Articolo metodologico

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

DOI:

10.3791/54135

⸱

1 agosto 2016

 ,  , 
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'imaging FRET (Förster resonance energy transfer) è un potente strumento per studi di biologia cellulare in tempo reale. Qui viene presentato un metodo per l'imaging di cellule FRET in microambienti fisiologici tridimensionali (3D) di idrogel utilizzando la microscopia a epifluorescenza convenzionale. Viene descritta un'analisi per le sonde FRET raziometriche che produce rapporti lineari nell'intervallo di attivazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imaging di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è un potente strumento per l'esame biologia cellulare in tempo reale. Studi utilizzando FRET comunemente impiegano cultura bidimensionale (2D), che non imitano tridimensionale (3D) microambiente cellulare. Un metodo per eseguire le emissioni spento l'imaging FRET usando la microscopia convenzionale widefield epifluorescenza delle cellule all'interno di un ambiente idrogel 3D è presentato. Ecco un metodo di analisi per sonde FRET raziometriche che produce rapporti lineare nell'ambito delle di attivazione della sonda è descritta. La misurazione dei livelli intracellulari adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è dimostrato in condrociti sotto stimolazione forskolina utilizzando una sonda per EPAC1 attivazione (ICUE1) e la capacità di rilevare le differenze di cAMP segnalazione dipende dal tipo di materiale idrogel, qui un idrogel photocrosslinking (PC-gel, polietilene glicole dimetacrilato) e un idrogel thermoresponsive (TR-gel). Rispetto ai metodi 2D FRET,questo metodo richiede poco lavoro supplementare. Laboratori già utilizzano immagini FRET in 2D possono facilmente adottare questo metodo per eseguire studi cellulari in un microambiente 3D. Può inoltre essere applicato a vaglio di farmaci ad alto rendimento in microtissues 3D ingegnerizzati. Inoltre, è compatibile con le altre forme di immagini FRET, come la misurazione anisotropia e di imaging di fluorescenza vita (FLIM), e con le piattaforme avanzate di microscopia confocale utilizzando, ad impulsi, o l'illuminazione modulata.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

segnalazione cellulare è al tempo stesso complessa e consequenziale per numerosi campi, tra cui la farmacologia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. strumenti di sperimentazione utili sono necessari per migliorare la nostra comprensione della biologia cellulare e di sviluppare materiali ottimali per la rigenerazione dei tessuti. Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) di imaging è uno strumento essenziale che consente l'analisi di attivazione del recettore, la conformazione molecolare, e le interazioni supramolecolari (ad es., Proteine ​​/ DNA complessazione) in cellule vive. FRET è un tipo di trasferimento di energia non radiativa tra fluorofori 1. Ha una efficienza che è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra un fluoroforo donatore e accettore fluoroforo. Quindi, può fornire informazioni sulla distanza spaziale tra due molecole differenti o tra le regioni di una molecola alla scala nanometrica (tipicamente 1 - 10 nm) 2. I fluorofori donatore e accettore possono essere diversi mtipi olecule (etero-FRET), in cui il donatore ha la emissione di energia più elevata (più corta lunghezza d'onda), o dello stesso tipo (omo-FRET). FRET di immagini può essere eseguita su cellule fissate o vivi, ma in generale cellule fissate sono utilizzati per l'imaging di interazioni molecolari ad alta risoluzione spaziale quando i sistemi confocale ad alta velocità sono disponibili. Cellule vive sono utilizzati per studiare le interazioni ei processi che sono inibiti o alterato da fissaggio, come ad esempio il tempo reale di segnalazione intracellulare di risposta 3.

studi cellule vive che impiegano FRET uso di immagini bidimensionali (2D) colture cellulari in parte a causa della semplicità e minore sfondo (nessuna emissione di fuori delle cellule piane). Tuttavia, culture 2D alterano anche numerosi processi cellulari rispetto al microambiente fisiologica e tridimensionali (3D) coltura 4,5. Ad esempio, la cella originaria cellula e cellula di interazioni della matrice extracellulare sono drasticamente alterato nella cultura 2D che porta alle easglia cambiamenti nella morfologia cellulare e la polarità 6 osservato. Microdomini di membrana (ad es., Caveolae e lipidi zattere) e segnalazione dei recettori sono fortemente regolati dalla cultura ambiente, in parte perché si legano i componenti del citoscheletro 7,8 e la struttura delle cellule e la forma del citoscheletro sono fortemente regolati dalla cultura ambiente spaziale 9. Meccanotrasduzione non solo è influenzata dalla matrice 3D, ma più complesse condizioni di carico secondarie generato in ambienti 3D rispetto alle colture 2D 10. Infine, la permeabilità delle matrici 3D è inferiore al mezzo di coltura, in generale, con diminuzione diffusione e aumentato legame della cellula molecole di segnalazione rispetto alle colture 2D. Con culture 3D si è in grado di creare e osservare un microambiente più simile alla fisiologica rispetto al collante, chimica, e segnali meccanici. Cella per le interazioni delle cellule può essere promosso e le proprietà adesive possono essere controllati with la struttura, composizione e architettura (patterning) del materiale 3D 11-13. Le proprietà meccaniche del materiale possono altresì essere adattati dalla composizione e struttura 14,15. Coltura di cellule in idrogel pertanto permessi Fret studi su cellule primarie che sarebbero altrimenti de-differenziare o variazione fenotipo utilizzando tecniche convenzionali, ad es., Le cellule dalla cartilagine articolare. Pertanto, è necessario un metodo per consentire test FRET in colture 3D vivi.

ponteggi idrogel sono ideali per studi basati 3D FRET perché possono essere resi otticamente trasparente e adattati per controllare il microambiente e per fornire segnali cellulari. Gli idrogel a base di polimeri naturali sono stati utilizzati in coltura cellulare per decenni, tra gelatina e fibrina 16. Maggiore controllo microambiente cellulare può essere raggiunto con la modificazione chimica di questi polimeri e con l'uso di polimeri sintetici 17,18. hydrogel rigidità meccanica e permeabilità può essere controllata cambiando la composizione polimerica e dimensione (polimero e densità di reticolazione) 19,20 maglia. Inoltre, gli idrogel possono essere fatte bioattivo attraverso l'incorporazione di fattori di crescita e ligandi cellulari. A causa di queste possibilità, lo sviluppo di idrogel per biosensing, somministrazione di farmaci, e applicazioni di ingegneria tissutale è un'area di ricerca molto attiva 21. Stampa 3D di idrogel è inoltre in fase di sviluppo per la realizzazione di micro-tessuti e -organs 15. Così, FRET imaging cellule in idrogel non è solo utile come mezzo per approssimare comportamento cellulare fisiologica, ma anche come strumento per studiare e ottimizzare la crescita tessutale.

