Articolo metodologico

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

DOI:

10.3791/54106

⸱

23 luglio 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare liposomi cationici/anionici con un peptide neuro-mirato come sistema di rilascio del SNC per consentire al siRNA di attraversare la BEE. L'ottimizzazione di un sistema di somministrazione per trattamenti, come il siRNA, consentirebbe più opzioni di trattamento per i prioni e altre malattie neurodegenerative.

Abstract

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Le malattie da prioni derivano dal ripiegamento errato della normale proteina prionica cellulare (PrPC) in un isomero resistente alla proteasi anormale chiamato PrPRes. L'emergere di malattie da prioni nelle popolazioni di animali selvatici e la loro crescente minaccia per la salute umana ha portato a un aumento degli sforzi per trovare un trattamento per queste malattie. Studi recenti hanno trovato numerosi composti anti-prioni che possono inibire l'isomero infettivo PrPRes o sottoregolare la normale proteina prionica cellulare. Tuttavia, la maggior parte di questi composti non attraversa la barriera ematoencefalica per inibire efficacemente la formazione di PrPRes nel tessuto cerebrale, non ha come bersaglio specifico la PrPC neuronale e sono spesso troppo tossici per essere utilizzati in soggetti animali o umani.

Abbiamo studiato se il siRNA somministrato per via intravascolare e mirato alla PrPC neuronale è un composto anti-prioni più sicuro ed efficace. Questo rapporto delinea un protocollo per produrre due veicoli di consegna liposomiale siRNA e per impacchettare e somministrare PrP siRNA alle cellule neuronali. I due veicoli di somministrazione liposomiale sono 1) la formulazione di liposomi siRNA complessi utilizzando liposomi cationici (LSPC) e 2) la formulazione di liposomi siRNA incapsulati utilizzando liposomi cationici o anionici (PALETS). Per gli LSPC, il siRNA caricato negativamente è legato elettrostaticamente al liposoma cationico. Al complesso viene aggiunto un peptide caricato positivamente (RVG-9r [glicoproteina del virus della rabbia]), che si rivolge specificamente ai complessi liposoma-siRNA-peptide (LSPC) attraverso la barriera ematoencefalica (BBB) ai neuroni che esprimono l'acetilcolina nel sistema nervoso centrale (SNC). Per i PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), i lipidi cationici e anionici sono stati reidratati dal siRNA PrP. Questa procedura provoca l'incapsulamento del siRNA all'interno dei liposomi cationici o anionici. Ancora una volta, il neuropeptide RVG-9r è stato legato ai liposomi per indirizzare i complessi siRNA/liposomi al SNC. Utilizzando queste formulazioni, abbiamo somministrato con successo il siRNA PrP ai neuroni che esprimono AchR e diminuito l'espressione di PrPC dei neuroni nel SNC.

Introduzione

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I prioni sono gravi malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale. Le malattie da prioni risultano dalla misfolding della normale proteina prionica cellulare, PrP C, con un isomero infettiva chiamata PrP Res. Queste malattie colpiscono una grande varietà di specie, tra cui encefalopatia spongiforme bovina nelle vacche, la scrapie degli ovini, malattia del dimagrimento cronico nei cervidi, e la malattia di Creutzfeldt-Jakob nell'uomo 1-3. I prioni causano neurodegenerazione che inizia con la perdita sinaptica, e progredisce a vacuolizzazione, gliosi, perdita neuronale, e depositi di placca. Alla fine, con la conseguente morte dell'animale / individuale 4. Per decenni, i ricercatori hanno studiato i composti destinati a rallentare o arrestare la progressione della malattia da prioni. Tuttavia, i ricercatori non hanno trovato né una terapia di successo o un efficace veicolo di consegna sistemica.

Endogena espressione PrP C è necessario per lo sviluppo di malattie da prioni 5 . Pertanto, ridurre o eliminare espressione PrP C può provocare un ritardo o miglioramento della malattia. Diversi gruppi creati topi transgenici con ridotti livelli di PrP C o lentivectors iniettati esprimono shRNA direttamente nel tessuto cerebrale murino per studiare il ruolo dei livelli di espressione PrP C nelle malattie da prioni. Questi ricercatori hanno scoperto riducendo la quantità di neuroni PrP C provocato arrestare la progressiva neuropatologia delle malattie da prioni e esteso la vita degli animali 6-9. Ci hanno riferito che i risultati del trattamento PrP C siRNA a distanza di PrP Res nelle cellule di topo neuroblastoma 10. Questi studi suggeriscono che l'uso di terapie per diminuire i livelli di espressione PrP C, come small interfering RNA (siRNA), che scinde mRNA, può sufficientemente ritardare la progressione delle malattie da prioni. Tuttavia, la maggior parte delle terapie indagati per malattie da prioni sono stati consegnati in un modo che non sarebbe praticoin un ambiente clinico. Pertanto, una terapia siRNA bisogno di un sistema di erogazione sistemica, che viene trasportato via endovenosa e mirata al SNC.

