Una strategia rapido per l'isolamento di nuovi Faustoviruses da campioni ambientali Utilizzando<em> vermiformis Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
L'isolamento del virus giganti è di grande interesse in questa nuova era di virologia, soprattutto perché questi virus giganti sono legati alla protisti. i virus giganti possono essere potenzialmente patogeni per molte specie di protisti. Essi appartengono all'ordine recentemente descritto di Megavirales. La nuova stirpe Faustovirus che è stato isolato da campioni di acque reflue è lontano parente del virus della peste suina africana mammiferi patogeno. Questo virus è anche specifico per il suo ospite amoebal, vermiformis Vermamoeba, un protista comune nei sistemi idrici sanitari. E 'fondamentale continuare a isolare nuovi genotipi Faustovirus al fine di ampliare la sua collezione genotipo e studiare la sua pan-genoma. Abbiamo sviluppato nuove strategie per l'isolamento di ceppi supplementari migliorando l'uso di combinazioni di antibiotici e antifungini per evitare contaminazioni batteriche e fungine della co-coltura amebe e favorendo la moltiplicazione del virus. Abbiamo anche implementato un nuovo starvation medio di mantenere V. vermiformis in condizioni ottimali per i virus co-coltura. Infine, abbiamo utilizzato la citometria a flusso anziché osservazione microscopica, che richiede tempo, per rilevare l'effetto citopatico. Abbiamo ottenuto due isolati da campioni di depurazione, dimostrando l'efficacia di questo metodo e ampliando così la raccolta di Faustoviruses, per capire meglio il loro ambiente, specificità dell'ospite e contenuto genetico.
Introduction
La scoperta del virus giganti, specialmente quelli appartenenti all'ordine Megavirales, completamente cambiato il mondo dei virus in termini di dimensione delle particelle e del genoma complessità. I virus sono stati precedentemente pensato per essere piccole entità, e la mimivirus sembravano rompere tutte le regole. 1 metagenomiche dati suggeriscono l'ubiquità di virus giganti, non solo per l'ambiente, 2-5 ma anche negli esseri umani. 6 Pertanto, non vi è ancora la necessità per la ricerca di questi virus su larga scala. La diversità di questi virus giganti è stata valutata mediante il campionamento non solo una varietà di ambienti acquatici e delle loro sedimenti associati in tutto il mondo, 7-11 ma anche con la proiezione di una serie di campioni umani 12,13 e campioni ambientali. 7,9 I mimivirus Polyphaga Acanthamoeba è stato isolato dal co-coltura con protisti fagocitosi, soprattutto Acanthamoeba spp. 14-16 un'intera collezione di virus giganti sono stati poi ancheisolata da questo host protista specificato, che ha reso la comunità scientifica limitare la sua procedura di ricerca e di isolamento per Acanthamoeba spp. Chiaramente questo affidamento su una singola specie ospite ha portato ad una grande frazione di virus essere trascurato. Il fatto che il virus gigante, CroV, è stato isolato con il altamente mobili marino protozoi Caffetteria roenbergensis, 17,18 dimostra la necessità di utilizzare una gamma più ampia di protozoi, al fine di scoprire nuove linee o famiglie di virus giganti. Reteno et al. Sono riusciti a selezionare altri protozoi come host di cellule che non era mai stato utilizzato in precedenza, e isolato la nuova stirpe Asfar correlati di virus giganti (il nuovo nome Faustovirus). 19
Nel tentativo di isolare nuovi genotipi Faustovirus al fine di espandere i membri di questo lignaggio virale, abbiamo modificato le nostre procedure di isolamento e li hanno usati per lo screening campioni ambientali capaci di raccolta nuovi Faustoviruses. abbiamo poidescritto l'intero protocollo per caratterizzare i nuovi isolati. Abbiamo valutato vermiformis Vermamoeba, il protista a vita libera più comune in ambienti umani, 20-22 che è già utilizzato per l'isolamento del primo prototipo Faustovirus E12. 19 Questo protista è attualmente ancora-host specifico per Faustovirus. Sapevamo che nessuno dei virus noti giganti era patogeni per questa ameba, perché nessun tentativo di crescere altri virus giganti nel nostro laboratorio ha mostrato lisi ameba o la crescita virale. Per questo motivo, riteniamo che V. vermiformis è il migliore e più unico supporto di cellule noto per isolare nuovi Faustoviruses.
