I coloranti fotostabili della cianina sono attaccati agli oligonucleotidi per monitorare l'ibridazione mediante trasferimento di energia.
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Articolo metodologico
Sintesi della lunghezza d'onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo protocollo, dimostriamo un metodo per la sintesi di 2'-alchino modificato acido (DNA) trefoli nucleici di sintesi in fase solida utilizzando la chimica automatizzata fosforamidite standard. Oligonucleotidi sono post-sinteticamente etichettate da due nuove tinte cianina fotostabili utilizzando rame-catalizzata click-chimica. La sintesi di dye donatore e accettore è descritto ed avviene in tre fasi consecutive. Con il DNA come l'architettura circostante, questi due coloranti subiscono un trasferimento di energia quando vengono portati in stretta prossimità mediante ibridazione. Pertanto, ricottura di due singoli filamenti di DNA bloccati viene visualizzato da un cambiamento di colore di fluorescenza. Questo cambiamento di colore è caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza, ma può anche essere osservato direttamente utilizzando una lampada ultravioletta palmare (UV). Il concetto di una doppia lettura di fluorescenza di colore rende questi sonde oligonucleotidiche ottimi strumenti per l'imaging molecolare soprattutto quando il pho descrittocoloranti tostable vengono utilizzati. In tal modo, photobleaching delle sonde di imaging è impedito, e processi biologici può essere osservato in tempo reale per un periodo di tempo più lungo.
Introduzione
Imaging molecolare rappresenta una tecnica fondamentale per la comprensione dei processi biologici all'interno delle cellule viventi. 1-3 Lo sviluppo di fluorescenti sonde base di acido nucleico per tali applicazioni chimico-biologico è diventato un campo di ricerca in espansione. Queste sonde fluorescenti devono soddisfare alcuni requisiti per diventare strumenti adatti per l'imaging cellulare. In primo luogo, i coloranti applicati devono mostrare fluorescenza con elevati rendimenti quantici, turni grande Stokes 'e, soprattutto, di alta photostabilities per consentire a lungo termine imaging in vivo. E in secondo luogo, essi dovrebber....
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Protocollo
Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate che sono tipicamente richiesti nei laboratori di chimica organica, come ad esempio indossare un camice da laboratorio, occhiali e guanti.
1. Sintesi dei coloranti
Nota: Le due coloranti possono essere sintetizzati dagli stessi tipi di reazione Figura 2 mostra una panoramica di queste reazioni..
- Sintesi di 1- (3-azidop....
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Risultati
Assorbimento e spettri di fluorescenza del DNA a singolo e doppio filamento sono registrati come mostrato in Figura 4.
Gli spettri di assorbimento registrata (Figura 4 a destra) mostrano l'assorbimento massimi λ max a 465 nm per DNA1 a singolo filamento (dye 1) e 546 nm per DNA2 a singolo filamento (dye 2). Il DNA1_2 ricotto (dye 1 & dye 2) mostra massimi sia a 469 nm e 567 .......
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Discussione
Questo protocollo mostra la procedura completa di etichettare DNA post-sinteticamente tramite CuAAC dai coloranti fluorescenti azide modificati. Questo include la sintesi dei coloranti e il DNA alchino modificato così come la procedura di etichettatura.
La sintesi dei coloranti segue quattro fasi. Tutti i prodotti possono essere ottenuti da un piuttosto semplice precipitazione causa della loro carica positiva e non è necessaria tempo cromatografia su colonna. L'introduzione delle funzion.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la ricerca di formazione Gruppo GRK 2039 (finanziato dalla DFG) e kit ringraziano.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| forte | |||
| 4-Picolina | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropano | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Acetato di etile | Fisher Scientific | 10456870 | grado tecnico |
| Azoturo | di sodioSigma Aldrich | 71290 | grado p.a. |
| Fisher Scientific | 10626642 | grado tecnico | |
| indolo-3-carbossaldeide; 98% | ABCR | AB112969 | |
| carbonato di potassio, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimetilcarbonato | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-dimetilformammide, 99,8%, Extra secco su setaccio molecolare | Acros | 348435000 | |
| Solfato di sodio | Bernd Kraft | 12623,46 | |
| Etanolo, 99,5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidina, 99% | Acros | 147181000 | |
| Dietiletere | Fisher Scientific | 10407830 | grado tecnico |
| 2-fenilindo-3-carbossaldeide; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-metilchinolina | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Sintetizzatore di acidi nucleici | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | ||
| DMT-dG(dmf) Fosforamidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Fosforamidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Diluente amidite per la sintesi del DNA | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Acetonitrile ultrapuro per la sintesi del DNA | Sigma | Aldrich L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich L840000 | ||
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Colonna 1.0 µ mole | Proligo Reagenti | T461010 | |
| CPG dA(bz) Colonna 1.0 µ mole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Colonna 1.0 µ mole | Proligo Reagenti | G461010 | |
| CPG dC(bz) Colonna 1.0 µ mole | Proligo Reagenti | C461010 | |
| ammoniaca (soluzione acquosa) | Fluka Dispositivi analitici | 318612 | |
| centrifughi nanosep 0.45 µ m | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazolo (Attivatore) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)rame(I) esafluorofosfato | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Acetato di sodio | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodio L-ascorbato | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA sale disodico | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligando | - | - | sintetizzato secondo una procedura di letteratura1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spettrometro | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 colonna | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determinazione della concentrazione | |||
| ND 1000 Spettrofotometro | nanodrop | ||
| preparazione del campione e spettroscopia | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 | fluorimetro Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
Riferimenti
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.
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Ristampe e permessi
