Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per misurare e analizzare le risposte alla temperatura nel bulbo olfattivo di Xenopus laevis. I neuroni del recettore olfattivo e le cellule mitrali sono colorati in modo differenziale, dopodiché vengono registrati i cambiamenti di calcio, che riflettono una sensibilità di alcune reti neurali nel bulbo alle cadute di temperatura indotte al naso.

Abstract

Il sistema olfattivo, specializzato nella rilevazione, integrazione ed elaborazione di molecole chimiche, è probabilmente il sistema sensoriale più studiato. Tuttavia, ci sono prove crescenti che l'olfatto non si limita solo alla sensibilità chimica, ma include anche la sensibilità alla temperatura. Gli Xenopus laevis premetamorfici sono animali traslucidi, con cavità nasali sporgenti prive della placca cribrosa che separa il naso e il bulbo olfattivo. Queste caratteristiche li rendono adatti per lo studio dell'olfatto, e in particolare della termosensibilità. Il presente articolo descrive la procedura completa per misurare le risposte alla temperatura nel bulbo olfattivo delle larve di X. laevis. In primo luogo, l'elettroporazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) viene eseguita con coloranti spettralmente distinti caricati nelle cavità nasali al fine di colorare i loro terminali assonici nel neuropil bulbare. La colorazione differenziale tra i neuroni recettoriali sinistro e destro serve a identificare il glomerulo γ come l'unica struttura innervata da afferenze presinaptiche controlaterali. In secondo luogo, l'elettroporazione è combinata con il carico focale del bolo nel bulbo olfattivo al fine di colorare le cellule mitrali e i loro dendriti. Il volume cerebrale 3D viene quindi scansionato al microscopio a illuminazione lineare per l'acquisizione di dati di imaging rapido del calcio, mentre piccole cadute di temperatura vengono indotte all'epitelio olfattivo. Infine, l'analisi post-acquisizione consente la ricostruzione morfologica della rete termosensibile comprendente il γ-glomerulo e le sue cellule mitrali innervanti, sulla base di specifiche tracce di Ca²⁺ indotte dalla temperatura. L'uso di odori chimici come stimoli, oltre ai sbalzi di temperatura, consente il confronto tra reti termosensibili e chemiosensibili nel bulbo olfattivo.

Introduzione

Negli ultimi anni, la sensibilità alla temperatura non è stata più descritta solo come un senso somestetico, ma anche come una funzione fisiologica rilevante per il sistema olfattivo. Nei roditori, il bulbo olfattivo principale riceve input dal ganglio di Grueneberg (GG), un organo nella cavità nasale, costituito da neuroni termosensibili. I neuroni GG rispondono a temperature fredde¹ così come a stimoli chimici e la loro chemiosensibilità è modulata dalle fluttuazioni di temperatura². Queste osservazioni suggeriscono che il bulbo olfattivo può integrare le informazioni chimiche e di temperatura raccolte al naso. Al fine di esplorare questa ipotesi, presentiamo qui una serie di esperimenti che consentono di rilevare le risposte di temperatura nel bulbo olfattivo di animali non transgenici, utilizzando la larva di Xenopus laevis come modello. L'organizzazione del sistema olfattivo in questi animali ricorda molto quella dei mammiferi. I neuroni recettori olfattivi di X. laevis premetamorfico terminano in ciuffi e stabiliscono contatti sinaptici con i dendriti dei neuroni di secondo ordine, le cellule mitrali. Le fibre pre e postsinaptiche si mescolano e formano strutture neuropile simili a matasse chiamate glomeruli³. Le abbondanti sinapsi dello strato glomerulare rappresentano il primo centro di elaborazione dell'informazione olfattiva. Le cellule mitrali integrano ulteriormente l'input sensoriale e lo convogliano alle aree olfattive superiori.

Abbiamo sviluppato un protocollo che combina l'elettroporazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) con coloranti sensibili e non sensibili al calcio, seguita dal caricamento in bolo della rete postsinaptica di glomeruli e cellule mitrali. La colorazione mediante elettroporazione di due coloranti spettralmente distinti caricati nelle cavità nasali serve a individuare il γ-glomerulo³ attraverso la sua innervazione bilaterale da parte di ORN provenienti da entrambi gli epiteli olfattivi. Pertanto, la posizione del γ-glomerulo viene identificata prima di ulteriori misurazioni. Successivamente, il carico in bolo⁴ con Fluo-8 acetossimetile (Fluo-8 AM) viene effettuato in un volume comprendente il γ-glomerulo. L'imaging delle variazioni di calcio con la microscopia confocale veloce consente la visualizzazione delle risposte alla temperatura nel neuropile 3D che circonda il glomerulo γ, un glomerulo sensibile alla temperatura unico in questo sistema⁵. Le cellule mitrali che innervano questa specifica struttura possono anche essere identificate dai loro segnali di Ca²⁺ che rispondono alle cadute di temperatura indotte. Successivamente, l'imaging di correlazione dell'attività⁶ utilizza le tracce specifiche di Ca²⁺ di queste cellule per rivelare la morfologia dendritica delle cellule mitrali termosensibili. L'alternanza di applicazioni ripetute di soluzione fredda di Ringer e odori chimici in un'unica misurazione può essere utilizzata per visualizzare le reti di cellule mitraliche per l'elaborazione degli odori e della temperatura che circondano il glomerulo γ e identificare potenziali sovrapposizioni. Per assegnare in modo inequivocabile le risposte allo stimolo chimico o alla temperatura, monitoriamo costantemente la temperatura all'epitelio olfattivo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti con Xenopus laevis girini sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Università di Göttingen Etico in sperimentazione animale.

