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Articolo metodologico

Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro

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DOI:

10.3791/54091

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3 luglio 2016

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1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

In questo articolo

Sommario

La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Un protocollo è presentato per raccogliere e decontaminare nuclei permafrost di suoli e ghiaccio. L'assenza di colonie esogeni e del DNA suggeriscono che i microrganismi rilevate rappresentano il materiale, piuttosto che la contaminazione da perforazione o di trasformazione.

Abstract

La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che hanno persistito in condizioni ambientali passate. In effetti, questi materiali congelati potrebbero riflettere le condizioni per vasti periodi di tempo e l'indagine sui materiali biologici ospitati all'interno potrebbe fornire informazioni sugli ambienti antichi. Per analizzare in modo appropriato questi ecosistemi ed estrarre informazioni biologiche significative dai terreni ghiacciati e dal ghiaccio, è necessaria un'adeguata raccolta ed elaborazione dei campioni congelati. Ciò è particolarmente critico per le analisi microbiche e del DNA, poiché le comunità presenti possono essere così diverse da quelle moderne. Qui viene presentato un protocollo per raccogliere e decontaminare con successo le carote congelate. Sia l'assenza delle colonie utilizzate per drogare la superficie esterna che il DNA esogeno suggeriscono che abbiamo decontaminato con successo le carote congelate e che i microrganismi rilevati provenivano dal materiale, piuttosto che dalla contaminazione dovuta alla perforazione o alla lavorazione delle carote.

Introduzione

La criosfera (ad esempio, permafrost, caratteristiche ghiaccio, neve glaciale, firn e ghiaccio) offre uno sguardo in quali tipi di organismi persistito in condizioni ambientali del passato. Dal momento che questi substrati possono essere decine a centinaia di migliaia di anni, le loro comunità microbiche, quando conservati congelati dal deposito, riflettere antiche condizioni ambientali. Per analizzare in modo appropriato questi ecosistemi ed estrarre informazioni biologiche significative da terreni congelati e ghiaccio, la raccolta corretta e il trattamento dei campioni congelati è necessario. Questo è della massima importanza come proiezioni climatiche per il 21 ° secolo, indicano la possibilità di un riscaldamento accentuato in regioni artiche e subartiche 1. In particolare, Interno dell'Alaska e la Groenlandia sono attesi per riscaldare circa 5 ° C e 7 ° C, rispettivamente, nel 2100 2,3. Questo dovrebbe avere un impatto significativo comunità microbiche acquatiche suolo e, quindi, relativiprocessi biogeochimici. Le temperature più calde e regime delle precipitazioni alterata si prevede di avviare la degradazione del permafrost in molte zone 2-5 che potrebbe condurre ad una più spessa, stagionalmente scongelati (attivo) strato 6,7, lo scongelamento dei terreni congelati, e lo scioglimento dei corpi di ghiaccio enormi, come ghiaccio a terra, cunei di ghiaccio, e la segregazione ghiaccio 8. Questo sarebbe radicalmente modificare gli attributi biogeochimici, oltre alla biodiversità di piante e animali in questi ecosistemi.

ghiaccio glaciale e le caratteristiche del permafrost sedimenti e ghiaccio syngenetic hanno intrappolato chimica e prove biologiche di un ambiente che rappresenta ciò che ha vissuto lì al momento le caratteristiche formate. Per esempio, in Alaska interna, sia Illinoisan e Wisconsin età del permafrost sono presenti e questo strato di ghiaccio permanente, in particolare, offre luoghi unici risalenti moderno a 150.000 anni prima del presente (YBP) che contengono prove biologiche e geochimiche del IMPAct dei cambiamenti climatici sulla biodiversità del passato. Come risultato, questi sedimenti forniscono una registrazione della biogeochimica e biodiversità corso di migliaia di anni. Dal momento che la zona ha tassi di sedimentazione bassi e non è mai stato glaciale, campioni indisturbati sono accessibili per la raccolta e l'analisi, sia di perforazione verticalmente nel profilo del suolo o la perforazione orizzontale in galleria. Ancora più importante, i record estesi esistono che soprattutto evidenziare le caratteristiche uniche di biogeochimici del permafrost in questa regione 9-14. In particolare, l'applicazione di analisi del DNA per stimare la presenza e l'entità della biodiversità in entrambi i campioni di ghiaccio e permafrost esistenti e antiche consente esplorazione del legame di antichi condizioni ambientali e habitat per occupazione da organismi specifici.

