Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Morte programmata delle cellule, come apoptosi, svolge un ruolo essenziale nello sviluppo embrionale e normale omeostasi eliminando le cellule indesiderate, ferite o pericolose in organismi multicellulari^1,2,3. La perdita di equilibrio tra sopravvivenza e morte cellulare può portare a conseguenze fatali come cancro, insufficienza cardiaca, dell'autoimmunità e degenerazione^4,5,6,7,8. Attivazione del boia caspases tradizionalmente è stato considerato come il "punto di non ritorno" in apoptosi^9,10,11, come si innesca rapida e massiccia demolizione cellulare^{12, 13,14,15,16}. Impegnativo questo dogma generale, abbiamo dimostrato che cellule primarie morente coltivate e le cellule tumorali possono recuperare non solo dopo l'attivazione delle caspasi, ma anche seguente cellula importante tra cui membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, tratti distintivi di morte frammentazione mitocondriale, rilascio di mitocondriale del citocromo c nel cytosol, nucleare e condensazione della cromatina, danno del DNA, frammentazione nucleare, l'esposizione di superficie delle cellule della fosfatidilserina (PS) e la formazione di corpi apoptotici ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21}. vi proponiamo quella anastasis è un fenomeno di recupero intrinseco delle cellule, come le cellule morte possono recuperare dopo la rimozione delle cellule morte stimoli^{17,18,19,20, 21}. abbiamo coniato il termine "Anastasis" (Αναστάσης)¹⁸, che significa "rising alla vita" in greco, a descrivere questo fenomeno di recupero cellulare inaspettato. La nostra osservazione di anastasis è ulteriormente supportata da recenti studi indipendenti che rivelano anche il recupero delle cellule dopo la fosfatidilserina esternalizzazione^22,23,24, limitata mitocondriale esterna di permeabilizzazione della membrana²⁵, attivazione di stirpe misto chinasi-come (MLKL) e cella restringimento²⁶.

Caratterizzare i meccanismi che regolano l'anastasis avrà implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche lo spostamento di paradigma. Anastasis potrebbe rappresentare un meccanismo di cytoprotective precedentemente sconosciuti per salvare o preservare importanti cellule postmitotic e tessuti che sono difficili da sostituire e possibilmente conto per l'inversione di insufficienza cardiaca ventricolare scaricando con ventricolare di sinistra assistere dispositivi (LVADs)^27,28, recupero di cellule fotorecettrici dopo esposizione transitoria di luce eccessiva^29,30,31, o la riparazione dei neuroni dopo la ferita di cervello³². Se è così promuovere anastasis potrebbe migliorare il recupero di cellule e tessuti. Al contrario, anastasis potrebbe essere una tattica di fuga inaspettata usata dalle cellule tumorali per sopravvivere terapia d'induzione di morte delle cellule, causando cancro ricorrenza^17,18. Di conseguenza, sopprimendo anastasis morendo, le cellule tumorali durante e dopo il trattamento del cancro potrebbe essere una strategia terapeutica novella per curare tumori impedendo loro ricaduta.

Durante il processo di anastasis, abbiamo trovato che alcune cellule recuperate acquisito alterazioni genetiche permanente e ha subito la trasformazione oncogena, probabilmente a causa di danni al DNA sostenute durante l'apoptosi^18,20,21 . Invertire il processo di morte delle cellule con DNA danneggiato potrebbe essere un meccanismo della tumorigenesi, potenzialmente sottostante l'osservazione che ripete la lesione del tessuto aumenta il rischio di cancro in una varietà di tessuti, come lesione cronica termica nell'esofago indotto tramite il consumo di bevande molto calde^33,34,35, danni al fegato a causa di alcolismo^36,37, evoluzione del tumore dopo genotossici cancro terapia^{38, 39,40}e lo sviluppo di nuovi cancri dai tessuti normali che si verificano durante gli intervalli tra i cicli di terapia anti-cancro^41,42,43,44 . Se true, targeting anastasis potrebbe prevenire o arrestare e progressione del tumore. Abbiamo trovato che indotta da inedia morente le cellule di germe subiscono anastasis in ri-nutriti Drosophila¹⁹.  In caso di anastasis in cellule di germe con danno del DNA, potrebbe essere conto per l'osservazione che il prolungato stress ambientale promuove lo sviluppo di malattie genetiche. Ad esempio, carestie e contribuire allo sviluppo di transgenerazionale ereditabili malattie come il diabete e malattie cardiache coronariche⁴⁵. Di conseguenza, anastasis comprensione potrebbe portare a strategie per la prevenzione di malattie ereditarie causate da questo meccanismo potenziale di sviluppo.