Binary sonde FRET raziometriche sono molto utili nello studio segnalazione cellulare e possono essere utilizzati in idrogel culture. Per un elenco parziale di fluorescenza pubblicato e ti agiti sonde, consultare il sito web del Consorzio cellulare migrazione 22. Il tipo di sonda più comune contiene due fluorofori diversi che sono associati o collegati da un elemento di riconoscimento (s) (regione sensibile analita). Queste regioni subiscono un cambiamento conformazionale, associazione o dissociazione al rilevamento dell'analita (ad es., Legame di uno ione o molecola, taglio enzimatico della regione) che altera la distanza tra fluorofori e quindi la grandezza FRET (superiori o inferiori) 23. Un tipo di sonda meno comune ma utile si basa su un cambiamento sensibile analita nella sovrapposizione spettrale dei due fluorofori, che altera FRET grandezza. "Single-chain" sonde raziometriche utilizzano una coppia fluoroforo legato su una singola molecola. "Dual-catena" sonde utilizzano coppie fluorofori su molecole separate, ma la loro espressione possono essere accoppiati con lo stesso cassetta di espressione 24. A differenza di studi con l'espressione unico fluoroforo (ad es., Proteine ​​di fusione fluorescenti), studi con raziometricosonde FRET non richiedono doppio trasfezione per il controllo di efficienza di trasfezione o vitalità cellulare. Sonde raziometriche FRET sono relativamente insensibili a efficienza di trasfezione quando espresso di sopra di una soglia minima (concentrazione insensitive) 23,25. Essi sono insensibili alle fluttuazioni sorgente di eccitazione e di altri fattori ambientali intracellulare (ad es., PH, ioni) così a lungo in quanto entrambi i fluorofori sono altrettanto reattivo. Inoltre, la risposta non è soggetta a ritardi trascrizionale, a differenza fluorescenti e bioluminescenti promotore-reporter di costrutti 26,27.

sonde raziometriche FRET sono facilmente e frequentemente utilizzati nei sistemi microscopio widefield epifluorescenza convenzionali. microscopi grandangolari sono preferiti rispetto ai sistemi confocale a scansione linea per l'imaging cellulare dal vivo a causa di preoccupazioni per i costi di sistema, fluoroforo candeggio, e la cattura di cambiamenti di segnale con risoluzione temporale sufficiente. Inoltre, singola cella analeYsis su una vasta popolazione di cellule è possibile con uno stadio e l'immagine di acquisizione motorizzato su più campi di vista. Widefield microscopia richiede un'analisi basata intensità dei segnali delle sonde etero-tasto. Anche se l'analisi intensità non richiede hardware complesse come altri metodi tasto, è necessario un maggiore lavoro di post-acquisizione per correggere gli effetti di comportamenti fluoroforo e configurazioni di sistema microscopio / di imaging 28. L'intensità di emissione catturato di un fluoroforo è una funzione dell'energia di eccitazione, fluoroforo resa quantica, e il filtro combinato e fotocamera / rivelatore di sensibilità spettrale e linearità 2. Questi possono essere dissimile per il donatore e accettore e richiederanno di calibrazione per l'analisi quantitativa. Inoltre, l'imaging dell'emissione accettore è influenzata dalla sovrapposizione spettrale dei fluorofori (eccitazione di accettore da donatore luce di eccitazione e sanguinare-through di emissione del donatore in spettri di emissione accettore) 2.4, a catena singola "sonde sono internamente normalizzati perché i loro fluorofori sono equimolare su scala nanometrica, mentre i fluorofori di" "possono esistere sonde in diversi stoichiometries tutta una cella 25,28 Se i fluorofori di." Dual-catena a catena singola " sonde di luminosità simile (funzione del coefficiente di estinzione e la resa quantica), gli effetti di sensibilità del rivelatore non lineari sono piccole e solo correzione per la fluorescenza di fondo e il quantum sensibilità rendimento / rivelatore accoppiato è necessario 23. Così "single-chain" sonde raziometriche FRET sono più facilmente implementati in widefield microscopia a 24.

Questo articolo descrive una tecnica semplice per eseguire FRET immagini di cellule vive in culture idrogel 3D utilizzando un microscopio convenzionale widefield epifluorescente. Può essere facilmente adottata dai laboratori già conducendo esperimenti FRET in 2D, ma anche laboratori interessati in Intersegnalazione cellulare in microtissues. Qui mostriamo il metodo con misurazione a base di imaging tasto della monofosfato ciclico adenosina (cAMP) livelli in condrociti vivi all'interno photocrosslinking (PC-gel, polietilene glicole dimetacrilato) e thermoresponsive (TR-gel, Matrigel) idrogel. Una sonda FRET raziometrica è utilizzato sulla base di EPAC1 (ICUE1) per rilevare i livelli di cAMP in risposta a forskolin, un agonista chimico per ciclasi che catalizza la conversione di ATP al campo. Camp è uno dei principali secondi messaggeri che mediano G protein-coupled segnalazione dei recettori e attiva vari fattori, tra cui le proteine ​​di scambio a valle direttamente attivati ​​da cAMP (EPACs). I fluorofori allontanano upon cAMP legame al dominio EPAC conseguente diminuzione FRET. Qui descritto è la preparazione dei materiali idrogel, trasfezione delle cellule con la sonda ICUE1, e l'inclusione delle cellule in idrogel 3D. La procedura esperimento 3D tasto e l'analisi delle immagini necessarieper valutare l'attività della sonda per cella sono spiegati. Discutiamo anche i limiti intrinseci di analisi FRET in 2D e 3D utilizzando la microscopia widefield. La tecnica qui presentata è un miglioramento rispetto ai metodi 2D esistenti in quanto consente l'analisi in un contesto più fisiologico e richiede meno correzione dell'immagine e la calibrazione. Grande utilità consiste nel fatto che molti materiali trasparenti possono essere utilizzati durante preferenze cellulari e trasfezione possono essere mantenute.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione dei materiali

  1. Preparare il polietilenglicole dimetacrilato (PEGDM, 4.000 mw) metacrilando il polietilenglicole secondo i metodi descritti da Lin-Gibson et al. 29. In alternativa, è possibile acquistare PEGDM.
  2. Sintetizzare il fotoiniziatore, il litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP), attraverso un processo in due fasi in cui prima il dimetilfenilfosfonito viene fatto reagire con il 2,4,6-trimetilbenzoilcoride tramite una reazione di Michaelis-Arbuzov e poi il sale di litio creato aggiungendo bromuro di litio in 2-butanone, in accordo con Majima et al.30.
    Nota: In alternativa, è possibile acquistare altri fotoiniziatori, ma il LAP mostra una migliore biocompatibilità ed efficienza di reticolazione31.
  3. Funzionalizzare i vetrini coprioggetti in vetro per consentire l'incollaggio dell'idrogel al vetro e quindi prevenire il movimento durante l'imaging.
    1. In una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, utilizzare il metacrilato di 3-(Trimetossisilil)propile secondo il protocollo del produttore per i gel PC e i silani epossidici (3-glicidossipropiltrimetossisilano) per i gel TR31. Nota: In alternativa, è possibile acquistare guide prerivestite. Si noti che il vetrino coprioggetto deve essere più grande del pozzetto del piatto PDMS al passaggio 3.8.

