non codificanti², fusioni geniche³ e mutazioni^4-6.