Precedenti studi hanno identificato impatti climatici sui mammiferi, piante e microrganismi da campioni risalenti a 50k YBP 11, 15-19, anche se ogni studio ha usato un differemetodologia nt per raccogliere e decontaminare il permafrost o ghiaccio core. In alcuni casi, i nuclei di perforazione sono state sterilizzate 16, 20-21, anche se la metodologia specifica non ha chiarito se gli acidi nucleici estranei sono stati eliminati anche dai campioni. In altri studi, batteri isolati 15 (ad esempio, Serratia marcescens) e microsfere fluorescenti 22 sono stati utilizzati per misurare l'efficacia delle procedure di decontaminazione.

Questo esperimento è stato parte di un più ampio studio indaga le comunità microbiche da campioni permafrost che risalgono a circa 40k YBP. L'obiettivo specifico di questa parte dello studio è stato quello di decontaminare successo di ghiaccio e permafrost core. A nostra conoscenza, metodologia ha integrato l'uso di soluzioni progettate per eliminare gli acidi nucleici estranei e nucleasi associati dalla porzione esterna dei nuclei congelati. Questo nonostante il fatto che queste soluzioni sono commonly utilizzata per decontaminare attrezzature di laboratorio per esperimenti molecolari.

Una volta che i nuclei sono stati decontaminati, DNA genomico è stato estratto utilizzando i protocolli sviluppati da Griffiths et al. 23 e Towe et al. 24, quantificato utilizzando uno spettrofotometro, e diluito con acqua sterile, priva di DNA per ottenere 20 ng per reazione. Batteriche 16S rRNA geni sono stati amplificati con i primer 331F e 797R e sonda BacTaq 25 e 16S archeali rRNA geni sono stati amplificati con i primer Arch 349F e Arco 806R e sonda TM Arch 516F 26 alle seguenti condizioni: 95 ° C per 600 secondi seguiti da 45 cicli di 95 ° C per 30 sec, 57 ° C per 60 sec e 72 ° C per 25 sec con estensione finale a 40 ° C per 30 sec. Tutte le reazioni qPCR sono state condotte in duplicato. I 20 volumi di reazione microlitri incluse 20 ng di DNA, 10 mM di primer, 5 mM della sonda, e 10 ml di miscela di reazione qPCR. standard FOr batterico e dell'archea qPCR sono stati preparati utilizzando DNA genomico da Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum, rispettivamente. Entrambi sono stati coltivati ​​a fase di login. conteggio delle piastre sono state condotte e il DNA è stato isolato dalle colture. DNA genomico è stato quantificato con uno spettrofotometro con l'assunzione di uno e sei copie del gene 16S rRNA per genoma per H. salinarum e P. fluorescens, rispettivamente, 27-28. numero di copie dei geni batterici e archeali sono stati calcolati sulla base della curva standard, log-trasformati per tenere conto di varianze ineguali tra i trattamenti, e valutati da ANOVA.

Composizione della Comunità è stato determinato dal sequenziamento del gene 16S rRNA utilizzando celle di flusso e le tecnologie di amplificazione del ponte e l'analisi delle comunità con 'intuizioni quantitativi in ecologia microbica' (QIIME) 29. Avanti e retromarcia legge sono state riunite insieme e poi le sequenze sono stati filtrati, indicizzati,e rappresentanti di alta qualità sono stati selezionati per de novo unità tassonomiche operative (OTU) Assegnazione attraverso l'allineamento di sequenze, con un database di riferimento. sequenze allineate sono stati confrontati con un database di riferimento separata per l'assegnazione tassonomica. Una tabella OTU livello phylum è stato creato per determinare la composizione generale della comunità.