Gli investigatori hanno studiato l'uso di liposomi come veicoli di consegna per i prodotti di terapia genica. lipidi cationici e anionici sono entrambi utilizzati nella formazione di liposomi. lipidi cationici sono più ampiamente usati di lipidi anionici perché la differenza di carica tra i lipidi cationici e il DNA / RNA permette di confezionamento efficiente. Un altro vantaggio di lipidi cationici è che attraversano la membrana cellulare più facilmente di altri lipidi 11-14. Tuttavia, lipidi cationici sono più immunogenico di lipidi anionici 13,14. Pertanto, i ricercatori hanno cominciato a spostarsi da utilizzare cationico per anionica lipidi nei liposomi. Prodotti per la terapia genica possono essere confezionati in modo efficiente nei liposomi anionici utilizzando la carica positiva solfato di protamina peptide, che condensa le molecole di DNA / RNA 15-19. Dal momento che Lipi anionicods sono meno immunizzanti lipidi cationici che possono avere un aumento dei tempi di circolazione, e possono essere più tollerati in modelli animali 13,14. I liposomi sono mirati a specifici tessuti utilizzando il targeting peptidi che sono attaccati ai liposomi. Il neuropeptide RVG-9r, che si lega ai recettori nicotinici, è stato utilizzato per indirizzare siRNA e liposomi al SNC 17-20.

Questo rapporto delinea un protocollo per la produzione di tre veicoli di consegna siRNA, e di confezionare e consegnare il siRNA per le cellule neuronali (Figura 1). complessi liposoma-siRNA-peptide (LSPCs) sono costituiti da liposomi con siRNA e RVG-9r di targeting peptide elettrostaticamente attaccati alla superficie esterna del liposoma. Peptide indirizzata incapsulata in liposomi terapeutici siRNA (PALETS) sono composte da siRNA e protamina incapsulato all'interno della liposomi, con RVG-9r covalentemente legato a gruppi di lipidi PEG. Utilizzando i metodi indicati per generare LSPCs e PALETS, PrP C siRNA riduce espressione PrP C fino al 90% in cellule neuronali, che detiene tremenda promessa per curare o sostanzialmente ritardare l'insorgenza della patologia malattia da prioni.

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Protocollo

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Tutti i topi sono stati allevati e mantenuti in laboratorio le risorse animali, accreditati dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International, secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali presso la Colorado State University.

1. Preparazione di LSPCs

  1. Utilizzare un 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano): rapporto di colesterolo per LSPCs. Per una preparazione nmole liposoma 4, mescolare 2 nmoli di DOTAP e 2 nmoli di colesterolo in 10 ml di una miscela 1: 1 di cloroformio: metanolo soluzione in un pallone.
  2. Far evaporare 9 ml di cloroformio: soluzione di metanolo con N 2 gas in una cappa aspirante. Evaporare ultimi 1 ml di solvente in una cappa aspirante notte senza gas. Osservare un sottile film lipidico sul fondo del pallone.
  3. Calore 10 ml di una soluzione di saccarosio al 10% a 55 ° C.
  4. Versare la soluzione di saccarosio al 10% riscaldato sul sottile film lipidico lentamente, vale a dire 1 ml / min, mentre la gente roteare il pallone. Mantenere il saccarosio 10% e pallone con lipidi a 55 ° C in modo che le molecole lipidiche rimangono nella fase gel-liquido. risultati di reidratazione in vescicole (MLV) formazione multilamellare.
  5. Consentire lipidi reidratare a 55 ° C per almeno un ora prima dimensionamento dei liposomi.
  6. Assemblare un estrusore secondo le istruzioni del produttore con 1,0 micron filtri o utilizzare filtri per siringa 1,0 micron per il dimensionamento.
  7. Aggiungere 1 ml della sospensione di liposomi riscaldato a una delle siringhe sul estrusore, e passare la sospensione tra le due siringhe 11 volte. Assicurarsi che la sospensione è nella siringa opposta rispetto alla siringa di partenza dopo le 11 passate.
  8. Dimensione liposomi nuovo attraverso 0,45 micron poi 0,2 micron filtri per generare grandi vescicole unilamellari (luvs). Mantenere la sospensione di liposomi riscaldato per facilitare dimensionamento.
  9. Incubare 20 microlitri della sospensione di liposomi 4 nmole (200 mM) con 200 ml di a 20 pM (4totale nmole) soluzione di riserva siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente.
  10. Incubare 80 microlitri di una 500 micron (40 nmole totale) stock soluzione RVG-9r con la soluzione / liposomi siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente. LSPCs devono essere utilizzati al più presto possibile, ma possono essere utilizzati fino a diverse ore dopo la preparazione. LSPCs Conservare a 4 ° C per diverse ore dopo la preparazione.