2. Trasfezione Cellulare

  1. In una cappa di coltura tissutale e utilizzando tecniche sterili, scongelare e piastrare le cellule desiderate in sub-confluenza (50 - 70%), in questo caso condrociti bovini a 15.000 cellule/cm2 in piastre di coltura non trattate a 6 pozzetti. Nota: È possibile utilizzare qualsiasi tipo di cella pertinente, comprese le celle indipendenti dall'ancoraggio.
    1. Lasciare che le cellule si riprendano per un giorno in un incubatore a 37 °C. Prima dei passaggi successivi, rimuovere il terreno, risciacquare con PBS e aggiungere 2 ml di terreno privo di fenolo e siero per pozzetto.
  2. Il giorno successivo per ogni pozzetto, aggiungere 100 μl di terreno privo di fenolo e siero e 3 μl di reagente di trasfezione in una provetta di vetro autoclavata. Per mescolare, agitare leggermente il tubo. Incubare a RT per 5 min. Limitare l'esposizione alla luce.
  3. Aggiungere 1 μg di DNA della sonda FRET e agitare leggermente. Incubare la miscela a RT e al riparo dalla luce per 30 min.
    Nota: In questo esperimento è stato utilizzato il plasmide ICUE1 (per gentile concessione del Dr. Jin Zhang33). I fluorofori in ICUE1 sono la proteina fluorescente ciano (CFP, donatore) e la proteina fluorescente gialla (YFP, accettore). Il rapporto tra il reagente di trasfezione e il DNA plasmidico dovrà essere regolato per una trasfezione ottimale di diversi tipi di cellule.
  4. Distribuire la miscela preparata (~104 μl) goccia a goccia in ciascuno dei 6 pozzetti contenenti le cellule più 2 ml di terreno privo di fenolo e siero. Non pipettare su e giù. Agitare delicatamente il piatto per mescolare.
  5. Incubare a 37 °C per 48 ore. Nota: La confluenza inibisce l'efficienza della trasfezione e altera l'espressione endogena dei recettori.

3. Fabbricazione di stampi PDMS per colata e coltura di idrogel

  1. Per preparare un vetrino di grandi dimensioni su cui colare il polidimetilsilossano (PDMS), pulire prima il vetro con sapone, sciacquare con abbondante acqua e poi asciugare con isopropanolo e poi con aria.
    1. Trattare il vetro con un reagente siliconato secondo il protocollo del produttore in modo che il PDMS possa essere facilmente rimosso dopo l'indurimento. Sciacquare il reagente residuo dalla superficie con toluene su un contenitore di raccolta. Lasciare asciugare completamente la superficie all'aria prima o utilizzare il calore a 100 °C per ridurre il tempo di attesa.
  2. Selezionare un'altezza dell'idrogel (ad esempio, 1 mm) e calcolare 1,2 volte il volume di PDMS necessario per coprire il vetrino con PDMS di questo spessore utilizzando le dimensioni del vetrino e l'altezza dell'idrogel. Nota: il PDMS non si restringe.
    1. Miscelare i componenti del kit PDMS in un rapporto 10:1 in peso in un becher. Una volta amalgamato bene, posizionare il becher sotto l'aspirapolvere domestico per degassare. Scaricare il vuoto se le bolle iniziano a traboccare dal contenitore e ripetere.
      Nota: Se non si utilizza la centrifugazione (passaggio 6.2) possono essere utilizzati altri spessori di idrogel, ma al costo di un aumento del fondo e dell'opacità.
  3. Avvolgere un foglio di alluminio attorno alla base e ai lati del bicchiere per contenere il PDMS. Versare con cura la quantità desiderata di PDMS degassato su questo bicchiere circondato da un foglio di alluminio. Misurare l'altezza del PDMS. Tieni presente che l'altezza del PDMS sarà l'altezza massima dell'idrogel. Se durante il versamento si creano delle bolle, degassodarle di nuovo o farle scoppiare con una spatola o un ago.
  4. Posizionare il PDMS non polimerizzato su una superficie piana in forno a 100 °C per 2 ore, oppure lasciare in RT per 24 ore.
  5. Rimuovere con cautela il PDMS dalla superficie una volta indurito. Perforare la forma desiderata (ad es. punzone cilindrico da 3 mm) per gli idrogel.
    Nota: la fotoreticolazione produrrà cilindri di PC-gel leggermente più stretti rispetto al diametro dello stampo a causa dell'estinzione della reazione da parte dell'ossigeno molecolare nel PDMS.
  6. Sterilizzare il PDMS perforato. Per esperimenti a breve termine, immergere il PDMS in etanolo al 70% per 1 ora.
  7. Assemblare lo stampo inserendo sulla base del PDMS sterilizzato un vetrino coprioggetti sterile di spessore corrispondente alla correzione dell'obiettivo del microscopio. Mettere da parte per l'uso al passaggio 6.
  8. Fabbricare un piatto PDMS più grande utilizzando i metodi sopra descritti (con un pozzo più largo e più alto dell'idrogel) per contenere l'idrogel e il terreno. Accogliere un volume medio almeno 10 volte superiore a quello dell'idrogel per immergere l'idrogel e ridurre al minimo la diluizione dell'analita.

4. Preparazione di soluzioni precursori di idrogel

  1. In una cappa di coltura tissutale e utilizzando tecniche sterili, preparare le soluzioni precursori dell'idrogel appropriate per lo studio immediatamente prima di aggiungere le cellule. Preparare il PC-gel dal precursore del polimero come segue.
    1. Miscelare la polvere di PEGDM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,2) al 10% (p/v).
    2. Aggiungere il fotoiniziatore (ad es. LAP) a una concentrazione finale di 0,005 - 0,01% (p/v) e miscelare mediante pipettaggio. Coprire la soluzione con un foglio di alluminio o proteggerla dalla luce poiché LAP è sensibile alla luce.
      Nota: qui viene utilizzata la matrice extracellulare a fattore di crescita ridotto TR-gel fornita dal produttore.

5. Sospensione cellulare in soluzioni di idrogel

  1. In una cappa di coltura tissutale e utilizzando tecniche sterili, aspirare il terreno dai pozzetti.
  2. Aggiungere il PBS ai pozzetti e quindi rimuovere per risciacquare accuratamente i monostrati di cellule attaccati.
  3. Dissociare le cellule dal substrato di coltura utilizzando da 2 a 3 ml per 25cm2 di soluzione di dissociazione cellulare. Agitare delicatamente, quindi incubare a 37 °C per 10 - 20 minuti o fino a quando non si dissocia. Picchiettare con decisione il piatto se necessario per rimuovere le cellule.
    Nota: sono disponibili soluzioni alternative di dissociazione cellulare con selezione limitata a quelle che non influenzano la via di segnalazione in analisi scindendo i recettori di interesse.
  4. Dopo che le cellule sono state staccate, aggiungere 2 ml di terreno privo di fenolo e siero, sospendere le cellule e contare le cellule con un emocitometro. Nota: può essere utilizzato anche un terreno privo di siero chimicamente definito (ad es. integrato con insulina, transferrina e selenio).
  5. Aliquotare il numero desiderato di cellule in fiale sterili e pellet in fiale e pellet (ad esempio, 2,0 x 106 cellule per fiala).
  6. Rimuovere il surnatante, aggiungere il volume desiderato di precursore dell'idrogel e sospendere le cellule mediante pipettaggio. Utilizzare un volume di precursore che produca 2 x 105 cellule/cm2 nel piano xy quando si visualizza l'asse z dell'idrogel come collassato (ad esempio, 1,0 ml per fiala per un idrogel di 1 mm di spessore contenente 2 x 106 cellule/ml). Fare attenzione a non produrre bolle.
    1. Passare rapidamente alla fase successiva per limitare gli effetti negativi sulla vitalità cellulare34.