Protocol
Raccolta 1. Esempio
- Raccogliere 70 campioni provenienti da diversi ambienti e regioni. In questo caso, utilizzare i seguenti: 5 campioni di acqua sporca dal villaggio di Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 campioni dal lago nel Parc Borély a Marsiglia (Francia); 15 campioni di acqua di mare con sedimenti dalle insenature rocciose a Samena a Marsiglia (Francia), 25 campioni di acqua del fiume dalle Alpi (Francia), e, infine, 10 campioni di acque reflue a La Ciotat (Francia).
- campioni Vortex per omogeneizzazione prima inoculando, per un minuto a temperatura ambiente senza alcun trattamento.
Procedura 2. Isolamento
- Host Preparazione per le procedure non vedenti Cultura e inoculazione del campione
- Usa V. vermiformis (ceppo CDC19) come supporto di cellule per la co-coltura.
- Mantenere la amebe a 28 ° C, in 75 cm pallone di coltura cellulare 2 con 30 ml di proteasi peptone-lievito medio estratto-glucosio (PYG). Si prega di verificare la composizione PYG nella tabella 1.
Nota: Dopo 48 ore, amebe sono quantificata una conta normale usando diapositive di conteggio (ad esempio, Kovaslides). - Celle di raccolta ad una concentrazione di 5 x 10 5 al 10 6 celle / ml, e pellet amebe per centrifugazione a 720 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet amebe in 30 ml di soluzione fisiologica sterile amoebal di pagina (PAS) Tabella 1. Ripetere la procedura di lavaggio.
- Risospendere amebe in 30 ml di terreno inedia con una miscela antibiotica e antimicotica ad una concentrazione di circa 10 6 amebe / ml. Il mezzo la fame è un mezzo di sopravvivenza per l'ameba, permettendogli di rimanere in vita senza incistamento o moltiplicazione. Controlla composizione in Tabella 1.
Nota: Il mix agente antimicrobico conteneva 10 mg / ml vancomicina, 10 mg / ml imipenem, 20 mg / ml di ciprofloxacina, 20 μg / ml doxiciclina, e 20 ug / ml voriconazolo. Questa miscela è servita a ridurre la contaminazione batterica e fungina che può diminuire o alterare la moltiplicazione virale. - Direttamente inoculare 25 ml di ogni campione sul 200 microlitri amebe monostrato in un fondo piatto piastra a 96 pozzetti favorire l'aderenza amebe e incubare a 30 ° C in un ambiente umido (un ambiente umido consiste nel porre un impacco bagnato all'interno sacchetto contenente il piastra per evitare l'evaporazione). Questo è il primo-coltura. Lascia due pozzi di amebe senza inoculazione del campione; questo agisce come controllo negativo. Incubare questo primo-cultura per tre giorni.
- Tre giorni dopo il primo inoculo, subcultura piastra primo-coltura su amebe fresca come descritto sopra senza alcuna osservazione microscopica. Incubare la nuova piastra per tre giorni sotto le stesse condizioni del primo-coltura.
- Eseguire la coltura, dopo questi tre giorni di incubazione stesso modo come per the primo- e sub-cultura. Incubare la cultura finale per due giorni. Quindi procedere al rilevamento.
- Rilevazione di Lysis da Automated citometria a flusso
Nota: la cultura cieco accoppiato con flusso differisce citometria dal precedente sistema standard di isolamento. E 'più sensibile, preciso e automatizzato. Per scopi di rilevamento, abbiamo applicato una nuova tecnica sviluppata per rilevare lisi alla massima velocità e senza osservazione microscopica. Questa tecnica è vantaggiosa per i campioni di screening e ha una migliore sensibilità rispetto alle tecniche più anziani. 7-9- Utilizzare la piastra a 96 pozzetti della co-coltura finale per rilevare lisi.
- Accendere il citometro ed eseguire un ciclo di pulizia e di risciacquo in modo da ottenere il rumore di fondo più basso secondo il protocollo del produttore.
