Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

Stefanie Arndt; Heidi-Kristin Walter; Hans-Achim Wagenknecht

doi:10.3791/54121

Articolo metodologico

Sintesi della lunghezza d'onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

DOI:

10.3791/54121

⸱

6 luglio 2016

Stefanie Arndt^*¹ , Heidi-Kristin Walter^*¹ , Hans-Achim Wagenknecht¹

¹Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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I coloranti fotostabili della cianina sono attaccati agli oligonucleotidi per monitorare l'ibridazione mediante trasferimento di energia.

Abstract

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In questo protocollo, dimostriamo un metodo per la sintesi di 2'-alchino modificato acido (DNA) trefoli nucleici di sintesi in fase solida utilizzando la chimica automatizzata fosforamidite standard. Oligonucleotidi sono post-sinteticamente etichettate da due nuove tinte cianina fotostabili utilizzando rame-catalizzata click-chimica. La sintesi di dye donatore e accettore è descritto ed avviene in tre fasi consecutive. Con il DNA come l'architettura circostante, questi due coloranti subiscono un trasferimento di energia quando vengono portati in stretta prossimità mediante ibridazione. Pertanto, ricottura di due singoli filamenti di DNA bloccati viene visualizzato da un cambiamento di colore di fluorescenza. Questo cambiamento di colore è caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza, ma può anche essere osservato direttamente utilizzando una lampada ultravioletta palmare (UV). Il concetto di una doppia lettura di fluorescenza di colore rende questi sonde oligonucleotidiche ottimi strumenti per l'imaging molecolare soprattutto quando il pho descrittocoloranti tostable vengono utilizzati. In tal modo, photobleaching delle sonde di imaging è impedito, e processi biologici può essere osservato in tempo reale per un periodo di tempo più lungo.

Introduzione

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Imaging molecolare rappresenta una tecnica fondamentale per la comprensione dei processi biologici all'interno delle cellule viventi. ^1-3 Lo sviluppo di fluorescenti sonde base di acido nucleico per tali applicazioni chimico-biologico è diventato un campo di ricerca in espansione. Queste sonde fluorescenti devono soddisfare alcuni requisiti per diventare strumenti adatti per l'imaging cellulare. In primo luogo, i coloranti applicati devono mostrare fluorescenza con elevati rendimenti quantici, turni grande Stokes 'e, soprattutto, di alta photostabilities per consentire a lungo termine imaging in vivo. E in secondo luogo, essi dovrebber....

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Protocollo

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Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate che sono tipicamente richiesti nei laboratori di chimica organica, come ad esempio indossare un camice da laboratorio, occhiali e guanti.

1. Sintesi dei coloranti

Nota: Le due coloranti possono essere sintetizzati dagli stessi tipi di reazione Figura 2 mostra una panoramica di queste reazioni..

Sintesi di 1- (3-azidop....

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Risultati

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Assorbimento e spettri di fluorescenza del DNA a singolo e doppio filamento sono registrati come mostrato in Figura 4.

Gli spettri di assorbimento registrata (Figura 4 a destra) mostrano l'assorbimento massimi λ _max a 465 nm per DNA1 a singolo filamento (dye 1) e 546 nm per DNA2 a singolo filamento (dye 2). Il DNA1_2 ricotto (dye 1 & dye 2) mostra massimi sia a 469 nm e 567 nm. .......

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Discussione

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Questo protocollo mostra la procedura completa di etichettare DNA post-sinteticamente tramite CuAAC dai coloranti fluorescenti azide modificati. Questo include la sintesi dei coloranti e il DNA alchino modificato così come la procedura di etichettatura.

La sintesi dei coloranti segue quattro fasi. Tutti i prodotti possono essere ottenuti da un piuttosto semplice precipitazione causa della loro carica positiva e non è necessaria tempo cromatografia su colonna. L'introduzione delle funzion.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la ricerca di formazione Gruppo GRK 2039 (finanziato dalla DFG) e kit ringraziano.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
forte
4-Picolina	Sigma Aldrich	239615
1,3-Diiodopropano	Sigma Aldrich	238414
Acetonitrile	Fisher Scientific	10660131
Acetato di etile	Fisher Scientific	10456870	grado tecnico
Azoturo	di sodioSigma Aldrich	71290	grado p.a.
	Fisher Scientific	10626642	grado tecnico
indolo-3-carbossaldeide; 98%	ABCR	AB112969
carbonato di potassio, 99+%	Acros	424081000
dimetilcarbonato	Sigma Aldrich	517127
N,N-dimetilformammide, 99,8%, Extra secco su setaccio molecolare	Acros	348435000
Solfato di sodio	Bernd Kraft	12623,46
Etanolo, 99,5%	Acros	397690010
Piperidina, 99%	Acros	147181000
Dietiletere	Fisher Scientific	10407830	grado tecnico
2-fenilindo-3-carbossaldeide; 97%	ABCR	AB125050
4-metilchinolina	ABCR	AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Sintetizzatore di acidi nucleici	Applied Biosystems	-
DMT-dA(bz) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	A111081
DMT-dT Phosphoramidite	Sigma Aldrich
DMT-dG(dmf) Fosforamidite	Sigma Aldrich	G11508
DMT-dC(bz) Fosforamidite	Sigma Aldrich	C11108
Diluente amidite per la sintesi del DNA	Sigma Aldrich	L010010
Acetonitrile ultrapuro per la sintesi del DNA	Sigma	Aldrich L010400
Cap A	Sigma Aldrich L840000
Cap B	Sigma Aldrich	L850000
CPG dT Colonna 1.0 µ mole	Proligo Reagenti	T461010
CPG dA(bz) Colonna 1.0 µ mole	Proligo Reagents	A461010
CPG dG(ib) Colonna 1.0 µ mole	Proligo Reagenti	G461010
CPG dC(bz) Colonna 1.0 µ mole	Proligo Reagenti	C461010
ammoniaca (soluzione acquosa)	Fluka Dispositivi analitici	318612
centrifughi nanosep 0.45 µ m	Pall	ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazolo (Attivatore)	Sigma Aldrich	75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite	Chem Genes	ANP-7754
workup
vacuum concentrator	Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)rame(I) esafluorofosfato	Sigma Aldrich	346276
Acetato di sodio	Sigma Aldrich	S2889
(+)-Sodio L-ascorbato	Sigma Aldrich	A7631
EDTA sale disodico	Sigma Aldrich	E5134
TBTA-ligando	-	-	sintetizzato secondo una procedura di letteratura¹
HPLC
HPLC-system	Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spettrometro	Bruker Daltonics
LC-318 C18 colonna	Supelcosil via Sigma Aldrich	58368
determinazione della concentrazione
ND 1000 Spettrofotometro	nanodrop
preparazione del campione e spettroscopia
Cary 100 Bio	Varian
Fluoromax-3	fluorimetro Jobin-Yvon
¹ R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

Fisher Scientific diclorometano di T111081

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.

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Sintesi in fase solida Click chemistry Trasferimento di energia Spettroscopia di fluorescenza Marcatura di oligonucleotidi Ibridazione del DNA Imaging molecolare Spettroscopia di assorbimento

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