1. elettroporazione

1. Scegli animali di fasi 49-54 secondo le Nieuwkoop e Faber ^7.
2. Assicurarsi che il sistema di registrazione consiste di uno stereomicroscopio con una grande distanza di lavoro ed un dispositivo per elettroporazione che può applicare impulsi di tensione di 20 V per 20 msec con una frequenza di almeno 2 Hz. Applicare gli impulsi di tensione attraverso due elettrodi di platino con un diametro approssimativo di 200 micron in modo che possano essere inseriti nelle narici i girini 'senza causare danni.
3. Preparare cristalli di un colorante coniugato destrano (ad esempio, calcio verde 10 kDa destrano, o Alexa Fluor 647 10 kDa destrano) sciogliendo la quantità tipicamente erogata su 5 mg in circa 100 ml di acqua distillata e lasciando piccole goccioline di2 ml asciugare su un foglio di Parafilm.
   Nota: I cristalli asciugare in meno di un giorno e possono essere conservati in seguito a -18 ° C nel congelatore per un periodo di oltre un anno.
4. Anestetizzare gli animali mettendoli in acqua di rubinetto contenente 3% Tricaine metano solfonato per 1-2 minuti fino a raggiungere lo stato di anestesia chirurgica caratterizzato dalla riduzione della frequenza cardiaca, la perdita di tutti i movimenti e la mancanza di risposte a stimoli meccanici.
5. Immergere l'animale anestetizzato per 10 secondi in acqua di rubinetto pura.
6. Posto l'animale su un cuscino di gel e fissarlo inserendo aghi intorno ad esso senza danneggiare esso.
   Nota: Non fissare l'animale colpendo gli aghi attraverso la sua pelle.
7. asciugare delicatamente la zona circostante le narici con un fazzoletto di carta.
8. Posto l'animale con lo stereomicroscopio e concentrarsi sulle narici.
9. Utilizzare pinze per prendere un cristallo tintura di dimensioni corrispondenti foro narice, inserirlo in una delle cavità nasali e attendere che si dissolve completamente, which richiede meno di 1 min. Se i cristalli sono più piccoli, aggiungere 2 o 3 in ciascuna cavità fino producono una soluzione non traslucido alto concentrato.
10. Posizionare il catodo sulla pelle del girino e l'anodo in una delle narici.
    Nota: Questa impostazione particolare si applica ai coloranti citati al punto 1.3. Per coloranti con una polarità diversa, i risultati della colorazione possono essere migliorate ponendo il catodo nelle narici. Se incerto circa la polarità del colorante, entrambi gli elettrodi possono essere posizionati contemporaneamente nelle narici (uno per narice), e la polarità alterna impulsi singoli tensione.
11. Applicare sei impulsi di 20 V e 20 msec, con circa 0,5 secondi di intervallo di stimolo.
    Nota: Piccole bolle devono apparire intorno all'elettrodo nella narice durante l'elettroporazione condizione che gli elettrodi sono a contatto con la pelle e la soluzione nella narice. Se non ci sono bolle sono visibili controllare i cavi di collegamento e assicurarsi che il Devic electroporatinge sta fornendo l'impulso di tensione desiderato.
12. Ripetere la procedura (1,9-1,11) per il secondo narice.
13. Trasferire il girino elettroporate in un bicchiere pieno di acqua di rubinetto a temperatura ambiente. Attendere 5 a 10 minuti fino a quando l'animale riprende conoscenza e riprende la sua piscina. Alimentarlo e farlo recuperare per almeno 1 giorno, durante il quale il colorante viene trasportato lungo il nervo olfattivo al bulbo olfattivo.
14. Utilizzare gli animali elettroporate entro 1-7 giorni dopo l'elettroporazione per i migliori risultati di imaging. Dare almeno 24 ore di tempo per il trasporto di tintura e di recupero prima di imaging.

2. Monte Preparazione tutto

1. Anestetizzare l'animale in acqua del rubinetto contenente 3% Tricaine metano solfonato fino a quando tutti i movimenti hanno smesso e non risponde più agli stimoli meccanici.
2. Trasferire il girino ad un cuscinetto di gel allo stereomicroscopio e fissare saldamente colpendo aghi attraverso la pelle su ciascun lato del forebrain.
3. Sacrificare il girino tagliando il suo midollo spinale.
4. Utilizzare un bisturi per sezionare un blocco di tessuto che contiene entrambe le cavità nasali, i nervi olfattivi e bulbi olfattivi (Figura 1A). Effettuare la prima incisione vicino alla sinistra narice, senza toccarlo, e spostare la lama di taglio in avanti lungo il nervo olfattivo sinistra e lampadina fino al confine telencefalica-diencephalic. Fare altrettanto sul lato destro. Isolare preparato dal resto del sistema nervoso facendo un posteriore taglio finale al telencefalo.
5. Eliminare il corpo del girino e capovolgere attentamente il blocco tessuti capovolto in modo che il lato ventrale del preparato cerebrale rivolto verso l'alto.
6. Pin di nuovo il blocco dei tessuti con l'inserimento di due aghi tra i nervi olfattivi.
7. Mettere una goccia di soluzione di Ringer Rana (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl _2, 2 mM MgCl _2, 5 mM di glucosio, 5 mM Na-piruvato, 10 mM HEPES, pH regolato a 7,8, osmolarezza di 230 mOsmol / L) sul tessuto.
8. Rimuovere le meningi che coprono la zona di smistamento assone e bulbi olfattivi facendo tre incisioni con le forbici sottili. Partendo dal bordo posteriore del blocco tessuti, tagliare caudorostrally vicino lungo il bulbo olfattivo sinistra fino al punto di ingresso dei nervi olfattivi nelle lampade (zona di ordinamento assone).
9. Ripetere il passaggio 2.8 per l'emisfero destro.
10. Sollevare le meningi con pinza e fare il terzo taglio, perpendicolari alle precedenti in corrispondenza della zona di smistamento assone.
    Nota: Il lato ventrale del bulbo olfattivo è ora accessibile per l'imaging e il bolo di carico.
11. Per migliorare la qualità dell'immagine nell'immagine luce trasmessa, ripetere la procedura per il lato dorsale. Questi passaggi aggiuntivi possono facilitare la navigazione del micropipetta per bolo di carico, ma non sono strettamente necessari.
12. Trasferire il campione in una camera di registrazione pieno di rana Ringer per l'ulteriore elaborazione e di imaging. Faure che il lato ventrale è rivolto verso l'alto e fissare il campione con una rete di fibre di nylon attraversato più una piccola cornice platino.
13. Per una più facile applicazione di stimoli posizionare le cavità nasali sulla cima di una delle fibre di nylon.