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Protocollo

1. apparecchiature Preparazione e Permafrost Collezione Core

  1. preparazione attrezzature e la raccolta del campione campo e gli attrezzi di conservazione
    1. Assemblare coclea per la raccolta del campione inserendo l'adattatore azionamento nella parte superiore della canna e ruotando la leva per bloccarla in posizione. Pin il tubo adattatore sull'adattatore unità e il perno del motore sul tubo adattatore. Inserire le frese sulla canna.
    2. Indossare abiti leggeri dovere, guanti di nitrile, e maschere per ridurre qualsiasi contaminazione ai campioni. Indossare protezioni per le orecchie e un cappello duro per la sicurezza entrando nel permafrost Tunnel (Figura 1).
    3. Entrate nel tunnel e selezionare una posizione per raccogliere i campioni (Figura 1B).
      Nota: Per la posizione di foratura verticale o orizzontale, seleziona una zona dove non è noto evidenza che il materiale è congelato (ad esempio, ghiaccio o permagelo), non ci sono grandi sistemi radice noti, e non c'è ghiaia noto. Rimuovi tuttovivente materiale vegetale dalla zona prima di raccogliere un campione. Se la perforazione verticale o in orizzontale, selezionare una zona che è relativamente piatta e accessibile con la coclea.
    4. Preparare una stazione di lavoro stratificando il terreno con un materiale plastico che è stato sterilizzato con il 70% di isopropanolo, soluzione decontaminante DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    5. Posizionare di 10 cm di diametro cloruro di polivinile (PVC) taglio del tubo a metà longitudinalmente sulla workstation per fornire un trogolo per contenere i nuclei in cui sono rimossi dalla coclea. Decontaminare il tubo in PVC con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    6. Nei pressi della stazione di lavoro, decontaminare l'coclea a spruzzo con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi. Rimuovere le soluzioni dalla coclea con un wipe.
  2. Ghiaccio e del permafrost raccolta core e lo stoccaggio
    1. Selezionare un'area della parete di campione (vedi 1.2.1Nota).
    2. Decontaminare di circa 10 cm di diametro della superficie della parete congelata strofinandola con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    3. Sollevare la coclea decontaminato la zona di interesse, che è perpendicolare alla superficie del campione e iniziare la perforazione della faccia pulita della parete (Figura 1C, D).
    4. Rimuovere con attenzione la coclea dalla zona di raccolta del campione. Scollegare la trivella dal motore e posizionare la coclea sopra il tubo di PVC sterile nella stazione di lavoro pulito. Inclinare con cautela coclea in modo che i nuclei congelati scivolare fuori sul tubo in PVC sterile (Figura 1E).
    5. Decontaminare guanti con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    6. Raccogliete le carote di ghiaccio e permafrost con i guanti sterili e metterli in sacchetti sterili.
    7. Mettere i nuclei in una stanza più fresca o fredda fino a quando non vengono spediti o trattati.
    8. Ship i nuclei congelati utilizzando ghiaccio secco di mantenere ad una temperatura inferiore a 0 ° C.
    9. archiviare immediatamente i nuclei a -80 ° C.