Per sfruttare la scoperta dell'anastasis e dirigerla per sviluppare terapie innovative, è essenziale per studiare la causa e conseguenza di anastasis in animali vivi. Tuttavia, è tecnicamente difficile da identificare e tracciare anastatica cellule in vivo, perché le cellule che ha recuperato dal processo di morte cellulare appaiono morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali, e non c'è nessun biomarcatore dell'anastasis identificato ancora^17,18,21. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato un nuova in vivo caspase biosensore indicato "CaspaseTracker"¹⁹, per identificare e tenere traccia di cellule che sopravvivono apoptosi dopo^19,l'attivazione di caspase⁴⁶, il segno distintivo di apoptosi^10,14. Distinguendola dai biosensori di caspasi "tempo reale" come SCAT^12,47, Apoliner⁴⁸, CA-GFP⁴⁹, ApoAlert^18,50, C3AIs⁵¹ e iCasper⁵² che rileva l'attività della caspasi in corso, il biosensore CaspaseTracker inoltre offre la possibilità per marcare permanentemente le cellule che attività di caspase espressa anche transitoriamente. Pertanto, il biosensore CaspaseTracker consente la registrazione a lungo termine dell'anastasis dopo inversione di caspase-mediata delle cellule morte processo in vivo.

1) preparazione del biosensore CaspaseTracker mosche

1. Anestetizzare mosche con CO₂e utilizzare un pennello per trasferire 7 a 10 caspase-sensibile Gal4 (DQVD)¹⁹ femmine vergini e 7 a 10 G-traccia⁵³ Gal4 reporter giovane maschi mosche (o viceversa) nella stessa fiala con alimento e pasta di lievito fresco.
   Nota: Croce di mosche Gal4 Caspase-sensibili (DQVD) e G-traccia produrrà CaspaseTracker mosche di progenie. Croce dellaCaspase - sensibili (DQVA)¹⁹ Gal4e mosche G-traccia fornirà controllo negativo Vola (vedi discussione). Pasta di lievito fresco serve come fonte di proteine per migliorare la produzione di uova, così che aumenta il numero di discendenti. Selezionare le femmine vergini e giovane maschio vola secondo loro fenotipi⁵⁴.
2. Incubare le mosche a 18 gradi Celsius (^oC) durante la croce per 3-7 giorni e quindi trasferire le mosche per un nuovo flacone per impostare una nuova croce a 18 ° C. Continuare a incubare il flaconcino originale a 18 ° C fino a progenie Vola eclose.
   Nota: Trasferire le mosche del padre a new Fiale per evitare sovraffollamento della progenie al flacone originale. Mosche di genitore in grado di produrre progenie con cibo fresco e pasta di lievito i primi 2-3 interruttori, e quindi la produttività significativamente diminuirà con il tempo. Alzando le mosche 18 ° C può ridurre il segnale aspecifiche di biosensore CaspaseTracker (vedi discussione).
3. Selezionare progenie Vola con fenotipi corretta⁵⁴ per i seguenti esperimenti.
   Nota: I transgeni di Gal4 caspase-sensibile e G-traccia qui si trova il secondo cromosoma, equilibrato con bilanciatore CyO. Selezionare la progenie di ala non-ricci (senza CyO), che ha entrambi transgeni di caspase-sensibili Gal4 e G-traccia.