6. Preparazione dell'idrogel

  1. In una cappa di coltura tissutale e utilizzando tecniche sterili, aggiungere il precursore dell'idrogel contenente cellule agli stampi di colata preparati nella fase 3 (ad esempio, 7,1 μl per stampo di 3 mm di diametro x 1 mm di altezza). Creare un idrogel aggiuntivo, secondo gli stessi metodi descritti, da utilizzare per la calibrazione del sistema di imaging al microscopio e per la calibrazione della sonda (se l'efficienza intrinseca della sonda è sconosciuta).
  2. Centrifugare il precursore dell'idrogel contenente la cellula preparata prima della gelificazione/reticolazione per ottimizzare l'imaging confinando le cellule su un singolo piano focale e riducendo al minimo il segnale fuori dal piano (Figura 1). Regolare il tempo e la forza di centrifugazione in base al tipo di cellula e alla viscosità del precursore (400 g per 4 minuti).
  3. Gel o reticolazione la soluzione
    1. Per l'idrogel PC-gel, irradiare il precursore contenente la cellula con una sorgente di luce UV-A (λ = 365 nm) per un tempo di esposizione pari a 3,2 J/cm2 per millimetro di spessore per fotoreticolare.
      Nota: Utilizzare uno spessore minimo di 1 mm nel calcolo. Le esposizioni dovrebbero essere comprese tra 1 e 5 minuti. Utilizzare il tempo di esposizione minimo. Evitare di irradiare eccessivamente le cellule in quanto ciò ridurrà la vitalità e sbiancherà il donatore di CFP. Tuttavia, si sconsiglia di utilizzare tempi di esposizione inferiori a 60 s perché l'irradiazione ad alta intensità porta all'autoestinzione radicale e alla scarsa vitalità cellulare.
    2. Per l'idrogel TR-gel, posizionare lo stampo riempito in una capsula di Petri e trasferirlo in un'incubatrice per gelificare termicamente. Incubare a 37 °C per 30 min.
  4. Dopo aver gelificato o reticolato l'idrogel, rimuovere lo stampo di colata dell'idrogel PDMS e sostituirlo con il piatto PDMS più grande preparato (dal passaggio 3.5). Premere il PDMS sul vetro con una spatola sterile per farlo aderire.
    1. Posizionare questa capsula PDMS con vetrino coprioggetti in un contenitore sterile, come una capsula di Petri. Aggiungere un terreno privo di fenoli privo di siero o un terreno chimicamente definito (terreno privo di siero integrato con insulina, transferrina e selenio (passaggio 5.4)) al pozzetto creato con la capsula PDMS e il vetrino coprioggetti per mantenere l'idrogel immerso. Incubare a 37 °C per 30 min.
      Nota: se si utilizza un piatto specializzato con un vetrino coprioggetti, posizionare il vetrino coprioggetti e aggiungere allo stesso modo il mezzo.
    2. In alternativa, eseguire questo passaggio il giorno prima dell'imaging FRET per consentire alle sonde di riprendersi poiché le lunghezze d'onda dell'irradiazione si sovrappongono allo spettro di eccitazione del donatore CFP.

7. 3D Imaging FRET

  1. Rimuovere la capsula PDMS con l'idrogel dalla capsula di Petri, preparata al punto 6.4, e fissarla in un portacampioni regolabile per il tavolino del microscopio XY (Figura 2). Posizionare il portacampioni sul tavolino del microscopio. Se necessario, applicare olio sull'obiettivo. Utilizzare un obiettivo di almeno 40X e di alta apertura numerica (NA) (cioè 1,3 NA) per catturare le emissioni relativamente deboli dei fluorofori.
  2. Configurazione dei campi visivi (FOV) per l'acquisizione delle immagini: selezionare le cellule per l'imaging utilizzando l'imaging a luce trasmessa e verificare la trasfezione con l'imaging a fluorescenza. Scegli almeno 15 celle diverse.
    1. Selezionare celle che non siano né troppo luminose né troppo deboli (che potrebbero altrimenti portare a sovrasaturazione della sonda o bassa sensibilità) e con il rapporto FRET compreso tra 0,0 e 1,0 (che altrimenti indica un danno o un decadimento della sonda binaria). Quindi spegnere la luce per limitare l'esposizione.
    2. Selezionare i FOV vicino al centro dell'idrogel e con le celle di interesse all'interno del campo di illuminazione relativamente piatto (vedere la Figura 3B e il passaggio 9.2 di seguito).
  3. Configurare le impostazioni della fotocamera per i canali immagine FRET. Scegli tra alcune celle vicino al centro del campo visivo per ottimizzare le "configurazioni ottiche" (ad esempio, esposizione e guadagno per canale dell'immagine).
    Nota: La nomenclatura seguente varia a seconda del software utilizzato per utilizzare il microscopio e la fotocamera. Il software del microscopio, NIS-Elements, viene utilizzato qui per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
    1. Per l'analisi FRET di sonde a catena singola, selezionare due canali di immagine per FOV: Emissione quenched (QE), che è l'emissione del donatore sotto eccitazione del donatore e Emissione dell'accettore sotto eccitazione dell'accettore (Aem).
      Nota: Per la sonda ICUE1 CFP-YFP vengono utilizzate una coppia di filtri di eccitazione ed emissione CFP per QE (418 - 442 ex, 458 - 482 em) e una coppia di eccitazione ed emissione YFP per Aem (490 - 510 ex, 520 - 550 em).
    2. Impostate l'esposizione per QE e Aem in modo che acquisiscano la massima intensità del segnale senza saturazione (e se si utilizza un CCD, con il minimo guadagno possibile) per ridurre al minimo il rumore di fondo. Mantenere le configurazioni ottiche le stesse sia per i fluorofori che per tutto l'esperimento, nonché tra i gruppi sperimentali per evitare di distorcere i risultati (ad esempio, potenza di eccitazione, dimensione dell'iride, esposizione e guadagno della fotocamera) (Figura 3A).
    3. Acquisire canali di immagine aggiuntivi per consentire più opzioni di analisi dopo l'acquisizione (ad esempio, imaging a emissione sensibilizzata corretta (cSE) (vedere la discussione)). Per la sonda ICUE1 CFP-YFP, acquisire i canali di eccitazione (Ex) ed emissione (Em) delle configurazioniDonatore Ex -Donatore Em (QE, selezionare CFP-CFP nel software del microscopio),Donatore Ex -Accettore Em (SE, selezionare CFP-YFP),Accettore Ex -Accettore Em (Aem, selezionare YFP-YFP) eAccettore Ex -Donatore Em (YFP-CFP) (Vedere Figura 3A).
  4. Configura la velocità di acquisizione per l'acquisizione di immagini time-lapse.
    1. Diminuire la velocità di acquisizione se limitata dall'hardware. Per i saggi a breve termine (ad esempio, 30 - 60 minuti), indicare circa 12 acquisizioni al minuto per ciascun FOV (frequenza di campionamento di 5 secondi) per acquisire la cinetica di segnalazione. Utilizzare la frequenza di campionamento minima necessaria per evitare di sbiancare significativamente la sonda.
    2. Impostare la velocità di acquisizione digitando la periodicità delle acquisizioni nel software del microscopio. Per i test a lungo termine (ad esempio, 24 ore), iniziare con un'elevata velocità di acquisizione per acquisire la risposta iniziale dell'impulso e quindi passare a una velocità di acquisizione bassa, ad esempio ogni 5-10 minuti.
  5. Selezionare "Esegui ora" nel software del microscopio per avviare l'acquisizione delle immagini e acquisire le immagini per 5 minuti per stabilire una linea di base per la risposta della sonda ai FOV designati.
  6. Dopo 5 minuti dall'acquisizione dell'immagine, pipettare l'analita agonista o antagonista desiderato (ad es. Forskolina a 100 nM), miscelare mediante pipettaggio e continuare l'imaging.