3. bolo Caricamento

1. Sciogliere 50 ug del calcio AM colorante (come, Fluo-8 AM) in 20 ml di dimetilsolfossido (DMSO) contenente il 20% di Pluronic F-127 (w / v) per preparare una soluzione stock di AM colorante. Congelare le soluzioni madre in piccole aliquote di 1-2 volumi microlitri. La soluzione madre è stabile per almeno un anno e mezzo, ma evitare cicli di congelamento-scongelamento.
2. Utilizzare un estrattore micropipetta e tirare pipette con una resistenza di 5-8 MW e un diametro punta di 1-2 micron.
3. Sciogliere soluzione madre preparata del colorante in soluzione di Ringer Rana ad una concentrazione di 250-500 micron.
4. Aggiungere MK571 per raggiungere una concentrazione di 500 micron a bloccare trasportatori multidrug resistance.
5. Riempire la micropipetta con 10 ml di soluzione con un puntale allungato e rimuovere tutte le bolle d'aria muovendo il micropipetta.
6. Montare la micropipetta nel supporto pipetta e assicurarsi che la pressione può essere applicata manualmente con una siringa o di un dispositivo di espulsione pneumatica droga e monitorare la pressione applicata con un calibro.
7. Se possibile, utilizzare un setup microscopio con la capacità di eccitare il colorante iniettato in modo che il deflusso dalla punta micropipetta può essere visualizzato e regolato. Idealmente, utilizzare un setup di imaging confocale. Utilizzare un microscopio verticale con un obiettivo ad immersione in modo che il tessuto può essere raggiunto con la micropipetta.
8. Posizionare l'intera preparazione monte sotto il microscopio, seguire il nervo olfattivo fino a quando la lampadina e concentrarsi sulla zona di interesse nel bulbo olfattivo.
9. Profumato soluzione Ringer fresca attraverso la camera di registrazione al fine di aumentare la vitalità della preparazione e lavare la fuoriuscita colorantedalla punta micropipetta.
10. Abbassare la pipetta sulla superficie del bulbo olfattivo, con la punta rivolta in direzione rostrale della preparazione.
11. Applicare una piccola e costante pressione positiva (~ 25 hPa) per la micropipetta per evitare l'intasamento della pipetta e inserirla delicatamente nel tessuto.
12. Una volta che la pipetta ha violato gli strati di tessuto esterni, spostarlo in una direzione rostro-dorsale nello strato delle cellule mitrale. (Si noti che un contatore colorazione dei neuroni olfattivi mediante elettroporazione è utile per regolare la posizione della micropipetta.) Idealmente, inserire la punta della pipetta ad una distanza di 50-100 micron dal sito registrazione desiderata.
    1. Per la colorazione del γ-glomerulo sensibile alla temperatura, indirizzare un'area di circa 50 micron rostralmente dalla posizione della neuropil presinaptica del γ-glomerulo.
13. Applicare una pressione positiva nell'intervallo 100-200 hPa. Regolare la forza di pressione a seconda delle dimensioni dellela punta micropipetta. Conferma il deflusso dalla pipetta guardando per i movimenti dei tessuti leggeri visibili sotto illuminazione Brightlight quando viene applicata pressione per la prima volta.
14. Mantenere una pressione costante per circa 10 minuti, mentre la micropipetta rimane nel tessuto. Se possibile, controllare il neuropil nel frattempo per il carico delle cellule in condizioni di illuminazione a fluorescenza, come successo di carico si tradurrà in visibile colorazione somata cella con intensità crescente nel corso del tempo.
    Nota: Spesso il motivo per il carico soccombente è pipetta intasamento a causa del tessuto di entrare in punta o cluster di tintura aggregati. A volte è possibile salvare la pipetta rompendo delicatamente la punta contro la superficie inferiore della camera di registrazione. Tuttavia, la punta della pipetta non deve superare i pochi micrometri. Compensare le aperture delle pipette più grandi applicando una pressione più bassa durante il bolo di carico.
15. Dopo 10 min di carico, ridurre la pressione applicata a zero e controllare la colorazione.
    Nota: La dimensione della zona macchiata varia notevolmente e dipende da diversi parametri come quantità di colorante iniettato e la posizione del sito di eiezione. Una buona colorazione si estende su una superficie di circa 100 micron x 100 micron.
16. Se la zona macchiata è troppo piccola o non copre il sito di registrazione desiderato, ripetere i passaggi 3,10-3,13. Utilizzare la stessa micropipetta per l'iniezione successiva se non è ancora intasato.
17. Attendere almeno 30 minuti dopo l'ultima iniezione prima di iniziare qualsiasi esperimenti per consentire colorante assorbimento e deesterification. Continuare a perfusione camera di registrazione con soluzione Ringer fresca in ogni momento.