2) applicazione di induzione di morte transitoria delle cellule CaspaseTracker biosensore mosche

1. Trasferire 10 a 20 appena obtecta donna Vola in un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco per 1 giorno a 18 ° C per consentire la produzione di uova camera da oogenesi.
   Nota: Mantenendo la femmina con mosche maschi potrebbe migliorare la produzione di uova da camera.
2. Per indurre l'uovo di Colombo all'apoptosi da colpo di freddo, trasferimento la femmina Vola al nuovo flacone vuoto, che viene poi collocato a-7 ° C per 1 h.
   Nota: Cold shock danneggia le cellule inducendo la rottura della membrana plasmatica^55,56.
3. Per indurre l'uovo chambers all'apoptosi da inedia di proteina, trasferire le mosche femminile ad un nuovo flacone con cibo di agar di saccarosio e 1% 8% a 18 ° C per 3 giorni.
   Nota: Fame di proteine (senza proteine alimentari) può innescare uovo di Colombo per subire apoptosi^57,58,59 e autofagia^60,61. Interruttore Vola in un nuovo flacone con 8% di saccarosio e 1% di cibo agar ogni giorno per mantenere condizioni ottimali del saccarosio volare.
4. Trasferire le mosche stressate per 3 giorni a 18 ° C per consentire loro di recuperare un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco. Sezionare la fame e le mosche affamato-recuperati per ottenere l'uovo di Colombo alle ovaie come descritto⁶².
   Nota: Per sezionare Drosophila per ottenere le ovaie, anestetizzare mosche con CO₂e utilizzare 2 paia di pinze per rimuovere la testa di Mosca e utilizzare le pinze per estrarre la base dell'addome per rimuovere le ovaie delle mosche.

3) fissazione e colorazione di Uovo sezionato alloggiamenti per l'Imaging

1. Trasferire gli alloggiamenti di Uovo sezionato insieme con intorno salino di 0,5 mL tamponato fosfato (PBS) per provette da centrifuga 1 mL. Lasciare le uova a stabilirsi.
   Nota: Ricoprire le punte di pipetta di plastica con 1% albumina di siero bovino (BSA) dissolto in acqua o in PBS per impedire gli alloggiamenti di uovo a bastone sulla superficie di plastica delle punte. Eseguire le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching di proteina fluorescente rossa (RFP, noto anche come DsRed) e la proteina fluorescente verde (GFP) nelle camere di uovo.
2. Rimuovere il PBS pipettando e quindi applicare paraformaldeide 4% 0,5 mL in PBS per fissare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente al buio per 20-30 min.
   Nota: Applicare la rotazione delicata in questa e le seguenti fasi di incubazione.
3. Rimuovere il paraformaldeide pipettando e poi lavato la camera con 0,5 mL PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) per 3 volte.
   Nota: Fissazione prolungata potrebbe ridurre i segnali RFP e GFP.
4. Incubare le camere di uovo con PBST per 1 o 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C con delicata rotazione per permeabilize gli alloggiamenti di uovo.
   Nota: PBST può anche evitare uovo alloggiamenti per attaccare la superficie di plastica rivestita di non-BSA.
5. Rimuovere il PBST pipettando e quindi applicare 0,5 mL di 10 μg/mL di colorante Hoechst nucleare in PBST agli alloggiamenti di uovo per 1 o 2 h a temperatura ambiente a macchiare per nucleo.
   Nota 1: Evitare l'incubazione prolungata con colorante nucleare come questo aumenterà il segnale aspecifico.
   Nota2: Approccio alternativo a macchiare il nucleo senza Hoechst consiste nell'aggiungere 200 agente di montaggio anti-candeggio μL con DAPI (Vedi materiali) ed incubare overnight⁶³, prima di montare i tessuti il coprioggetto di vetro come descritto al protocollo 3.8.
   Nota3: eseguire la colorazione e le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching.
6. Rimuovere il colorante nucleare pipettando e quindi applicare 0,5 mL PBST per lavare gli alloggiamenti di uovo nelle provette da centrifuga 1 mL per 3 volte, con incubazione di 10-20 min con delicata rotazione tra ogni fase di lavaggio.
7. Rimuovere tutti i PBST con pipetta bene e quindi applicare 200 agente di montaggio anti-candeggio μL (Vedi materiali) per Incubare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente per 3 ore o una notte a 4 ° C fino a quando gli alloggiamenti di uovo affondano sul fondo del tubo.
   Nota: i tessuti che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio affondano sul fondo del tubo.
8. Montare gli alloggiamenti di uovo tinto trasferendoli con 200 μL anti-sbianca fissaggio agente su una lastra di vetro pre-pulito per l'imaging di pipettaggio, coprire gli alloggiamenti di uovo con un vetrino coprioggetto 20x20 mm vetro pre-pulito e sigillare il coprioggetto sul vetrino mettendo smalto al bordo del vetrino coprioggetti.
   Nota 1: Pre-pulire il vetrino e il coprioggetto con acqua o 70% di etanolo.
   Nota2: Applicare vaselina tra il vetrino e il coprioggetto per evitare di distruggere gli alloggiamenti di uovo di compressione.
9. Gli alloggiamenti di uovo usando la fluorescenza o microscopio confocale, utilizzando un 20x, NA 0,8 di immagine obiettivo piano-apocromatico, con eccitazione luce lunghezza d'onda 405 nm per la macchiatura nucleare (rilevare emissioni ~ 461 nm), 561 nm per RFP (attività di caspase in corso o recente) segnale ( rilevare l'emissione ~ 590 nm) e 488 nm per segnale di GFP (passato l'attività della caspasi) (rilevare emissioni ~ 518nm).
   Nota: Vedi i nostri protocolli pubblicati per microscopia^20,64.