2. Il permafrost e del ghiaccio core di elaborazione

  1. Preparazione del materiale
    1. Preparare sterili, nucleico gratuito stagnola acido pesante alluminio, scaffalature metalliche, vetro, pinze di metallo, e lana di vetro per la cottura in forno a 450 ° C per 4 ore. Mettere da parte di questi materiali fino al momento dell'utilizzo.
    2. Sterilizzazione 95% di etanolo e acqua ultrapura passando le soluzioni attraverso un filtro di 0,22 micron.
    3. soluzione di etanolo Conservare a -20 ° C e acqua a 4 ° C.
    4. Sterilizzare un righello di plastica a spruzzo con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione RNasi decontaminazione e subito pulire dopo ogni soluzione.
  2. Batterica cultura Preparazione
    1. Preparare il brodo e le piastre a crescere Serratia marcescens.
      1. Per il brodo, unire 5 g provaptone, 1 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, e 1 g di fosfato di potassio bibasico, e acqua quindi aggiungere distillata per raggiungere 1 L. Per fare piatti, aggiungere 15 g di agar a quanto sopra mix. Per brodo e piatti, aggiustare il pH a 7 e in autoclave a 121 ° C per 15 min.
    2. Preparare 1x fosfato tamponato soluzione salina (PBS) combinando 8 g di sodio cloruro, 0,2 g di cloruro di potassio, 1,44 g di fosfato di sodio dibasico, e 0,24 g di potassio fosfato monobasico e aggiungere acqua distillata per raggiungere 800 ml. Regolare il pH a 7,4 e aggiungere acqua distillata per raggiungere 1 L. autoclave a 121 ° C per 15 min.
    3. Seminare brodo con un'ansa sterile per immersione in S. cultura marcescens che è stato precedentemente congelati a -80 ° C. In condizioni asettiche, diluito seriale cultura aggiungendo 1 ml di coltura a 9 ml di PBS e capovolgere la soluzione. Aggiungere 1 ml di questa diluizione a 9 ml di PBS e invertire manualmente la soluzione. Ripetere più otto volte fino a quando una diluizione 10 -9zione è raggiunto.
    4. Stendere le 10 -6, -7 10, 10 -8 e 10 -9 soluzioni su piastre di agar distribuendo 1 ml di brodo sulla piastra e la diffusione con una spatola cellulare. Fate questo in triplice copia per ogni diluizione. Conservare la cultura d'origine a 4 ° C.
    5. Incubare le piastre a 30 ° C per 24 ore. Contare il numero di colonie per calcolare il numero di cellule nella coltura originale. Nota: Il numero di colonie nella cultura originale dipenderà dal tasso di crescita dei batteri.
    6. Dispensare 250 microlitri della cultura d'origine in una sterile 1,5 ml provetta. Diluire coltura originale aggiungendo un volume sufficiente di 1x PBS per ottenere circa 10 9 cellule / ml come determinato dal conteggio delle colonie nel passaggio precedente. Agglomerare le cellule in una provetta per centrifugazione a 2.500 xg per 10 min.
      Nota: Il volume di PBS 1x varierà a seconda del tasso di crescita dei batteri.
    7. In un biohood sterile, Pipettare fuori il brodo e risospendere le cellule in 1 ml di 1x tampone PBS. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso o circa due mesi.
    8. Il giorno della trasformazione, diluire il S. cultura marcescens dal punto 2.2.7 con l'aggiunta di 1 ml dell'originale S. cultura marcescens a 39 ml 1x tampone PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml.
  3. Preparare spazio della stanza fredda per core e l'ingranaggio di conservazione
    1. Prima di raffreddando la stanza fredda, le pareti pulite, pavimenti, e tavolo di metallo con una soluzione di candeggina 1%.
    2. Impostare la temperatura di cella frigorifera a circa -11 ° C.
    3. Una volta che la cella ha raggiunto la temperatura desiderata, indossare abiti leggeri duty, guanti nitrile e maschere di ridurre qualsiasi contaminazione della cella e campioni.
      Nota: Due individui correttamente vestiti sono necessari per questa procedura.
    4. Portare i materiali sterili (ad esempio, un foglio di alluminio, scaffalature metalliche, vetro, vassoio, S. marcescens cultura, e milama microtomo) e campioni nella camera fredda e posto sul tavolo sterile.
