Vi presentiamo semplici tecniche per isolare giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi da ovociti di rane e salamandre vivono. Descriviamo come osservare questi cromosomi "vivo" di contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale, e come risolverli per fluorescente ibridazione in situ o di immunofluorescenza colorazione.
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Articolo metodologico
Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo i metodi per lo studio dei giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi (LBCs) in ovocita o uovo posata, di rane e salamandre. LBCs individuali possono essere fino a 1 mm di lunghezza e risiedere in un nucleo gigantesca, per sé fino a 0,5 mm di diametro. Le grandi dimensioni dei cromosomi permette osservazioni ineguagliabile geni attivi di microscopia ottica luce, ma allo stesso tempo tecniche speciali sono necessari per isolare il nucleo, la rimozione della membrana nucleare, e diffondere i cromosomi su un vetrino da microscopio. Il nucleo di ovociti, detto anche germinale vescicole (GV), è isolato in un mezzo che permette di gelificazione parziale della actina nucleare e preserva la delicata struttura dei LBCs. Questa fase viene effettuata manualmente sotto un microscopio da dissezione con pinze del gioielliere. Successivamente, l'involucro nucleare viene rimosso, sempre manualmente con le pinze del gioielliere. I contenuti nucleari sono rapidamente trasferiti in un mezzo che VerniceRSES il gel actina e permette ai LBCs intatti di stabilirsi su un vetrino da microscopio. A questo punto i LBCs e altri organelli nucleari possono essere visualizzati da contrasto di fase o microscopio a contrasto di interferenza differenziale, anche se i dettagli più fini sono oscurati da moto browniano. Per l'alta risoluzione di osservazione microscopica o analisi molecolare, tutta la preparazione viene centrifugato per fissare saldamente le LBCs delicati alla diapositiva. Una breve fissazione in paraformaldeide è poi seguita da immunofluorescenza colorazione o ibridazione in situ. LBCs sono in uno stato trascrizionalmente attivo e le loro enormi dimensioni permette l'analisi molecolare a livello di singolo gene utilizzando confocale o la microscopia super-risoluzione.
Introduzione
La maggior parte dei vertebrati, con la notevole eccezione di marsupiali e mammiferi placentati, producono grandi uova Yolky. Nonostante la loro talvolta enormi dimensioni, queste uova sono cellule singole che raggiungono la loro dimensione finale, pur nelle ovaie della femmina. Uova ovariche sono chiamati ovociti e ogni genere contiene un singolo nucleo gigante, conosciuta sin dagli inizi del 19 ° secolo come il vescicola germinale o semplicemente GV. 1 ovociti delle rane di laboratorio comuni, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, raggiungono un diametro massimo di 1,2 mm e 0,8 millimetri, rispettivamente (Figura 1).
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Protocollo
Informazioni generali su rane e salamandre, così come fonti di animali, si possono trovare presso i seguenti siti: Xenbase (http://www.xenbase.org) e Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali del Dipartimento di Embriologia della Carnegie Institution for Science.
1. Soluzioni
- Fare 10 L "acqua rana": aggiungere 10 ml di 1 M CaCl 2 e 10 ml di 1 M NaHCO 3 a 10 L deionizzata o H 2 O declorurata con agitazione.
- Fare 1 L 20% paraformaldeide: fare 1 L di 4 mM Na 2 CO 3. In una cappa chimica aggiungere 200 g di p....
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Risultati
Per esaminare giganti cromosoma a spazzola si comincia isolando ovociti da una rana o di salamandra. La figura 1 mostra un gruppo di oociti maturi in una soluzione salina tamponata dopo la rimozione dal ovaio della rana, Xenopus. Tali ovociti rimangono in buone condizioni per giorni a temperatura ambiente. Il nucleo (o vescicola germinale) sono eliminati da un ovocita con una pinza di gioielli, sia in soluzione salina (Figura 2) o in olio
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Discussione
Le prime osservazioni di LBCs "vivente" GVS-isolato mano di rane e salamandre sono state fatte quasi 80 anni fa dal biologo americano William Duryee, 19 prima dell'introduzione del contrasto di fase e microscopia DIC, prima di immunostaining fluorescenti, e prima di FISH. I vantaggi di LBCs per indagare i dettagli della struttura cromosomica e trascrizione a livello singolo gene sviluppo necessario di tecniche per fissare la LBCs di vetrini, di risolverli in modo realistico, e di applicare tecni.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01 GM33397. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. J.G.G. è professore di genetica dello sviluppo presso l'American Cancer Society.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeide (grado reattivo, cristallino) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Nonostante le avvertenze in molti protocolli, una soluzione concentrata può essere conservata indefinitamente a RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesolfonato | Sigma-Aldrich | A5040-100G | A volte indicato come MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 suture | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (cera di paraffina) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Fenilendiammina | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatina | Negozio | Commerciale La gelatina Knox funziona bene | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Vetro di copertura Gold Seal 22 x 22 mm #1 1/2 (0,16 - 0,19 mm di spessore) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | Questi vetrini coprioggetti sono lo spessore consigliato per la microscopia a superrisoluzione |
| Pinze Dumont #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Olio di paraffina (leggero) | EMD Chemicals | PX0047-1 | Per l'isolamento di GV in olio |
| Adesivo in situ PCR e camere di ibridazione (25 &; micro; L) | BioRad | Frame-Seal #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Isolatori in silicone | Grace-Biolabs | seleziona dal catalogo | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin barattoli e piastre di colorazione | Scienze di microscopia elettronica | seleziona dal catalogo | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Riferimenti
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G.
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Ristampe e permessi