Mentre la microscopia time-lapse cellula viva è un metodo affidabile per tratto anastasis in cellule coltivate20, è difficile da identificare le celle che sono stati sottoposti a anastasis in animali, perché le cellule recuperate appaiono morfologicamente indistinguibili da cellule sane normali che non hanno tentato la morte delle cellule. Ad esempio, le cellule umane del cancro cervicale HeLa visualizzare caratteristiche morfologiche di apoptosi1,2,14, quali il restringimento delle cellule, condensazione nucleare e membrana plasmatica blebbing in risposta alla morte delle cellule stimolo di 1 µm staurosporine17 (Figura 1A, 1B figura i-ii). Dopo aver rimosso lo stimolo di morte delle cellule e la incubazione in terreno fresco, le cellule morenti invertire il processo di morte cellulare da anastasis17,18, come indicato dal recupero morfologico (Figura 1B iii-iv), seguita da proliferazione (Figura 1B v-vi). Nostri studi precedenti hanno utilizzato anche i biosensori caspasi "tempo reale", ad esempio ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) per dimostrare l'inversione dell'apoptosi dopo l'attivazione di caspase18,20. Questo biosensore si localizza nel citosol in cellule sane (Figura 1, 1 D io). Al momento dell'attivazione di caspasi innescato l'etanolo di 3,7% di cellule morte stimolo, questo biosensore YFP-basato è scisso dalla caspasi e trasloca al nucleo, dove si accumula e la fluorescenza nucleare risultante del suo tag YFP identifica le cellule con in corso attività della caspasi (Figura 1 C, 1 D ii-iii). Le cellule morenti anche visualizzare caratteristiche morfologiche dell'apoptosi durante etanolo-induzione1,14,18,20, come la frammentazione dei mitocondri tubolari, nucleari condensazione, restringimento delle cellule e della membrana plasmatica blebbing (Figura 1 : ii-iii). È interessante notare che, dopo la rimozione dello stimolo delle cellule morte, le stesse cellule possono recuperare e riconquistare la morfologia normale (Figura 1 iv-viii). In particolare, la fluorescenza nucleare di ApoAlert (fenduti biosensore) è andata entro 1 ora nelle cellule recuperate (Figura 1 iv-viii), possibilmente a causa di simili processi che eliminano i componenti danneggiati in anastatica cellule18 , quali caspase-3 fenduto, PARP e ICAD generati durante l'apoptosi. Pertanto, una nuova strategia è necessaria per il rilevamento di anastasis sopra un lungo lasso di tempo, soprattutto in vivo.