- Avviare l'High Throughput Sampler (HTS) in combinazione con citofluorimetro per caricare automaticamente i campioni dalla piastra a 96 pozzetti e di eseguire una acquisizione completamente automatizzato entro 40 min According il protocollo del produttore.
- Impostare i HTS come segue: volume del campione 150 microlitri, mescolando il volume 50 ml, velocità 180, il numero di miscele 5 miscelazione, il volume di lavaggio tra ogni campione di 400 ml, portata 2,5 ml / sec, il numero di eventi registrati 10.000.
- Valutare i pozzetti di controllo negativo della co-coltura micro-piastra finale di per cancello popolazione amebe e per determinare la percentuale di questi host cellule secondo le loro caratteristiche fisiche. Essere sicuri di avere una popolazione un'ameba omogenea e una seconda popolazione di un eventi inferiore corrispondente a detriti e rumore.
Nota: Questa procedura gating distingue detriti subcellulare e grumi da singole cellule per dimensione, stimati dalla dispersione in avanti. È pertanto importante determinare con precisione la percentuale di ciascuna popolazione utilizzando la procedura migliore gating possibile. Queste percentuali possono variare, specialmente se si usano molti tipi di protozoi, quindi è importante sempre avere un negativcontrollo e che può essere utilizzato come popolazione di riferimento per il resto dei campioni. - Avviare il gating cliccando campione acquisire.
- Registrare il numero di eventi non meno di 10.000 eventi.
- Localizzare la popolazione ameba di interesse utilizzando la freccia. Questo è come definire le porte.
- Dopo gating, lasciare il posto HTS o individuare la piastra facendo clic su 'Home', quindi eseguire l'intera piastra automaticamente. Eseguire l'acquisizione e l'analisi dei dati in base ai parametri di dimensione e struttura (rispettivamente FSC (forward scatter) e SSC (scatter lato)).
Nota: Rilevare la perdita della popolazione amebe-gated segnala la presenza di un agente patogeno responsabile amebe lisi. Protozoi lisi associata all'infezione da virus viene rilevato con una soglia arbitrariamente creazione del 50% lisi della popolazione amebe gated dall'analizzatore e rispetto alla stessa popolazione non infetta utilizzato come controllo negativo affidabile.
- La colorazione preliminare per rivelare la presenza di virus giganti
- Al termine del rilevamento lisi mediante citometria di flusso, pipetta la co-culture lisato di sospendere i restanti amebe. Poi citocentrifuga direttamente 50 microlitri della sospensione a 800 xg per 10 min.
- Dopo la centrifugazione, fissare i vetrini con una soluzione di metanolo puro. Colorare le diapositive utilizzando una rapida colorazione commerciale di Eosina / blu Azur e colorazione DAPI ed osservare al microscopio ottico a 1,000X ingrandimento al fine di verificare la presenza di fabbriche di virus.
- Per una rapida colorazione, immergersi le diapositive nella prima soluzione eosina (4 sec ripetuto tre volte) e poi passare direttamente ad immergersi diapositive nella soluzione secondo fissaggio contenente blu Azur per 6 secondi, e, infine, lavare le diapositive per 45 secondi con una soluzione tampone fosfato pH 7.2. Lasciare le diapositive asciugare a temperatura ambiente, quindi procedere al observatisopra.
- Per colorazione DAPI, deposito di 15 ml di soluzione di riserva commerciale DAPI sul vetrino asciutta fisso. Proteggere dalla luce quindi procedere all'osservazione.
- Microscopio elettronico
- Dopo la prima identificazione sugli scivoli, valutare la presenza del virus gigante attraverso l'osservazione al microscopio elettronico delle culture surnatante.
- Deposito 5 ml di campione positivo sulla griglia bagliore-scarica. Attendere circa 20 min a temperatura ambiente.
- Essiccare la griglia con attenzione e deposito su una piccola goccia di 1% molibdato di ammonio per 10 sec. Lasciare la griglia asciugare per 5 min.
- Procedere alla microscopia elettronica a 200 keV.