2. Preparazione di PALETS

  1. Utilizzare un 55: rapporto di 5 molare di entrambi DSPE (1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterolo: DSPE-PEG o DOTAP: colesterolo: DSPE-PEG per PALETS. Per una preparazione nmole liposoma 4, mescolare 2,2 nmoli di entrambi DSPE o DOTAP, 1,6 nmoli di colesterolo, e 0,2 nmoli di DSPE-PEG in 10 ml di 2: 1 di cloroformio: metanolo soluzione in un pallone.
  2. Preparare sospensione di liposomi esattamente come descritto al punto 1.1 e 1.2 di cui sopra. Reidratare liposomi DSPE in 10 ml di PBS 1x riscaldata a 75 ° C, aggiungendo 1 ml / min. Consentire lipidi per reidratare a 75 ° C peralmeno 1 ora prima del dimensionamento.
  3. Dimensioni della sospensione di liposomi esattamente come descritto al punto 1,6-1,8.
  4. Dispensare 20 l di ciascuno dei 4 nmole (200 micron) sospensioni di liposomi in singole aliquote usare dopo DOTAP e DSPE liposomi sono stati di dimensioni, e liofilizzare per 30 minuti utilizzando un essiccatore da banco congelamento (Figura 2).
  5. Incubare 200 ml di a 20 micron (4 in totale nmole) stock soluzione siRNA con 1,4 ml di una soluzione 26,6 micron di solfato di protamina per 10 minuti a temperatura ambiente per siRNA che deve essere incapsulata nei liposomi DSPE pallets.
  6. Reidratare il liposomi DOTAP Palets con 200 ml di una soluzione madre nmole 4 di siRNA o reidratare liposomi DSPE pallets con 201,4 ml di soluzione / protamina siRNA. Incubare liposomi soluzione / siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente.
  7. Aggiungere 10 ml di una soluzione 60 mM-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) al / soluzione siRNA liposomi sia per DOTAP e DSPE PALETS.
  8. Aggiungere 10 ml di una soluzione 150 mM N-hydroxysulfosuccinimide (solfo-NHS) alla / soluzione siRNA liposomi sia per DOTAP e DSPE PALETS.
  9. Incubare la EDC e solfo-NHS con la sospensione / liposomi siRNA per 2 ore a temperatura ambiente.
  10. Incubare 80 microlitri di una 500 micron (40 nmole totale) stock soluzione RVG-9r con il siRNA / liposomi reticolazione soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: L'EDC / solfo-NHS permette al RVG-9r al legame covalente ai lipidi PEG. Utilizzare PALETS all'interno di diverse ore dopo la preparazione. PALETS Conservare a 4 ° C per diverse ore dopo la preparazione.
  11. Per determinare siRNA efficienza di incapsulamento di PALETS:
    1. Misurare la concentrazione di siRNA prima e dopo l'aggiunta di protamina e liposomi utilizzando uno spettrofotometro regolato a 260 nm.
    2. Filtrare il non incapsulata siRNA dal liposomi / sospensione siRNA incapsulato con 50 kDa filtri centrifughe. Centrifugare a 1000 xg per 20 min.
    3. Misurare la concentrazione disiRNA non incapsulata nel filtrato e la concentrazione dei incapsulato siRNA nel retentato utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm.

3. L'iniezione di topi con LSPCs o PALETS

  1. Esporre i topi per 5-10 minuti ad una lampada di calore per dilatare vascolare.
  2. Anestetizzare mouse con un isofluorano / ossigeno 2-3% fluire 5-10 minuti prima dell'iniezione, e durante l'iniezione. Confermare anestesia quando animale non è più ambulatoriale e respirazioni hanno rallentato facendo un pizzico dito del piede. Posizionare il mouse sulla sua schiena o di lato per accedere alla vena della coda. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi del topo per evitare l'essiccazione mentre sotto anestesia.
  3. Pulire / spruzzare la coda con il 70% EtOH e iniettare 300 ml di LSPCs o PALETS sulla vena della coda del mouse utilizzando una siringa da 26 G di insulina. Inizia iniettando distalmente nella vena della coda e spostare prossimale se la vena collassa o rotture.
  4. Posizionare il mouse in una gabbia pulita fino mantiene decubito sternale. Non posizionare moutilizzare con altri compagni di gabbia fino a quando non ha pienamente recuperato. I topi dovrebbero recuperare in 5 a 15 min. Essi possono essere collocati su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea se il recupero richiede più tempo. I topi devono essere monitorati attentamente per salvaguardare contro il surriscaldamento.
  5. Monitorare le diverse ore dopo l'iniezione di animali al fine di garantire l'anestesia svanisce, e non ci sono effetti negativi del trattamento. Lasciare le LSPCs o PALETS di circolare per almeno 24 ore.