8. Calibrazione FRET

  1. Calibrazione del sistema: utilizzare l'idrogel di calibrazione aggiuntivo, fabbricato come descritto nel passaggio 6, per acquisire immagini Aem di almeno 6 celle rappresentative utilizzando gli stessi criteri FOV, configurazioni ottiche e impostazioni della fotocamera utilizzati per l'imaging FRET di cui sopra (passaggi 7.1, 7.2 e 7.3).
    Nota: la quantificazione della resa quantica e della sensibilità spettrale (QS) per il sistema combinato di imaging con sonda e microscopio è necessaria per l'analisi FRET "assoluta", ma non per la FRET "relativa".
    1. Fotobleach il fluoroforo accettore selezionando un'esposizione lunga di 5 minuti alla luce di eccitazione alla massima intensità (eccitazione sul canale Aem). Usa un'apertura stretta per sbiancare solo le celle di interesse. Verifica che il segnale Aem sia inferiore di almeno il 10% rispetto al segnale originale confrontando l'istogramma dell'intensità del segnale (finestra "LUT") prima e dopo il fotosbiancamento. Continuare il photobleaching se la perdita di segnale è inferiore al 90%.
      Nota: Assicurarsi che il fluoroforo del donatore non venga sbiancato durante questa procedura utilizzando filtri di eccitazione Aem che non si sovrappongano allo spettro di eccitazione del donatore.
    2. Acquisire l'emissione del donatore sotto eccitazione del donatore con il fluoroforo accettore (Dem) ora sbiancato utilizzando la stessa configurazione ottica del QE al punto 7.3.
    3. Calcola QS per pixel come Dem diviso per Aem dopo la correzione dello sfondo, come nella Sezione 9 di seguito. QS = Dem/Aem
    4. Calcola il QS medio tra le cellule dalle medie cellulari.
  2. Stimare l'efficienza FRET intrinseca della sonda (Ei) utilizzando il campione di calibrazione. Indurre il FRET massimo della sonda e calcolare Ei = 1 - QE/(Aem x QS) come nella sezione 9 di seguito. In alternativa, utilizzare Ei = cSE/Aem, o Ei calcolato utilizzando un saggio finale convenzionale per l'efficienza FRET con Ei = 1 - (QE/Dem).
    Nota: Ei è necessario per quantificare la frazione assoluta delle sonde attivate (FAP, cioè frazione dell'analita legante le sonde), ma non è necessario per l'analisi FRET "relativa".
    1. Saturare la risposta della sonda stimolando la coltura con un agonista di produzione/attivazione dell'analita per le sonde che aumentano di FRET in seguito all'interazione con l'analita.
    2. Inibire l'interazione della sonda con l'analita utilizzando un antagonista della segnalazione per le sonde che diminuiscono di FRET dopo il legame dell'analita. Nota: nel caso della sonda ICUE1, sopprimere i livelli di cAMP con un inibitore dell'adenilciclasi come la 2′,5′-dideossiadenosina (specifica) o la 3-isobutilil-metil-xantina (non specifica).

9. Calcolo del rapporto FRET

  1. Disegnare e designare una regione di interesse (ROI) per campo visivo vicino alle celle per definire il livello di sfondo (Figura 3B) in ciascun campo visivo nel tempo, ma limitare il ROI all'area di illuminazione relativamente omogenea al centro dell'immagine (Figura 4A). Vedere la discussione per una spiegazione delle opzioni di correzione dello sfondo.
    1. Con il software del microscopio: selezionare la freccia sull'icona "ROI sfondo" e selezionare "Disegna ROI sfondo ellittico" (altre forme funzioneranno). Assicurati che l'opzione "Continua ad aggiornare lo scostamento in background" sia selezionata. Attiva la visualizzazione del ROI in background facendo clic sull'icona ROI in background. In alternativa, utilizzare l'icona ROI e le proprietà ROI impostate come "Usa come ROI in background" e "Le ROI sono diverse in ogni multipunto".
    2. Con ImageJ: utilizzare la barra degli strumenti per selezionare lo strumento di disegno circolare. Quindi aggiungi la forma al ROI Manager tramite il menu "Analizza→ Strumenti→ ROI Manager". Se lo si desidera, imposta un colore diverso per la ROI di sfondo in ROI Manager.
    3. Per ogni FOV e canale immagine (ad esempio, QE e Aem), sottrarre il valore medio all'interno del ROI di sfondo per punto temporale per creare un'immagine corretta per canale, ad esempio, sQEt,p = QEt,p - bQEt,p dove t è il tempo di acquisizione, p è il FOV (cioè la posizione xy) e bQE e bAem sono i valori scalari del segnale all'interno del ROI di fondo. Utilizzare le funzioni aritmetiche delle immagini disponibili nel software.
      1. Con il software del microscopio, utilizzare l'icona "Sfondo ROI" e selezionare "Sottrai sfondo utilizzando ROI". Nella finestra pop-up, seleziona "Ogni immagine" in "Sottrai ROI sfondo su" e seleziona "Tutti i fotogrammi" in "Applica a".
        Nota: Affinché questa funzione funzioni correttamente, è necessario definire una ROI in background in ogni FOV (ad esempio, la funzione non sottrae correttamente gli sfondi per il FOV con ROI in background se alcuni FOV hanno ROI in background non definite).
      2. Con ImageJ, utilizzare la macro "Sottrazione BG da ROI" scritta da Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Salvare la serie temporale corretta delle immagini selezionando "Salva con nome" per i passaggi di analisi successivi.
  2. Definire una ROI intorno alla cella utilizzando una maschera binaria per ogni cella in analisi in ciascun FOV (Figura 4B). Utilizza il canale Aem per applicare una soglia all'immagine per FOV all'inizio dell'esperimento, identificare i limiti delle celle e definire le ROI. Risparmia il ROI.
    1. Con il software del microscopio: per ogni fotogramma (ad es. FOV), utilizzare prima il menu "Binario→ Definisci soglia" e selezionare "applica al fotogramma corrente". Regolare il valore di soglia inferiore per selezionare le celle. Quindi, utilizzare la funzione "Binario→ Chiudi" per riempire i buchi nella maschera binaria, se necessario. Quindi, utilizzare l'icona ROI per selezionare "Copia binario in ROI"; Il livello binario viene eliminato automaticamente.
      1. Aggiungi le ROI per i frame successivi al pool di ROI esistente. Elimina eventuali ROI spuri. Quindi fai "clic con il pulsante destro del mouse" sulle ROI e assicurati che le loro proprietà siano "Usa come ROI standard" e "Le ROI sono diverse in ogni multipunto".
      2. Con ImageJ: per ogni campo visivo, utilizzare prima il menu "Immagine→ Regola→ Soglia". Quindi utilizzare "Analizza→ Analizza particelle" con l'opzione Mostra contorni e Aggiungi a Manager selezionata. Utilizzare "Binario→ Chiudi" per riempire i "buchi" nella maschera binaria, se necessario. Elimina i ROI spuri. Sono disponibili plugin gratuiti per automatizzare questo processo.
  3. Calcolare il rapporto FRET basato su QE per ogni pixel, sQE/sAem per l'analisi relativa (vedere il passaggio 10) e EQE = sQE/(QS x sAem) per l'analisi assoluta (vedere il passaggio 10) con QS ottenuto nel passaggio 8.1. Usa la divisione in virgola mobile delle immagini. Si veda la sezione di discussione per una spiegazione delle derivazioni del rapporto.
    1. Con il software del microscopio: utilizzare il menu "Immagine →Operazioni con le immagini" e selezionare "Floating Point".
    2. Con ImageJ: utilizzare la funzione "Elabora →Calcolatore di immagini" o il plug-in "Calculator_Plus.java". Nota: In alternativa, la macro "pH_ratioMacro".txt" può essere adattata per calcolare i rapporti FRET. Utilizza la macro di correzione dello sfondo descritta sopra ed è disponibile all'indirizzo
  4. Esporta il rapporto medio per cella (cioè per ROI) in un foglio di calcolo e in un software di grafica.
    1. Con il software del microscopio: utilizzare il pulsante di esportazione ND nel controllo di analisi "Statistiche ROI" o il pulsante "Esportazione foglio di calcolo" nel controllo di analisi "Analisi temporale".
    2. Con ImageJ: selezionare prima il menu "Analizza →Imposta misure" e assicurarsi che siano selezionati "Valore medio" e "Deviazione standard". Quindi utilizza il ROI Manager e seleziona il pulsante "Misura". Salva la finestra dei risultati generati.