  4. Il permafrost e la lavorazione carota di ghiaccio in una struttura di cella frigorifera
    1. Posizionare un nucleo permafrost in una sterile, l'acido nucleico foglio privo di un foglio di alluminio.
    2. Leggermente inoculare il esterna del nucleo con la cultura diluita di S. marcescens utilizzando un tampone in spugna sterile (Figura 2B).
    3. Posizionare il nucleo sulla griglia metallica sterile che si trova sopra un vassoio.
    4. Sterilizzare la lama microtomo inossidabile con etanolo al 70%, soluzione decontaminante DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    5. Avere privato Un guanti di nitrile pulita con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi e tenere core a un angolo di 45 ° al di sopra del cassetto.
    6. Avere Persona B raschiare delicatamente circa 5 mm di lato esterno del intero nucleo, tra le estremità, utilizzando la lama sterile mentre Persona A si nucleo dopo ogni raschiatura ( Figure 2C e 3A, B). Pulire la lama con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi come necessario.
    7. Avere Persona B versare sterilizzata per filtrazione, etanolo al 95% sopra il nucleo accuratamente e rapidamente, mentre Persona A si nucleo come la soluzione viene versata (figure 2D, 3C).
    8. Avere individuale B lavare immediatamente il nucleo con acqua sterilizzata per filtrazione.
    9. Sostituire cremagliera metallico utilizzato su vassoio con un nuovo rack di metallo sterile.
    10. Avere privato Un pulire i suoi guanti di nitrile con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi e tenere premuto il core a un angolo di 45 ° al di sopra del cassetto.
    11. Avere individuale B spruzzare l'intero nucleo con una soluzione di decontaminazione DNA.
    12. Avere individuale B lavare immediatamente il nucleo con acqua sterilizzata per filtrazione.
    13. Avere individuale B spruzzare l'intero nucleo con una soluzione di decontaminazione RNasi.
    14. avere IndividuAl B lavare immediatamente il nucleo con acqua sterilizzata per filtrazione.
    15. Posizionare il nucleo su un foglio di alluminio sterile e avvolgere leggermente.
  5. nucleo esterno Thaw
    1. Posizionare un telaio metallico sterili su un piatto di vetro sterile in un biohood sterile con flusso laminare.
    2. Inserire due piastre di agar specifici per S. marcescens nel piatto di vetro sotto del rack sterile per raccogliere il liquido dal nucleo (figura 2E).
    3. Posizionare il nucleo sulla griglia metallica sterile.
    4. Lasciare circa 2-5 mm della superficie esterna del nucleo scongelare a 23 ° C (in media, questo avverrà entro circa 10 min). Ruotare il nucleo di circa 90 ° ogni 2 min.
    5. Tamponare tutta la superficie del nucleo con pinza sterile e lana di vetro sterile e inoculare due piastre di agar specifico per S. marcescens tamponando questi materiali sulla superficie delle piastre. Seminare due nuove piastre con coltura originale utilizzato per drogare all'esterno dellanucleo, che è stato esposto a basse temperature della stanza fredda.
    6. Misurare le dimensioni esterne del nucleo cilindrico scongelato inserendo un righello sterile vicino, ma non tocca il nucleo.
    7. Posizionare il nucleo in grande borsa sterile e conservarlo a -80 ° C.
  6. Controllare per la crescita
    1. Incubare le piastre di agar a 23 ° C per una settimana.
    2. Esaminare le piastre di agar per la crescita di S. colonie marcescens.
      1. Se non ci sono colonie visibili sulla piastra, procedere al punto 2.5.3.
      2. Se le colonie appaiono sulla piastra, ripetere dal punto 2.1.1 della sezione 2 "Permafrost e l'elaborazione carota di ghiaccio".
    3. Ottenere il nucleo dal congelatore e asetticamente trasferirlo ad un sacchetto sterile.
    4. Conservare il nucleo in una sacca sterile a 4 ° C per circa 24-48 ore per scongelare l'intero nucleo.