4. Analisi dell'espressione proteica tramite citometria a flusso

  1. Euthanize topi con una portata di 20% di CO 2 per 15 min.
  2. Sezionare la metà un emisfero del cervello, tagliando via la pelle e il cranio del mouse con le forbici. Peel via metà un emisfero cerebrale distanza dal cranio con pinze o la fine di un paio di forbici.
  3. Press mezzo emisfero del cervello di ogni mouse attraverso un colino 40 micron cella mesh con 2,5 ml di tampone FACS (1x, PBS, 1% di siero fetale bovino, 10 mM EDTA) in una capsula di Petri con lo stantuffo di una siringa.
  4. Risciacquare il filtro cellulare e piastra di Petri con un ulteriore 2,5 ml di tampone FACS. Mettere la sospensione singola cellula in una provetta conica da 15 ml su ghiaccio.
  5. Pipettare 100 ml di sospensione di cellule singole 5 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare per 5 min a 350 x g. Eliminare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone FACS. Spin a 350 g per 5 min. Ripetere con un altro 1 ml di tampone FACS. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
  6. Incubare le cellule in 100 microlitri di diluizione 1: 100 di 0,5 mg / ml di ratto blocco anti-topo Fc in tampone FACS per 30-60 min in ghiaccio. Pellet e lavare le cellule come al punto 4.5. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
  7. Incubare le cellule in 100 microlitri di una / anticorpo 20 mg ml fluorescente contro topo PrP C in 7% siero di topo in tampone FACS in ghiaccio per 30-60 min. Pellet e lavare le cellule come al punto 4.5. Mantenere la sospensione cellularesul ghiaccio.
  8. Pellet e risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi RBC (1x PBS, 155 mm NH 4 Cl, 12 mm NaHCO 3, 0.1 mM EDTA) per 1 min. Pellet come al punto 4.5 e risospendere le cellule in 1 ml di tampone FACS. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
  9. Analizzare l'espressione PrP C utilizzando un citofluorimetro come descritto in precedenza 10. Porta di vivere le cellule dalla popolazione cellulare totale. Porta PrP C + cellule dalla popolazione di cellule in diretta per determinare MFI (intensità di fluorescenza mediana).

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Risultati

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Per aumentare l'efficienza di siRNA incapsulamento all'interno PALETS anionici, il siRNA è stato mescolato con protamina. Per determinare la migliore concentrazione protamina per la siRNA, il siRNA è stato mescolato con diverse concentrazioni di protamina, da 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). C'era una efficienza di incapsulamento siRNA 60-65% in liposomi anionici senza l'uso di protamina. I campioni con protamina: siRNA rapporti molari da 1: 1 a 1,5: 1 (133-266 nM) avevano 80-90...

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Discussione

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Questo rapporto descrive un protocollo per creare due sistemi di somministrazione mirata che trasporta in modo efficiente siRNA al sistema nervoso centrale. Precedenti metodi di somministrazione siRNA al SNC inclusi l'iniezione di vettori siRNA / shRNA direttamente nel cervello, iniezione endovenosa di mirati siRNA, o iniezione endovenosa di complessi liposomi-siRNA non mirati. L'iniezione di siRNA / shRNA vettori nel sistema nervoso centrale non provoca una diminuzione dei livelli di espressione della proteina ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: il programma di formazione per la ricerca traslazionale sulle malattie infettive della CSU (ID:TRTP) e il programma di sovvenzioni per la ricerca NIH (R01 NS075214-01A1). Ringraziamo il laboratorio Telling per l'utilizzo del loro anticorpo monoclonale PRC5. Vorremmo anche ringraziare il laboratorio Dow per i liposomi DOTAP e per aver condiviso la loro esperienza nella generazione di liposomi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lipidi DOTAP AvantiLipidi890890
ColesteroloAvanti Lipidi700000
DSPEAvanti Lipidi850715
DSPE-PEGAvanti Lipidi880125
CloroformioFisher ScientificAC268320010
MetanoloEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
SaccarosioFisher ScientificS5-500
EstrusoreAvanti Lipidi610023
1,0, 0,4 e 0,2 μ m filtriAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
Protamina solfatoFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquotato per monouso
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquotato per monouso
40 μ m Filtro cellulareFisher Scientific08-771-1
Blocco Fc CD16/CD32 anti-topo per rattoBD Pharmigen553141
Anticorpo anti-PrP (PRC5)Proprietario - PRC

Riferimenti

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