10. Analisi del rapporto FRET

  1. Calcola il rapporto FRET cellulare medio nel tempo dai rapporti medi per cella (esportati nel passaggio 9.4). In questo calcolo si considerino i rapporti FRET di base (il rapporto prima della somministrazione dell'analita).
    Nota: qui vengono utilizzati fogli di calcolo e software grafici per tracciare i rapporti FRET medi sottratti dalla linea di base e il loro errore standard della media (SEM) utilizzando una regressione lineare sulla linea di base come nei passaggi 10.1.2 e 10.1.3 di seguito (Figure 5 e 6).
    1. Analisi relativa (entità della risposta): normalizza ogni curva in un campione di riferimento comune (ad esempio, campione non trattato).
    2. Analisi assoluta (andamento temporale della risposta): sposta le curve su un punto di partenza comune normalizzando ogni curva con il suo rapporto FRET di base.
      1. Nel foglio di calcolo e nel software di creazione di grafici, interfoliare i dati (colonne con rapporti medi per cella) con nuove colonne, in modo che ogni colonna originale sia abbinata a una nuova colonna contenente solo i dati del rapporto per il periodo di riferimento (rapporti prima dell'aggiunta dell'analita). Seleziona "Inserisci colonna" per inserire una colonna vuota dopo ogni colonna di dati. Copiare quindi i dati della baseline nelle colonne vuote abbinate.
      2. Nel foglio di calcolo e nel software di grafica, selezionare "Inserisci → nuova analisi → trasforma Rimuovi linea di base", quindi impostare "Colonna selezionata" su "ogni altra", selezionare "presumere che la linea di base sia lineare" e selezionare "Differenza" in "Calcolo".
      3. Calcola il rapporto cellulare medio e le statistiche descrittive. Nel foglio di calcolo e nel software di grafica, selezionare "Inserisci → nuova analisi → analisi XY → medie di righe con SD o SEM" e quindi selezionare "Medie di righe con SEM" nella finestra pop-up.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i precursori di idrogel, le cellule e gli stampi di colata sono stati preparati come descritto sopra. Le soluzioni precursori cariche di cellule sono state fuse in stampi PDMS e quindi centrifugate prima della gelificazione/fotoreticolazione per immobilizzare le cellule vicino al vetrino coprioggetti e facilitare l'analisi dell'imaging FRET (Figura 1). Gli idrogel con vetrini coprioggetti attaccati sono stati posizionati all'interno di pozzetti di imaging PDMS preparati per l'imaging microscopico (Figura 2). Le configurazioni ottiche e i parametri di acquisizione delle immagini sono stati quindi impostati come mostrato nella Figura 3A. È stata dimostrata l'acquisizione di tutti e quattro i canali di immagine relativi a FRET per le coppie di fluorofori CFP-YFP (vedere la sezione "Conf. ottica" nella Figura 3), come è necessario per le sonde non binarie. Tuttavia in questo lavoro sono necessarie solo due immagini per la sonda ICUE1 binaria a catena singola, QE = "CFP CFP" e Aem = "YFP YFP" (emissione di eccitazione). Sono stati selezionati FOV multipli (posizioni xy) in cui diverse cellule risiedevano all'interno dell'area di illuminazione omogenea (Figura 3B). Dopo l'acquisizione time lapse, i dati del segnale per la sonda sono stati esportati. Le ROI per la correzione dello sfondo dei segnali dei canali e per l'analisi delle cellule sono state designate utilizzando immagini Aem con soglia dall'inizio degli esperimenti (Figura 4). Le cellule sono state selezionate all'interno del pool di cellule come quelle che esprimono una sonda sufficiente (non troppo debole), ma non troppo alta (eccessivamente luminosa) (Figura 4B). I rapporti FRET QE e SE per pixel ad ogni acquisizione sono stati calcolati utilizzando la divisione in virgola mobile dei canali dell'immagine sottratti dallo sfondo. Il rapporto FRET medio per cellula (cioè per ROI) è stato calcolato, normalizzato al segnale basale prima della stimolazione (cioè una regressione sulla linea di base sottratta da tutti i punti temporali) e tracciato con barre di errore come errore standard della media (SEM). Sia il rapporto FRET basato su QE che cSE rileva l'aumento dell'attività del cAMP nei condrociti sotto stimolazione con forskolina (100 nM, Figura 5). Il rapporto FRET QE era più sensibile alla correzione di fondo rispetto al rapporto FRET cSE perché il segnale QE era più basso a causa del basso livello basale di attività del cAMP nei condrociti incorporati all'interno degli idrogel. Entrambi i tipi di idrogel (TR-gel e PC-gel) hanno mostrato un aumento del rapporto FRET nel tempo (Figura 6), indicando un aumento della risposta di segnalazione del cAMP all'aggiunta di Forskolina. Come indicato dal rapporto FRET QE, i condrociti negli idrogel PC-gel mostrano una maggiore variazione del cAMP (mostrato) e un livello basale più elevato di cAMP (EQE = 0,19 in PC-gel vs. EQE = 0,09 in TR-gel, non mostrato nella figura sottratta al basale).