Per tenere traccia il destino delle cellule anastatica, abbiamo sviluppato il sistema di biosensore CaspaseTracker dei mammiferi, che etichette permanentemente le cellule dopo essere spaccati di attività di caspase boia. Questo biosensore è composto di una rtTA caspase-sensibili (inversa transactivator tetraciclina-controllato) e un reporter Cre-LoxP-basato per rtTA attività (Figura 2A-B). Nelle cellule sane senza attività di caspase, il transactivator rtTA65 è legata alla membrana plasmatica anchor (Lyn11)66,67, segnale di esclusione di nucleo (NES) della chinasi della chinasi della mappa (MAPKK)68, e l'estrogeno recettore variante (ERT2)69 attraverso caspase-spaccabili linker di70 (DEVD) derivato da PARP (Figura 2A, 2B). Come rtTA tethered non traslocano dal cytosol al nucleo, essa non può attivare il reporter rtTA. Tuttavia, al momento dell'attivazione in risposta ad uno stimolo di morte delle cellule, caspasi fendono il linker DEVD, liberando la rtTA per traslocano nel nucleo (Figura 2B). Una volta nel nucleo, la rtTA si lega all'elemento di risposta di tet (TRE) e trigger espressione transitoria di Cre ricombinasi, che conduce a un evento di ricombinazione irreversibili che rimuove la cassetta del codone di stop tra il promotore CAG e le sequenze codificanti per proteina fluorescente rossa (DsRed). In questo modo permanente espressione di DsRed (Figura 2B), che serve come il marcatore fluorescente permanente di quelle cellule che può rimanere vivo dopo che essi hanno sperimentato l'attività della caspasi, come pure la loro progenie (Figura 2).

Per testare il biosensore CaspaseTracker dei mammiferi, abbiamo introdotto in cellule HeLa di trasfezione transiente, trattato le cellule con uno stimolo di morte delle cellule (1 µm staurosporine) e monitorati recupero delle cellule mediante microscopia confocale a time-lapse cellule vive, come abbiamo descritto20. Doxiciclina (concentrazione finale di 1 µ g/mL), che è essenziale per consentire rtTA attività65,71, è stato aggiunto al medium della coltura cellulare per accendere il biosensore in tutto l'esperimento. In risposta allo stimolo di morte delle cellule, le cellule trattate visualizzare tratti distintivi dell'apoptosi, tra cui il restringimento delle cellule e la membrana plasmatica blebbing come previsto (Figura 2D i-iii). Dopo aver rimosso lo stimolo di morte delle cellule, risciacquo la cella strato una volta e terreno di coltura di nuovo aggiunta, anastasis può osservare nelle cellule morenti, come indicato dal loro ritorno a una morfologia normale (Figura 2D iv-vii). Diagnostico, recuperato solo cellule express il DsRed marcatore fluorescente durante e dopo l'anastasis (Figura 2D iv-vii), che li distingue da entrambe le cellule non recuperati (Figura 2D iv-vii) e le cellule di controllo non esposti allo stimolo di morte delle cellule (Figura 2E). Questo dimostra l'utilità del CaspaseTracker dei mammiferi come un romanzo nuovo strumento per l'identificazione e l'etichettatura permanentemente anastatica cellule riprendendo da attivazione di caspase e applicazione e fornisce un modo per monitorare e studiare il loro destino a più lungo termine.