3. Ottenere sottocampione per estrazione degli acidi nucleici da Ice Cores e Permafrost

  1. estrazione degli acidi nucleici da carote di ghiaccio
    1. Mescolare il materiale sciolto dal nucleo di ghiaccio agitando delicatamente la borsa (Figura 2G).
    2. Versare il materiale scongelato in un contenitore sterile con un filtro da 0,22 micron sotto vuoto per raccogliere microrganismi.
    3. Asetticamente rimuovere il filtro con una pinza sterile e posizionarlo in un 2 ml tubo tallone ceramica sterile (1,4 mm).
    4. Conservare il filtro a -80 ° C.
  2. estrazione degli acidi nucleici da nuclei permafrost
    1. Mescolare il materiale sciolto dal nucleo del permafrost da impastare delicatamente la borsa.
    2. Dopo che il permafrost è stato ben miscelato, ottenere un sottocampione di terreno massa circa 0,5 g con un scoopula sterile e collocarlo in una sterile 2 ml tubo ceramico tallone tappo a vite tarata (1,4 mm) che si trova in posizione verticale su una bilancia.
    3. sottocampioni conservare a -80 ° C.
    4. Ottenere contenuto d'acqua gravimetrica dei campioni.
      1. Misura 10 g del permafrost con una sterilee scoopula e mettere in un barattolo tarato su una bilancia. Misurare la massa umida del permafrost e stagno.
      2. Incubare permafrost in forno a 105 ° C per 24 ore. Misurare la massa secca del permafrost e stagno.
      3. Calcolare il contenuto d'acqua gravimetrico sottraendo la massa umida del permafrost dalla massa secca del permafrost e dividendo per la massa secca del permafrost.
    5. Conservare permafrost a -80 ° C.

4. Estrarre acidi nucleici dal permafrost e del ghiaccio Cores

  1. preparazione del materiale
    1. Preparare fiale ambrate per contenere soluzioni trattando con 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC), incubazione O / N a 37 ° C, e la sterilizzazione in autoclave.
    2. Preparare 240 mM tampone fosfato di potassio. Aggiungere 2. 5 g di potassio fosfato monobasico e 38,7 g di potassio fosfato bibasico. Regolare il volume finale a 500 ml con l'aggiunta di acqua sterile.
    3. Preparare il bromuro di esadeciltrimetilammonio (CTAB) estrazione buffer sciogliendo 4,1 g di cloruro di sodio in 80 ml di acqua e aggiungere lentamente 10 g CTAB durante il riscaldamento e agitazione. Regolare il volume finale a 100 ml con l'aggiunta di acqua sterile.
    4. Aggiungere volumi uguali di soluzione tampone fosfato e tampone CTAB e filtro sterilizzare con un filtro da 0,22 micron. Coprire bottiglia con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente.
    5. Preparare 1,6 M soluzione di cloruro di sodio (NaCl) combinando 9,35 g di NaCl e 100 ml di acqua sterile. Aggiungere 10 g di polietilenglicole 8000 alla soluzione e filtro sterilizzare 1.6 M NaCl. Conservare a 4 ° C.
  2. Estrazione Acido nucleico secondo una versione modificata di Griffiths et al. 22 e Towe et al. 23
    1. Indossare abiti leggeri dovere, guanti di nitrile, e maschere. spazio di laboratorio pulito e pipette con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    2. Rimuovere sottocampione (filtro dal nucleo di ghiaccio o campione di suolo permafrost) in 2 ml di perline di ceramica a vite catubo p da -80 ° C freezer e scongelare a RT.
    3. Aggiungere 0,5 ml di esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) tampone di estrazione e vortex brevemente.
    4. Aggiungere 0,5 ml di alcool di fenolo-cloroformio-isoamilico (25: 24: 1) (pH 8) e agitare provette orizzontalmente per 10 minuti utilizzando un adattatore pannello piatto su un vortex.
    5. A seguito di bead-battito, provette da centrifuga a 16.100 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    6. Rimuovere fase acquosa in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e mescolare con un uguale volume di cloroformio-alcool isoamilico (24: 1). Centrifugare a 16.100 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    7. Rimuovere fase acquosa in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e aggiungere due volumi di 30% di polietilene glicole 8000 e 1,6 M NaCl. Incubare per 2 ore a 4 ° C.
    8. Centrifugare a 16.100 xg per 10 min a 4 ° C.
    9. Lavare pellet acido nucleico con circa 500 ml di ghiacciata etanolo al 70% e centrifugare a 16.100 xg per 10 min a 4 ° C.
    10. Aria pellet secco in un biohood sterile per 2 ore. Risospendere in 50 microlitri DNasi / RNasi-free tampone TE (pH 8,0). DNA è pronto per le applicazioni a valle, come la PCR e qPCR.
    11. Determinare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.
    12. Diluire il DNA con acqua sterile, priva di DNA per ottenere 20 ng per reazione.