4. Impostazioni di misura

1. Assicurarsi che la messa a punto di misura è costituito da un microscopio confocale a velocità sufficiente per registrare tre volumi tridimensionali. Scegliere una frequenza di acquisizione di almeno 1 Hz per stack.
   Nota: configurazioni adatte comprendono ad esempio i microscopi line-illuminazione a scansione il line-saggio, invece di punto per p campionemisto. Una semplice realizzazione di tale configurazione è stata precedentemente descritta ^6. Altre opzioni sono filatura microscopi disco. Se tale configurazione è disponibile, è ancora possibile misurare aree più piccole con un normale configurazione punto-scansione.
2. Impostare i parametri di misura in modo che un volume grande abbastanza da contenere le dimensioni di un glomerulo può essere coperto.
   Nota: Lo spessore tipico di un volume di registrazione è nella gamma di 20 micron che dovrebbe essere coperto da almeno 5 strati.
3. Controllare tutte le misure presinaptiche per lo sbiancamento. Regolare la potenza del laser fino l'intensità media di fluorescenza delle immagini registrate non scende nel corso tempo della registrazione.
4. Limitare il tempo di misura e la zona per le registrazioni sul lato postsinaptica per evitare sbiancamento quanto possibile, anche se per misure superiori 20-30 sec sbianca è probabile che si verifichi.

5. Odore Applicazione e Esperimenti di temperatura

1. versare 25ml di soluzione di Ringer fresco (precedentemente conservato a 4 ° C) in un tubo da 50 ml. Porre il tubo in un secchio di ghiaccio.
2. Monitorare la temperatura del Ringer raffreddato inserendo la sonda pulita di un termometro nel tubo. Attendere fino a quando la temperatura scende al di sotto di 1 ° C prima di iniziare l'esperimento.
3. Preparare 50 ml di L-istidina disciolto in soluzione di Ringer ad una concentrazione di 10 mM.
4. Utilizzare un applicatore imbuto ⁸ o sistemi di applicazione simili che permettano consegna stimolo concomitanza alla perfusione Ringer modo che il flusso dell'acqua nella camera rimane costante e ininterrotto durante il rilascio della soluzione stimolo. Posizionare l'imbuto in modo tale che la presa distale è inferiore a 1 mm dalla epitelio olfattivo.
5. Collocare un sensore di temperatura NiCr-Ni collegato ad un termometro digitale vicino all'epitelio e l'uscita dell'applicatore imbuto. Collegare la porta di uscita del termometro a un computer per registrare e visivamente disgiocare a variazioni di tensione che riflettono piccole variazioni di temperatura.
6. Prima di iniziare l'esperimento, collegare un altro termosensore ad un termometro standard per determinare il fattore di scala tensione-temperatura.
7. Rilevare la temperatura del bagno nella camera di registrazione e assicurarsi che non superi i 22 ° C.
8. Avviare l'acquisizione delle immagini e applicare sequenzialmente 200-400 ml di Ringer fredda, L-istidina e Ringer temperatura ambiente (20-22 ° C) mediante una pipetta elettronica con un intervallo interstimulus di 20-30 sec. Per un migliore controllo della domanda stimolo, rilasciare lo stimolo con un segnale di trigger inviato dalla configurazione risonanza scelta alla pipetta, se possibile. Ripetere il protocollo di applicazione per ottenere risultati riproducibili.
9. Prendere serie di registrazioni più lunghe con diversi cicli di stimolazione in quanto sono preferibili per l'analisi post-immagini con l'imaging di correlazione attività.
   Nota: un compromesso tra il tempo di registrazione e la vitalità fetta èessere trovato. Misure di ca. 2 min coprono 6 applicazioni stimolo forniscono un'attività sufficiente per una buona ricostruzione della rete.