Per rilevare e tenere traccia di anastasis in animali vivi, animali transgenici di biosensore CaspaseTracker sono necessari. Pertanto, abbiamo in primo luogo usato Drosophila melanogaster come un sistema di modello19, perché come è un importante organismo geneticamente trattabile per lo studio di sviluppo degli animali e malattie umane72,73,74 ,75. Modificato da biosensore CaspaseTracker dei mammiferi, il biosensore dual Drosophila può identificare e distinguere "recenti/on-going" dal "passato" attività di caspase. Questo biosensore dual è composto di un caspase-sensibile Gal419e il reporter di Gal4 G-traccia53 (Figura 3A). Nelle cellule con nessuna attività di caspase, il fattore di trascrizione Gal4 di lievito è legato a un dominio di ancoraggio (mCD8) di membrana plasmatica tramite un linker caspase-spaccabili (DQVD) derivato da DIAP1 (Figura 3B), avendo una mutazione di 21NN/GV22 per prevenire il degrado di Gal4 dalla regola N-fine su fenditura di caspase del linker afterAsp2076e una mutazione di D135R ad abolire la funzione inibitoria di caspase ZONESUN il dominio BIR177. Come tethered Gal4 non traslocano nel nucleo senza fenditura di caspase per rilasciarlo, il reporter di Gal4 G-traccia rimane inattivo nelle cellule avendo nessuna attività di caspase19. Al momento dell'attivazione di caspase, tuttavia, caspasi attivate fendono il linker DQVD, liberando Gal4 di traslocano nel nucleo per attivare il G-traccia reporter (Figura 3A)19. Gal4 si lega a specifici a Monte attivazione di sequenze (UAS) per innescare transitoria trascrizione ed espressione di RDP, che serve poi come reporter fluorescente di attività di caspase recenti o attuali fino al Gal4 (caspasi) attività si interrompe e quindi la proteina RFP è degradato. Gal4 innesca anche espressione della ricombinasi FLP dal transgene, portando a un evento di ricombinazione che rimuove la cassetta del codone di stop tra un promotore di ubiquitin (Ubi) e una sequenza di codici per nucleo-mirati GFP (nucGFP). In questo modo permanente espressione di nucGFP, che serve come il marcatore permanente di quelle cellule che hanno sperimentato l'attività di caspase e rimanere vivo.

Per testare il Drosophila CaspaseTracker biosensore per la rilevazione del apoptosis e anastasis in vivo, CaspaseTracker donna Vola sono stati sottoposti a stress fisiologico (Figura 3), come freddo shock19, che può in modo efficiente grilletto la morte delle cellule, tra cui apoptosi, come indicato dall'attivazione delle caspasi, condensazione nucleare e cella restringimento19,78e anche necrosi dovuto agghiacciante che causa perdita di integrità della membrana e perdita di citoplasmatica Indice55,56. Come previsto, CaspaseTracker non è stato attivato nell'uovo alloggiamenti di mosche di controllo dove non era morte legate allo stress cellulare indotto (Figura 3D). Al contrario, gli alloggiamenti di uovo di mosche sollecitati un giorno dopo cold shock hanno mostrato non solo restringimento delle cellule apoptotiche caratteristici e condensazione nucleare, ma anche RFP e GFP espressione, che indica la presenza di recente o in corso (RFP +) e passato (GFP +) caspase attività (Figura 3E). Tuttavia, a 3 giorni dopo il ritorno le mosche stressate a condizione di non-stress normale, GFP, ma nessun RFP, espressione è stata rilevata nelle camere di uovo recuperati (Figura 3F). Ciò indica che le camere a uovo che avevano espresso l'attività della caspasi segue lo sforzo erano in grado di superare il processo di morte cellulare e sopravvivere.