- Posizionare la griglia sul supporto; introdurre il supporto nel microscopio. Controllare la panoramica del vuoto facendo clic sull'icona corrispondente. Chiudere le valvole e cominciano osservazione in un formato di punto 5, e l'ingrandimento di x 25.000.
- Misurare il virus gigante utilizzando ImageJ o direttaly sul microscopio utilizzando lo strumento di misura del microscopio situato nella schermata di acquisizione.
Nota: classificare il campione nel gruppo Faustovirus con una dimensione capside di circa 200 nm.
- Biologia molecolare
Nota: Seguendo questa identificazione, test di biologia molecolare sono stati cruciali per la conferma per distinguere Faustovirus da Marseillevirus, che ha la stessa dimensione del capside e aspetto al microscopio elettronico, sebbene non hanno la stessa specificità host. Il Marseillevirus non può crescere su Vermamoeba il Faustovirus è specifico per Vermamoeba e tutti i tentativi di crescere su altri ameba, come Acanthamoeba non sono riusciti fino ad oggi. La progettazione e l'applicazione di specifici sistemi di primer / sonda elencati nelle opere di Reteno et al. consentito una classificazione preliminare più precisa dei virus appena isolate tramite amplificazione e sequenziamento dei geni virali.- ExDNA tratto dai campioni di coltura positivi utilizzando un sistema di estrazione automatica secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire Real-time PCR utilizzando un termociclatore come descritto in Reteno et al. 19
- Sequenza utilizzando gli stessi primer che sono stati utilizzati per l'amplificazione. Utilizzare i primer di targeting DNA-RNA polimerasi diretto subunità 1 gene: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(in avanti) e Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (reverse) con la sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.
4. Virus produzione, purificazione e Genome Sequencing
- Sottocultura della cultura amebe virus unico per end-point di diluizione clonazione.
- Per la produzione: preparare 20 flaconi contenenti 30 ml di PYG, 10 ml di vermiformis Vermamoeba e 5 ml di virus isolato già trasferito da pozzi di flaconcini.
- Incubare a 30 ° C fino a completalisi dell'ameba. Osservare tutti i giorni con un microscopio ottico invertito fino a quando tutte le amebe vengono lisati.
- Dopo la completa lisi, piscina tutti i palloni in un destinatario. Filtrare con un filtro da 0,45 micron per eliminare i residui.
- Inizia la purificazione da ultracentrifugazione a 89.800 xg per 75 min. Assicurarsi di calibrare il peso dei tubi prima di iniziare la centrifugazione.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante da ciascuna provetta tramite aspirazione e risospendere il pellet in PAS con lo stesso volume usato per la calibrazione, prima di ripetere centrifugazione.
- Come sopra, rimuovere il surnatante e risospendere tutti i pellet in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS).
- Purificare il virus che viene prodotto utilizzando il 25% di saccarosio (27,5 g di saccarosio in 100 ml di PBS, filtrata su un filtro di 0,22 micron).
- Utilizzare 8 ml di saccarosio e 2 ml di sospensione virale. Centrifugare a 89.800 g per 1 ora e 15 min. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS. Conservare a -80 ° C. </li>
Representative Results
Il sistema studiato in questo manoscritto convalidato la sua prova di concetto, isolando due nuovi Faustoviruses. Dei 70 campioni esaminati, sono stati rilevati due episodi di lisi, contrariamente ai nostri controlli negativi affidabili. Il controllo negativo per lisi conteneva una popolazione un'ameba 86%. Al contrario, i campioni positivi (ST1 per Saint Pierre de Meyzoargues), e (LC9 per il campione La Ciotat 9) hanno mostrato un drammatico calo delle amebe gated; più del 60% di a…
Discussion
La possibilità che Faustovirus potrebbe essere il primo membro di una nuova famiglia Megavirales vicino al ASFV è stato suggerito da Reteno et al., 19 ma alcune differenze possono ancora essere distinto. Appare chiaro se Faustovirus dovrebbe far parte della famiglia Asfarviridae o se debba invece formare una nuova famiglia virale putativo. Questo problema richiede ulteriori indagini, in particolare, una caratterizzazione più completa della sua morfologia, gamma degli ospiti, ciclo di replicazione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
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