6. Image Processing Utilizzando attività di correlazione Imaging (ACI)

1. Image Processing delle registrazioni pre-sinaptici
   1. In registrazioni con la stimolazione da soluzione di Ringer freddo e istidina, distinguere il γ-neuropil sensibili alla temperatura del glomerulo istidina sensibile vicina dai loro profili di risposta differenti (vedi Kludt et al. ^5).
   2. Creare una sporgenza massima intensità in senso assiale da registrazioni del preparato cervello in cui ORNS sono state elettroporate con due coloranti differenti per visualizzare l'innervazione bilaterale del γ-glomerulo.
2. Image Processing delle registrazioni post-sinaptici Uso Activity Correlazione Imaging (ACI)
   1. Selezionare le registrazioni con punti di tempo sufficiente (più di 100 fotogrammi) e una discreta quantità di attività (almeno due eventi).
      Nota: L'attività può essere sia spontanea per rivelare i processi di singole cellule mitrale o indotta da diverse applicazioni di stimoli durante la stessa registrazione per rivelare le reti cellulari attivate da stimoli olfattivi.
   2. Scegliere le registrazioni in cui le strutture misurati si muovono non più di 2-3 pixel nel corso tempo della registrazione.
      Nota: Le registrazioni con troppo movimento possono essere salvate applicando una procedura di correzione spostamento descritta in Kludt et al ^5.
   3. Controllare se le registrazioni soffrono di sbiancamento. Se l'intensità media dell'intera immagine gocce nel corso di tempo della registrazione, la correzione candeggina è necessario, altrimenti saltare i due passaggi successivi.
   4. Calcolare la tendenza lineare per la traccia temporale di ogni pixel eseguendo una regressione lineare.
   5. Sottrarre il risultato da ogni pixel singolarmente per eliminare la componen linearit del candeggio.
      Nota: In alternativa raccordo Legendre può essere utilizzato come descritto da Bao e Schild ^9.
   6. Scaricare lo script MATLAB per l'uso pronto insieme a una guida passo-passo per l'imaging di correlazione attività (ACI), come descritto da Junek et al. ⁶
      Nota: Seguire la procedura descritta in Junek et al ⁶ come alternativa al utilizzando lo script MATLAB fornito..
   7. Spostare i file 'aci.m', 'matVis.m' e 'aci_roiSelector.m' dal contenitore scaricato nel percorso MATLAB del sistema utilizzato per la valutazione dei dati.
   8. Caricare i dati grezzi acquisiti nel passo 5.8 come variabile per lavoro utente di MATLAB organizzata come [x, y, z, t] -matrix con x ed y riferimento alle dimensioni laterali, z, la direzione assiale e t, il decorso .
   9. Chiamata 'aci' dalla riga di comando di MATLAB.
   10. Nella interfaccia utente (UI)che appare, selezionare 'Prepara dati', quindi selezionare la variabile contenente i dati e una directory in cui verranno salvati i risultati.
       Nota: Per una descrizione completa dell'interfaccia utente consultare il manuale che accompagna lo script aci.
   11. Scorrere i z-strati misurate spostando il cursore corrispondente nella interfaccia utente per avere una panoramica della mappa di varianza visualizzata.
   12. Inserire la dimensione della regione di interesse (ROI) in UI. Per una soma cellulare mitrale regolare la ROI estendersi circa 10 micron nella laterale e 5 micron in direzione assiale. Per un glomerulo, i valori leggermente superiori di 20 micron e 10 micron lateralmente assialmente sono appropriati.
       Nota: Le dimensioni ROI deve essere inserito come numero di pixel, che dipende dalla scala pixel scelto per la registrazione.
   13. Selezionare un ROI contenente la γ-glomerulo e le regioni supplementari per ogni soma visibile dei circostanti cellule mitrali facendo clic con il tasto centrale del mouse sul CenteR della cella / glomerulo.
   14. Chiudere l'utente principale che fa scattare il calcolo di correlazione mappe per tutte le tracce di riferimento. Il risultato viene salvato automaticamente e visualizzato.

Risultati

L'elettroporazione di neuroni olfattivi (ORNS) è stato raggiunto con coloranti Alexa Fluor o indicatori di calcio coniugati con molecole Destrano per l'etichettatura anterograda tramite trasporto assonale attiva. Mentre il primo coloranti forniscono colorazione brillante dei neuroni sensoriali e loro terminali assoni ramificano nello strato glomerulare del bulbo, quest'ultimo consentono la misurazione dell'attività neuronale in queste cellule (figure 1 e 2). Innanzitutto, la posizione del termosensibile γ-glomerulo e il suo modello innervazione stato visualizzato da electroporating Alexa Fluor 647 destrano e Alexa Fluor 546 destrano in epiteli olfattiva sinistro e destro, rispettivamente (Figura 1A). Ventiquattro ore dopo la procedura, i ORNS nelle narici, i due nervi olfattivi e glomeruli in entrambi gli emisferi erano visibili al microscopio a fluorescenza. I diversi gruppi glomerulare erano identifiable dalle loro rispettive posizioni, in particolare il piccolo gruppo comprendente la γ-glomerulo (Figura 1B). Un piccolo numero di fibre olfattive controlaterale correva attraverso il bulbo olfattivo controlaterale, attraversato il commissura anteriore e terminato nel ipsilaterale γ-glomerulo (Figura 2A).

Per registrare le risposte di calcio delle fibre presinaptiche del γ-glomerulo, calcio verde Destrano è stato elettroporate in ORNS, secondo la stessa procedura. salti di temperatura negativi sono stati indotti a narice tramite il rilascio controllato di soluzione di Ringer ghiacciata (0-1 ° C). Un volume 3D che comprende il γ-glomerulo è stato ripreso in una linea-illuminazione microscopio confocale veloce. ΔTs di -1 ° C sono stati sufficienti a scatenare reazioni fredde nel γ-glomerulo e le sue afferenze, riconoscibile come picchi reversibili nelle Af / F Ca ²⁺ tracce (Figura 2B </ strong>, C).