figure-results-1
Figura 1: Distribuzione cellulare nell'idrogel fotoreticolato (PC-gel)
R: Il precursore dell'idrogel carico di cellule è stato centrifugato per massimizzare il numero di cellule su un piano focale vicino al vetrino coprioggetti. B: Questo aumenta il numero di celle nel FOV e riduce al minimo il segnale di fondo proveniente da celle fuori piano. (Barra della scala = 200 μm) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Idrogel in piastra PDMS
L'idrogel è stato posizionato all'interno di un pozzetto PDMS alto (10 volte il volume di idrogel) con una base di vetrino coprioggetti per l'imaging microscopico e la stimolazione dell'analita. Gli idrogel PC-gel sono trasparenti e legati al vetrino coprioggetti in modo che rimangano in posizione per tutta la durata del test. Il pozzetto PDMS può essere ingrandito per contenere 10 volte più terreno rispetto al volume dell'idrogel utilizzando un punzone per biopsia più ampio oltre a un foglio PDMS più spesso. (Barra della scala = 2 mm) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Configurazione di acquisizione per FRET Imaging
R: L'acquisizione è stata configurata per l'acquisizione di immagini ogni 7 secondi in più posizioni. Per il calcolo del rapporto FRET QE, sono necessari solo due canali di immagine per la sonda ICUE1 utilizzata qui (sonda binaria a catena singola), QE = "CFP CFP" e Aem = "YFP YFP" (emissione di eccitazione) nella colonna "Optical Conf." nella scheda λ del software del microscopio. B: Sono stati selezionati FOV (posizioni "XY") in cui diverse celle risiedevano all'interno dell'area di illuminazione omogenea. Il grafico sotto l'immagine mostra l'intensità dell'illuminazione lungo la linea con la freccia blu che attraversa il centro del campo visivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Selezione delle ROI per l'analisi di imaging FRET <br /> R: È stata selezionata una regione di interesse (ROI) priva di celle per correggere il segnale di fondo su ciascun canale. Un'immagine di un idrogel privo di cellule può invece essere utilizzata per la sottrazione di fondo se la densità o la migrazione cellulare è elevata, o se non viene utilizzata una maschera ombreggiante quando le cellule non si trovano all'interno di un campo di illuminazione omogeneo. B: Le ROI delle celle sono state selezionate utilizzando la soglia dell'immagine e il mascheramento binario del canale Aem. La selezione di un ROI maggiore di quello delle celle influenzerà negativamente il calcolo del rapporto FRET medio per cella a causa dell'inclusione di rapporti extracellulari generati dal rumore di fondo. Il calcolo del rapporto FRET cellulare utilizzando la media di ciascun canale per cellula non è raccomandato in quanto ciò sottostima il rapporto. (Barra della scala = 50 μm) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Confronto dei rapporti FRET nell'idrogel termoreattivo (TR-gel)
Entrambi i rapporti FRET basati su QE e SE rilevano l'aumento dell'attività del cAMP nei condrociti sotto stimolazione con forskolina . La forskolina è un agonista dell'adenilciclasi che induce la produzione di cAMP. Il FRET diminuisce quando la sonda ICUE1 lega il cAMP, e quindi il rapporto FRET QE (EQE = sQE/(sAem x QS)) aumenta. Al contrario, il rapporto FRET SE diminuisce e viene quindi tracciato come ESE = 1 - cSE/sAem. Nei condrociti inclusi in idrogel, il rapporto FRET QE è più sensibile alla correzione del fondo rispetto al rapporto FRET SE perché il segnale QE è basso a causa della bassa attività basale del cAMP. Barre di errore = SEM, n = 25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Confronto del rapporto FRET in diversi idrogeli
I condrociti in entrambi i tipi di idrogel hanno risposto alla stimolazione con forskolina con un aumento dell'attività del cAMP, come dimostrato dall'aumento del rapporto QE FRET nel tempo. Il tipo di idrogel influisce sulla risposta cellulare attraverso diversi effetti, tra cui differenze nella permeabilità alla forskolina e nell'attività del cAMP cellulare basale (EQE = 0,19 in PC-gel vs. EQE = 0,09 in TR-gel, non mostrato). Barre di errore = SEM, n per TR-gel = 25, n per PC-gel = 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro dimostra come l'imaging FRET possa essere utilizzato per analizzare la segnalazione cellulare negli idrogel 3D. Mentre studi precedenti hanno dimostrato l'imaging FRET di cellule seminate su substrati di idrogel35-37, di interazioni extracellulari con idrogel38 e di molecole intrappolate in idrogel39-41, questa è la prima pubblicazione a descrivere l'analisi intracellulare basata sull'imaging FRET di cellule incorporate in idrogel 3D. Il lavoro risolve diversi problemi di implementazione durante la traduzione dell'imaging FRET da 2D a 3D. In primo luogo, sono necessari obiettivi ad alta apertura numerica affinché l'imaging FRET raccolga un segnale di emissione sufficiente, ma limitano la profondità di campo. Le celle qui vengono lasciate depositare leggermente tramite centrifugazione per aumentare il numero di celle in un piano focale vicino al vetro per compensare questo. In secondo luogo, gli scaffold 3D in idrogel possono spostarsi attraverso il campo visivo durante l'imaging, complicando l'analisi. Gli idrogel qui sono legati al vetrino coprioggetti in modo che rimangano fissati per tutta la durata dell'esperimento. In terzo luogo, la selezione di composizioni di idrogel appropriate per il FRET 3D è essenziale perché gli idrogel possono ostacolare la visualizzazione delle cellule. Qui vengono utilizzati idrogel trasparenti di PC-gel e TR-gel. Tuttavia, la raccolta delle cellule con centrifugazione su un piano focale vicino al vetrino coprioggetti può essere utilizzata per visualizzare le cellule in idrogel con diffrazione più elevata. La scelta dell'idrogel dipende dalle condizioni del microambiente che devono essere simulate, che si possono trovare in una recensione sugli idrogel42. In quarto luogo, qui viene impiegato un calcolo alternativo per il rapporto FRET della sonda ICUE1 a catena singola (cioè EQE = QE/cAem) per ridurre al minimo il numero di canali di immagine necessari per l'analisi e quindi ridurre al minimo il fotosbiancamento. Il rapporto FRET medio per cella viene calcolato come la media dei rapporti per pixel all'interno di una cella per ridurre al minimo la sottostima del rapporto FRET effettivo. Infine, viene descritta un'analisi raziometrica lineare e i mezzi per calcolare la frazione attivata di sonde binarie a catena singola.