Per testare ulteriormente la reversibilità del processo di morte cellulare in uovo Colombo19, CaspaseTracker mosche femminili sono stati sollecitati da inedia proteina dopo essere alimentato 8% di saccarosio in 1% agar per 3 giorni. Gli studi precedenti hanno dimostrato che fame di proteina può innescare gli apoptosi caspase-mediati e autophagy in tessuti con somatiche e cellule germinali, tra cui uovo Colombo57,60,61. Come previsto, CaspaseTracker è stato attivato negli alloggiamenti di uovo dopo 3 giorni di inedia di proteina (Figura 3). Gli alloggiamenti di uovo morente ha esibito sia apoptotica morfologie ed espressione dei RFP e GFP biosensore marcatori, che indica in corso o recente (RFP +) e passato (GFP +) attività di caspase (Figura 3). Per dimostrare che CaspaseTracker può tenere traccia di cellule recuperate che precedentemente sperimentato l'attivazione delle caspasi dopo uno stimolo di morte, le mosche affamate sono state poi trasferite agli alimenti volare contenenti proteine normali. Come previsto, gli alloggiamenti di uovo recuperati di queste mosche ri-nutriti mancano il reporter di caspase transitoria RFP, che indica nessuna attività di caspase recente o in corso (Figura 3 H). Tuttavia, le camere a uovo di queste mosche dopo alleviare lo stress di restituirli al cibo normale visualizzazione il reporter di caspase GFP (Figura 3 H), che indica che le cellule in questi alloggiamenti di uovo avevano invertito il processo di morte cellulare iniziati in un punto dopo attivazione delle caspasi. Verifica che l'attività di biosensore CaspaseTracker è innescato da caspasi è stata ottenuta sostituendo la sequenza di clivaggio DQVD con la sequenza di DQVA, quali caspase è in grado di fendere e che aboliscono biosensore attività (Figura 3B, 3I ).

Dopo il CaspaseTracker di Drosophila ha recuperato dalla fame di proteina, abbiamo trovato che più tipi di cella nelle camere di uovo, come le cellule somatiche (follicolo) e cellule germinali (cellule di infermiera e ovociti), visualizzato solo GFP, ma non RFP (Figura 3J )19, che indica che queste cellule possono subire anastasis dopo l'attivazione delle caspasi. È interessante notare che, la GFP anche etichettati cellule a germarium (Figura 3J)19, che contiene cellule staminali, insieme a sue sezioni di uovo associato nella stessa catena di ovariole. Di conseguenza, questi alloggiamenti di uovo di GFP-positivi possono essere derivati dalle cellule staminali che hanno recuperato dal processo di morte cellulare dopo l'attivazione delle caspasi. D'importanza, la fame e ri-fed femmina vola deporre le uova fertili che possono produrre che esprimono GFP progenie mosche19, suggerendo che potenzialmente le cellule invertito processo di morte cellulare dopo l'attivazione delle caspasi può riguadagnare la funzione apparentemente normale. Gli studi futuri sono necessari determinare se mosche progenie che sopravvivono in conseguenza di anastasis presentano sequele permanenti.