Ulteriori misure sperimentali sono state condotte per misurare l'attività freddo indotta nelle cellule mitrali connessi alla γ-glomerulo attraverso le loro terminazioni dendritiche ramificazione. Queste fibre post-sinaptici e la neuropil circostante sono stati effettivamente macchiati da carico in bolo del colorante calcio-sensibili Fluo-8 del mattino, eseguito pochi giorni dopo Alexa 647 Destrano era stato elettroporate in ORNS (Figura 3A, B). cellule mitrali stati riempiti con Fluo-8 AM e l'epitelio olfattivo è stato stimolato due volte secondo la seguente paradigma: Ringer fredda, istidina (10 pM) e temperatura ambiente Ringer, applicato successivamente. Due tracce di riferimento sono stati prelevati da regioni di interesse nel volume registrata, una risposta esclusivamente al diminuire della temperatura, l'altra, al istidina soltanto. Immagini di correlazione attività (ACI) ⁶ è stato calcolato sulla base del riferimento selezionatotracce di visualizzare con elevato contrasto la morfologia dendritica delle reti postsinaptici corrispondenti sia per la temperatura o il Ca ²⁺ segnale di istidina-reattiva (Figura 3C, D). Infine, mappe termosensibili e chemiosensibili erano codice colore e sovrapposti l'uno sopra l'altro, che mostra come la temperatura e informazioni chimiche viene convogliato da glomeruli individualmente i neuroni di secondo ordine olfattivi (Figura 3E). Per una descrizione di integrazione e trattamento di entrambi i tipi di informazioni in reti olfattivi condivise, vedere Kludt et al. ⁵

Figura 1: Panoramica del ORN elettroporazione e bolo di carico (A) neuroni olfattivi in entrambe le cavità nasali di X.. laevis larve sono state elettroporate con coloranti Alexa o Calciucoloranti sensibili m-accoppiati alle molecole destrano. Gli indicatori fluorescenti sono stati trasportati anterogradely fino alla arborization assonale terminale. 24 ore dopo l'elettroporazione, lo strato glomerulare in entrambi gli emisferi mostrato colorazione fluorescente. (B) Schema della organizzazione cellulare del bulbo olfattivo in un emisfero. Lo strato glomerulare si estende la lampadina in gruppi: i gruppi mediali, piccole, intermedie e laterali. informazioni olfattive vengono trasferiti dai neuroni recettori per mitrale cellule attraverso sinapsi eccitatorie in glomeruli. cellule Periglomerular e cellule granulari sono neuroni inibitori che modulano l'elaborazione olfattiva e la codifica. La γ-glomerulo (ciano) è stato facilmente identificato come la piccola neuropil dove omolaterale (rosso) e controlaterale (arancione) fibre olfattive unite. (C) bolo di carico è stato raggiunto in prossimità del γ-glomerulo macchiare la neuropil postsinaptica composto principalmente da cellule mitrale e loro dendrialberi tic ramificazione considerevolmente nello strato glomerulare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: elettroporazione di ORNS rivela connettività strutturale e funzionale (A) innervazione bilaterale del γ-glomerulo da ipsilaterale (verde) e controlaterale (rosso) neuroni olfattivi (ORNS).. Barra di scala = 50 micron. (B) Il bulbo olfattivo dopo elettroporazione con il calcio sensibile colorante calcio verde destrano. Il intermediale (IMC), mediale (MC) e il piccolo gruppo (SC) sono visibili. L'immagine è una proiezione massima di 100 micron volume di misura di spessore. Barra di scala = 50 micron. (C) Primo piano vista del piccolo gruppo. Il volume registrato (12 micron) èrappresentato in una proiezione massima. L'immagine raffigura il livello di fluorescenza basale in grigio ed il Af codice colore / F carta come una sovrapposizione. La risposta massima stimolazione con soluzione Ringer fredda è tracciata. La γ-glomerulo ha reagito con forza, mentre i due glomeruli confinanti restano in silenzio. L'inserto mostra la traccia Af / F per il γ-glomerulo corrispondente alla regione indicata di interesse. La barra blu rappresenta l'applicazione dello stimolo. Barra di scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Bolo di carico e ACI dissociano termosensibile e reti chemiosensibili (A) assoni di ORNS terminanti nel piccolo gruppo erano macchiati dalla elettroporazione con il non-calcium colorante sensibile Alexa 647 Destrano. La linea tratteggiata delinea la γ-glomerulo. (B) Immagine della stessa regione in (A) nel secondo canale di misura dopo il caricamento bolo con il colorante calcio-sensitive Fluo-8 PM. Alcuni somata cellula mitrale erano visibili, ma il contrasto è stato limitato. Seguendo le frecce, due tracce di risposta sono stati tracciati, che sono stati utilizzati per l'imaging di correlazione attività (ACI). Blu, barre rosse e nere sotto le tracce raffigurano l'inizio dell'applicazione di Ringer fredda, istidina (10 pM) e, a temperatura ambiente Ringer come controllo negativo rispettivamente. I due Ca ²⁺ tracce sono state prese da diverse regioni di interesse del volume misurato. (C) Il risultato ACI della traccia in (B) evidenziando le aree che rispondono prevalentemente a Ringer freddo. (D) Il risultato ACI della traccia in (B) evidenziando le aree che rispondono prevalentemente a istidina. (E) Sovrapposizione delle due mappe ACI. cellule mitrali che rispondono alle histidina e il glomerulo innervato (rosso) erano facilmente distinguibili dalle cellule mitrali termosensibili e la γ-glomerulo (ciano). Tutte le immagini di questa figura sono proiezioni di massima intensità di un volume di 28 micron di spessore. Barra di scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

I metodi qui presentati hanno lo scopo di elaborazione registrazione della temperatura nel bulbo olfattivo di Xenopus laevis girini. Le macchie protocollo prime e neuroni secondo ordine nel bulbo olfattivo e fornisce una preparazione del campione in cui il sistema olfattivo rimane essenzialmente intatto. Così, l'attivazione del γ-glomerulo sensibile alla temperatura può essere monitorato e confrontato con i glomeruli vicini chemio-sensibili. L'innervazione bilaterale unica di questo glomerulo viene visualizzato mediante elettroporazione di cellule con spettralmente diversi coloranti. Inoltre, bolo loading consente la colorazione di cellule mitrali coprono un ampio volume all'interno del bulbo olfattivo. I segnali di temperatura indotte neuronali di elaborazione di rete si rivela prendendo le misure del calcio con le applicazioni di stimolo ripetute e, successivamente, l'analisi dei dati con l'imaging di correlazione attività.