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Risultati

Il metodo presentato potrebbe essere utilizzato per decontaminare campioni congelati raccolti da vari ambienti criosfera, dal ghiaccio glaciale al permafrost. Qui vi presentiamo i dati specificamente raccolti da campioni di ghiaccio e permafrost raccolti dalla ricerca di Ingegneria e Centro Sviluppo - Cold Regions Research and Laboratory Engineering (ERDC-CRREL) Permafrost tunnel situato a Fox, AK (Figura 1A e 1B). Il permafrost tunnel si estende a circa...

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Discussione

La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Anche se il taxa recuperato non può rappresentare la comunità storica completa, quelli recuperati dalle analisi di campioni di ghiaccio e permafrost glaciali possono produrre preziose informazioni storiche su Select periodi di tempo 15-16. Per esempio, informazioni biologiche significativa è stata elaborata da studi di ghiaccio che studiano l'attività anaerobica nella calotta glaciale della Groenland...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato attraverso il Centro di Ricerca e Sviluppo del Genio dell'Esercito degli Stati Uniti, Ufficio Programma di Ricerca di Base. Il permesso per la pubblicazione di queste informazioni è stato concesso dal Capo degli Ingegneri.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% IsopropanoloWalmart551116880
95% Alcol etilico (denaturato) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
Soluzione di decontaminazione del DNA, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
Soluzione di decontaminazione con RNasi, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Tute per impieghi leggeriKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Guanti in nitrileFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Maschere antiviraliCurad, WalgreensCUR3845
Sacchetti per campioni sterili...Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Lama per microtomo in acciaio B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Rack in metallofabbricato presso CRREL, Hannover, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Foglio di alluminioWestern Plastics, Temecula, CA
Flacone da 500 ml con 0,22  μ m FiltroCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Cappa di biosicurezzaNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Piastra di PetriFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlucosioFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Estratto di lievitoFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Fosfato dipotassicoJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Sparks, MD214530
Spettrofotometro UV/VIS NanoDrop 2000Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Kit di isolamento del DNA microbicoMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Protezione dell'uditoElvexEP-201
Elmetto
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Lana di vetroPyrex430330
Righello
Pesare lo stagno Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Cloruro di sodioSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Cloruro di potassioJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Fosfato di potassio, monobasicoJT Baker, Phillipsburg, NJ 3246-01
Fosfato di potassio, bibasicoJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Fosfato di sodio bibasico, anidroFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
Provette da centrifuga da 50 mlCorning, Corning, NY4558
Provette per microcentrifuga da 2 mlMoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
Provette per perline in ceramica da 2 ml (1,4  mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Esadeciltrimetilammoniabromuro (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
Polietilenglicole 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Alcool fenolo-cloroformio-isoamilico (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrifugaEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Alcool cloroformico-isoamilico (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 e 1.000 &; l pipette
Punte per pipetteRainin, Woburn, MARainin LTS presterilizzate, bassa ritenzione, punte filtrate, 10, 20, 200, 1.000  µ
VortexorScientific Industries, Boemia, NYG-560
Adattatore a vorticeMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Bottiglia trasparenteCorning, Corning, NYC1395500
Bottiglia ambrataCorning, Corning, NYC5135250
Filtri per bottiglie, 0,22 µ mCorning, Corning, NY430513
Siringa da 60 mlBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Filtri per siringhe Milex, 0,22 μ mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70% EtanoloFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500diluito e sterilizzato con filtro
Isotemp 100 L FornoFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Spandiconcime cellulareFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Anelli di inoculazione monousoFisher Scientifico, Pittsburgh, PA22-363-602
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Riferimenti

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