Figura 1 . Recupero di HeLa cellule dopo induzione di morte cellulare.
(A) diagramma schematico dell'approccio per indurre la morte delle cellule e successivamente consentire morire cellule di recuperare dopo la rimozione di induttore di morte delle cellule.
(B) time-lapse cellule vive DIC microscopia delle cellule HeLa sane (mi), lo stesso gruppo di cellule dopo trattamento con staurosporine 1 µm (ii) e poi lavati e più ulteriormente incubate con terreno di coltura fresco per rimuovere staurosporine ( III-vi). Freccia bianca indica una cellula di divisione.
(C) rappresentazione schematica della proteina di fusione di caspase biosensore NES-DEVD-YFP-NLS e la localizzazione subcellulare di YFP durante l'induzione di morte cellulare e dopo anastasis.
Microscopia confocale di time-lapse cellule vive (D) di una cella di HeLa, che esprimono la proteina di fusione di biosensore NES-DEVD-YFP-NLS caspase prima (ho), durante l'esposizione al 3,7% di etanolo (ii - iii) e dopo rimozione di etanolo da terreno di coltura (iv - viii). Mostrato qui sono immagini del biosensore caspase solo (fluorescenza verde, riga superiore); unire immagini del nucleo Hoechst-macchiato (fluorescenza blu) e mitocondri (fluorescenza rossa) (riga centrale), e immagini nella riga centrale ulteriormente fuse con immagini DIC (riga inferiore). Frecce bianche nella riga superiore indicano nucleare YFP localizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Sistema di biosensore mammifero CaspaseTracker.
(A) schema di rtTA il caspase-sensibili.
(B) schema di sistema mammifero CaspaseTracker rtTA biosensore.
(C) diagramma di flusso di utilizzando il sistema di biosensore rtTA CaspaseTracker per rilevare anastasis. Triangolo rosso/giallo (applicare induttore di morte delle cellule) e i simboli verdi/blu (induttore di lavare fuori) sono come in Figura 1A.
(D) la microscopia confocale time-lapse di cellule vive di un cluster di cellule HeLa esprimendo mammiferi CaspaseTracker rtTA biosensore prima (io) e durante l'esposizione a 1 µm staurosporine (ii - iii) e dopo la rimozione staurosporine da terreno di coltura (iv - vii). Immagini unite dei segnali DIC e DsRed. Le frecce indicano la cella 1 (giallo) e delle cellule 2 (verde).
(E) microscopia confocale time-lapse tensione delle cellule delle cellule HeLa biosensore-esprimendo non trattate. Immagini unite dei segnali DIC e DsRed. Frecce bianche indicano la divisione delle cellule.
Doxiciclina (1ug/mL) era presente nel terreno in tutto gli esperimenti mostrati in pannelli (D) ed (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Drosophila CaspaseTracker sistema dual biosensore. (Adottato con permesso da Tang et al., Scientific Reports 2015, 9:9015 19 ).
(A) schema dell'apparato di biosensore CaspaseTracker Gal4 di Drosophila .
(B) rappresentazione schematica della caspase-sensibili (DQVD) e il controllo indipendente dalle caspasi (DQVA) Gal4.
(C) schema di ovaio di Drosophila e diagramma di flusso per cellule morte-induzione in 1 giorno-vecchio mosche, seguita dal recupero di 3 giorni a condizione normale. Drosophila immagine fornita da Darren Obbard.
Immagine confocale rappresentativa (D) delle camere a uovo dall'ovaio di una Mosca femmina biosensore nutriti con cibo normale volo per 6 giorni (non trattato).
(E) rappresentanza immagine confocale di alloggiamenti di uovo dall'ovaio di una Mosca di biosensore femmina freddo scioccato messi a-7 ° C per 1 h e poi passa alla condizione di cultura normale per 1 giorno (Cold Shock, CS).
(F) come pannello E tranne le mosche scioccate fredde erano passati a condizione di cultura normale per 3 giorni (recuperato dopo CS).
(G) rappresentanza immagine confocale di uovo di Colombo dall'ovaia di un biosensore affamato femmina vola alimentati con 8% di saccarosio in 1% agar senza proteine per 3 giorni (Starved).
(H) come pannello G tranne le mosche trattate erano passati a volo normale cibo per 3 giorni dopo il trattamento di inedia di proteina (re-immessi).
(I) come pannello G tranne che mostra l'inedia di caspase insensibile mosche di biosensore femminile di CaspaseTracker (DQVA), che serviva come controllo negativo.
(J) rappresentanza immagine confocale di alloggiamenti di uovo da una femmina affamato e ri-nutriti della drosofila. Le frecce indicano nucleare GFP esprimendo nelle cellule infermiera (nere), gli ovociti (bianchi) e le cellule del follicolo (gialle) di alloggiamenti di uovo e nel germarium (verde). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 . Implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche dell'anastasis. (Adottato con permesso da Tang et al., F1000Res 2017, 06:43 21 ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.