Il protocollo mette in evidenza due sofisticati proce colorazione dure, che richiedono entrambi manipolazione e pratica prudente per ottenere risultati soddisfacenti e riproducibili. Durante l'elettroporazione alcun danno degli animali deve essere evitato, soprattutto quando il posizionamento degli elettrodi nelle narici. In modo ottimale, dovrebbe verificarsi alcun contatto con l'epitelio olfattivo. Si noti che gli animali sono ancora in vita dopo la procedura di elettroporazione e il loro tempo di recupero devono essere prese in considerazione. Se la colorazione rimane troppo debole dopo un giro di elettroporazione, che può accadere a seconda dei tipi di coloranti usati, l'intensità può essere aumentata aumentando la concentrazione di colorante nelle narici. Poiché le molecole di destrano accoppiamento vengono trasportati attraverso diversi meccanismi compreso il trasporto assonale lento (alla velocità di 1-2 mm / giorno ¹⁰⁾ e diffusione passiva, un'altra alternativa è quella di attendere 48 ore dopo l'elettroporazione prima sacrificando gli animali. In alternativa, l'elettroporazione può essere ripetuto dopo un giorno di recupero.

jove_content "> bolo di carico è una fase critica poiché la quantità di colorante entrare nelle cellule mitrali è difficile regolare e dipende da vari parametri come la dimensione puntale e posizione dell'applicazione. Monitoraggio procedura sotto un microscopio a fluorescenza confocale rivela utile per regolando la durata dell'applicazione tintura e generare risultati di colorazione simili attraverso preparazioni così. Inoltre, girini precedenza elettroporate dovrebbero essere utilizzati per determinare la posizione migliore per l'applicazione dye individuando la posizione del piccolo gruppo (comprendente la γ-glomerulo). il più passaggio critico durante le misure è di evitare sia spostamento e candeggio del campione. lo spostamento può essere evitato posizionando accuratamente il flusso Ringer al microscopio. Come per limitare sbiancare la zona di interesse, il tempo di misura deve essere ridotto all'essenziale .

Bolo di carico colorazione con coloranti calcio-sensibili prevede solo moltocontrasto limitato in quanto le cellule sane in genere hanno bassi livelli di calcio e quindi mostrare debole fluorescenza basale. L'applicazione di imaging di correlazione attività aggira questa limitazione generando invece sulla base di strutture di attività e mette in evidenza con segnali di calcio simili. Questo metodo di analisi post-acquisizione calcola il fattore di correlazione tra il segnale di calcio di una regione selezionata di interesse (traccia di riferimento) e quella di ogni singolo pixel nel volume 3D. Pertanto, i risultati ottenuti fortemente dipendono dal modello di attività selezionata come traccia di referenza. Se l'obiettivo principale è quello di visualizzare i modelli di innervazione delle cellule mitrale, un segnale di riferimento derivato da attività neuronale spontanea è preferito, e scegliendo le cellule mitrale più attivi produrrà i migliori risultati. Per rivelando le reti chemio o termo-sensibili di cellule mitrale, tracce di riferimento che contengono solo le risposte a entrambi istidina o Ringer freddo dovrebbero essere selezionati. La selezione di un intero glomerulo or soma cellula mitrale come regione di interesse non può sempre fornire una chiara traccia di riferimento, soprattutto se le strutture rispondenti ai due stimoli differenti sono distesi l'uno sopra l'altro. In tal caso, è spesso utile selezionare un'area più piccola del glomerulo o corpo cellulare come regione di interesse.

Negli ultimi decenni, elettroporazione è stato descritto come un metodo efficiente per colorare le cellule singole o multiple ^11,12. Qui viene utilizzato per etichettare specificamente neuroni olfattivi. Molecole di destrano coniugato dare la massima efficienza, e coloranti non sensibili calcio, la gamma di selezione è ampia e copre l'intero spettro tipicamente utilizzati in microscopia a fluorescenza ^13. Tuttavia, coloranti calcio-sensibili che sono elettroporate con successo in neuroni recettori olfattivi sono momentaneamente limitato a destrano calcio-verde, e Fluo-4 destrano se ancora disponibili commercialmente. Inoltre, le registrazioni si rivolge principalmente superficiaL strati sulla superficie ventrale solo il bulbo olfattivo, dal momento che la profondità di penetrazione delle tecniche di misurazione veloce è limitata. due fotoni di imaging può in parte ovviare a questa limitazione, ma spesso manca velocità e limita ulteriormente la quantità di coloranti calcio-sensitive selezionabili.

Abbiamo descritto qui un protocollo per la misurazione dell'attività di temperatura indotta nel bulbo olfattivo. Il neuropil cervello è scansionato come un tre dimensioni dello spazio di visualizzare le complesse reti cellulari coinvolti nella trasformazione olfattivo della temperatura. Misurazione dell'attività di temperatura indotte nel bulbo olfattivo è stato recentemente riportato ⁵ e richiede una procedura appositamente personalizzato combinando tecniche diverse. Un importante vantaggio delle tecniche presentate sopra è che centinaia di cellule vengono esposte in tre dimensioni in un preparato in cui la maggior parte del sistema olfattivo rimane intatto. Questi vantaggi messo richiede alle tecniche di colorazione così come il cervello priparazione e di imaging. Ad esempio, elettroporazione cellulare e bolo loading colpito vaste quantità di cellule nell'epitelio olfattivo e bulbo, e consentono quindi la visualizzazione di reti cellulari completi. Inoltre, la fornitura di indicatori chimici tramite loading bolo invece di fluorofori geneticamente codificati consente misurazioni in un insieme potenzialmente maggiore di specie. Altre alternative come il bagno di incubazione con AM coloranti lavorano principalmente a fette che danneggiano il bulbo olfattivo gravemente, lasciando solo qualche centinaio di micrometri di tessuto intatto. In confronto, l'intera preparazione monte utilizzato nel nostro protocollo assicura per esempio che il innervazione bilaterale del γ-glomerulo rimane intatto e le registrazioni sono quindi prese in un sistema ancora in funzione. Infine, l'immagine stesso si è fatto tramite microscopia line-illuminazione che consente l'acquisizione di volumi 3D. Linea-illuminazione microscopia è una delle tecniche confocale fornire la massima velocità di acquisizione possibili ^{6 <}/ Sup>, che sono necessari per coprire una grande frazione del bulbo olfattivo. sistemi di acquisizione più lenti possono essere utilizzati, ma hanno lo svantaggio che la dimensione del volume registrata deve essere ridotto. Negli ultimi anni, altri metodi per l'acquisizione di immagini veloce sono stati sviluppati e possono essere utilizzati come alternative ^14,15. Tuttavia, la linea-illuminazione microscopia rimane uno dei metodi più semplici per ottenere velocità e risoluzione sufficiente. Qui di seguito alcune informazioni come linee guida per la selezione di adeguate impostazioni di imaging. Dal momento che l'imaging calcio è fatto all'interno di preparati cervello di spessore, la configurazione dovrebbe fornire parafocalità decente e gli obiettivi deve avere aperture numeriche di 1.0 o superiore. Per un punto di riferimento, le registrazioni effettuate con il microscopio illuminazione linea corrispondono alle immagini scattate con un microscopio a scansione laser standard con una dimensione foro stenopeico di 0,5-1 unità ariose. velocità di acquisizione è desiderabile. Un volume con uno spessore di 20 micron coperto da almeno 5 layers, un campo laterale di vista 100 micron x 100 micron e una dimensione del pixel di 0,5 micron o inferiore dovrebbe scandire ad una velocità minima di 1 Hz per stack. Ridurre il parafocalità può aumentare la quantità di fotoni contati e permette quindi per acquisizioni veloci se necessario, ma ha lo svantaggio di registrazione più luce fuori fuoco. Tuttavia, poiché tale approccio aumenta lo spessore delle fette ottici, in realtà può agevolare la tracciabilità delle dendriti attraverso diversi z-piani dopo l'applicazione di ACI ^6.

Gli strumenti necessari per studiare estesamente elaborazione temperatura nelle reti bulbo olfattivo sono presentati nel presente documento. attività di Temperatura-indotta è registrato in primo e secondo neuroni ordine via coloranti e segnali sia in arrivo e in partenza dalla γ-glomerulo calcio-sensibili. Inoltre, la misura in cui le singole cellule mitrali processare sia informazioni chimiche e la temperatura può essere valutato. Dal momento che la lea preparazioneves bulbo olfattivo intatta, il ruolo della innervazione bilaterale in lavorazione olfattiva può essere ulteriormente studiato. La procedura è utile anche per rivelare se e come termo e chemoinformation è codificato in sovrapposizione reti olfattive ^5. Infine, le tecniche di cui sopra non sono limitati allo studio delle risposte di temperatura nel bulbo olfattivo, ma può essere applicato per una valutazione più generale del sistema olfattivo, specialmente le reti di elaborazione cellulari in grandi tre volumi tridimensionali. Bolo di carico e di imaging di correlazione attività sono strumenti potenti per osservare e confrontare l'attività di decine di neuroni, rendendoli applicabili a diverse reti del cervello ^16.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Cloruro di sodio	Merck Millipore	1064040500
Cloruro di potassio	Merck Millipore	1049360250
Cloruro di magnesio esaidrato	Merck Millipore	1058330250
D(+)-Glucosio	Merck Millipore	1083371000
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P2256
HEPES	Merck Millipore	1101100250
Verde calcio 10 kDa Destrano	Thermo Fisher Scientific	C-3713
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	D-22914
Dextran, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	D-22911
Fluo-8 AM	TEFlabs	203
MK571	Alexis Biochemicals	340-021-M005
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
Acido pluronico F-127	Sigma-Aldrich	P2443	polvere
L-Istidina monocloridrato monoidrato	Sigma-Aldrich	53370
DMSO	Merck Millipore	1029522500
Equipment
Pipetta elettronica	BrandTech	HandyStep Pipetta
Termocoppia NiCr-Ni	Greisinger Elektronik	GTF 300
Estrattore per micropipette	Narishige	Modello PC-10	estrattore a due gradini
Applicatore a imbuto	(su misura)
Microscopio a illuminazione lineare	(su misura)		altrimenti, un microscopio a disco rotante disponibile in commercio
Obiettivo W Plan-Apochromat 63X/1.0	Zeiss	441470-9900-000
Obiettivo W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000
Software
MATLAB	Il MathWorks		da R2010b in su

Cloruro di calcio diidrato Merck Millipore 1023820250 a ripetizione elettronica a ripetizione