Ci sono diversi aspetti critici per eseguire esperimenti FRET di successo utilizzando la microscopia a campo largo. Per quanto riguarda l'hardware, la telecamera deve essere sufficientemente sensibile da risolvere piccoli cambiamenti di segnale, lasciando le nuove telecamere CMOS scientifiche e i CCD a moltiplicazione di elettroni più adatti rispetto ai CCD convenzionali. Per analizzare al meglio la distribuzione spaziale del rapporto FRET, la camera deve possedere almeno il doppio della risoluzione spaziale della funzione di diffusione del punto dell'obiettivo (criterio di Nyquist). Ciò rende i sistemi a doppia vista meno adatti all'attività. Più cruciale è selezionare un'esposizione appropriata e una velocità di acquisizione dell'immagine per la data coppia di FRET in modo da ridurre al minimo il fotobleaching dei fluorofori. Si consiglia di ridurre il tasso di acquisizione all'aumentare della durata dell'esperimento. L'uso di ruote portafiltri rapide aumenta la velocità di acquisizione e il numero di FOV per l'analisi, evitando i problemi di registrazione delle immagini con i cubi filtro a doppia visualizzazione e a torretta. Il campo di illuminazione disomogeneo complica la correzione della fluorescenza di fondo che deriva dall'autofluorescenza del campione e dal rumore del sistema di telecamere. Alcuni idrogel, in particolare quelli contenenti proteine collageniche, sono altamente autofluorescenti43,44. I rapporti FRET sono sottostimati senza correzione di fondo. Qui impieghiamo un semplice metodo di correzione dello sfondo che si basa sul campo di illuminazione relativamente piatto che spesso può essere configurato con l'illuminazione a epifluorescenza al centro dell'immagine (Figura 3B, Passaggio 7.2). Questo metodo quindi limita le celle di interesse a quelle all'interno di questo campo di illuminazione. La correzione di fondo qui descritta non tiene conto dell'autofluorescenza cellulare nelle lunghezze d'onda lette per la sonda binaria. In tal caso, le cellule non marcate (nessuna trasfezione della sonda) devono essere visualizzate nelle stesse condizioni e lo sfondo deve essere sottratto. È possibile utilizzare una combinazione di celle etichettate e non etichettate e selezionare le celle non etichettate per il ROI di base. I metodi alternativi che prevedono l'analisi delle cellule sull'intero campo dell'immagine includono l'uso di una maschera di ombreggiatura, ROI di sfondo multipli o campioni identici senza celle e un protocollo è disponibile su richiesta.

Specificamente per l'imaging FRET 3D, la risposta della sonda è altamente sensibile alla permeabilità dell'idrogel all'analita (Figura 6). Pertanto, le stesse regioni di idrogel vengono confrontate tra trattamenti sperimentali, preferibilmente in un punto di simmetria geometrica come vicino al centro dell'impalcatura come usato qui. In alternativa, possono essere impiegate camere microfluidiche/bioreattori per perfondere rapidamente e uniformemente l'idrogel con la soluzione di analita45. Un segnale FRET potrebbe non essere rilevato (il rapporto segnale/rumore è troppo basso) quando l'autofluorescenza dell'idrogel è troppo alta; Dovrebbe essere utilizzato un idrogel più sottile o una sonda diversa (fluorofori diversi). Per quanto riguarda l'imaging FRET 3D in idrogel fotoreticolati, si raccomanda l'uso di un'esposizione minima all'irradiazione e di lunghezze d'onda al di fuori degli spettri di eccitazione dei fluorofori della sonda. Il LAP può essere utilizzato con una sorgente di luce visibile a 405 nm per ridurre ulteriormente il potenziale danno cellulare31,46. Tuttavia, si consiglia di utilizzare il LAP con irradiazione a 365 nm perché riduce al minimo lo sbiancamento della sonda. 365 nm si trovano all'estremità finale dello spettro di eccitazione del donatore di CFP, mentre 405 nm si trovano al picco di eccitazione. In alternativa, l'espressione della sonda può essere lasciata recuperare per un giorno. L'uso di sonde binarie riduce al minimo i problemi di sensibilità alle differenze nei livelli di espressione e nella diffusione molecolare dei fluorofori donatori e accettori. Possono essere utilizzate sonde non binarie, ma con SE invece dell'imaging QE e correzione aggiuntiva per il bleed-through spettrale degli spettri di eccitazione ed emissione (vedi sotto). Inoltre, la scarsa disponibilità commerciale e la complessità nella progettazione delle sonde FRET possono essere un ostacolo. Il fattore più critico per il successo degli esperimenti rimane la corretta correzione e analisi dei segnali di fluorescenza.

Un calcolo alternativo del rapporto FRET viene utilizzato per diversi motivi aggiuntivi oltre alla minimizzazione del fotobleaching. Per le sonde binarie a catena singola, il rapporto comunemente riportato è l'emissione accettore sotto eccitazione del donatore (emissione sensibilizzata, SE) e l'emissione del donatore sotto eccitazione del donatore (emissione quenched, QE), cioè il rapporto FRET = SE/QE25,47,48. SE/QE non è lineare rispetto alle variazioni dell'efficienza FRET21,22,47. Vale a dire, il rapporto ha una relazione esponenzialmente non lineare con l'efficienza FRET intrinseca della sonda (Ei) (Donius, A. E., Taboas, J. M. lavoro non pubblicato. (2015)), con il rapporto più lineare per Ei inferiore a circa il 15%. SE/QE sottostimerà anche la frazione di sonde attivate (FAP, cioè frazione di analita legante le sonde). Pertanto, l'analisi di SE/QE richiede un ingombrante studio dose-risposta all'equilibrio e l'adattamento della curva. Fortunatamente, i rapporti tra SE o QE e l'emissione accettore sotto eccitazione accettore (Aem) sono lineari rispetto all'Ei e al FAP, cioè i rapporti FRET SE/Aem e QE/Aem. SE/Aem viene spesso utilizzato per le sonde binarie e richiede solo la calibrazione dell'endpoint (in assenza di attività della sonda e con piena attività della sonda), ma la segnalazione cellulare basale rende difficile questa operazione. Per eliminare la necessità di calibrazione del punto finale, l'SE può essere corretto (cSE) per la sovrapposizione spettrale degli spettri di eccitazione ed emissione del donatore e dell'accettore (spectral bleed-through) e per la resa quantica e la sensibilità spettrale (QS) dei fluorofori a sonda combinati e del sistema di imaging al microscopio. Il rapporto FRET SE corretto basato su cSE definisce l'efficienza FRET osservata delle sonde all'interno di ciascun pixel di un'immagine, ovvero ESE = cSE/Aem. Sono disponibili software commerciali e gratuiti per correggere SE per questi effetti e il lettore è rimandato al lavoro di Chen e Periasamy 2006 per una spiegazione dettagliata dei metodi50. Tuttavia, il calcolo di ESE richiede l'acquisizione di tre canali di immagine per punto temporale (SE, QE, Aem). Pertanto, in questo lavoro impieghiamo anche un rapporto FRET alternativo EQE = 1 - QE/cAem, che richiede l'acquisizione di soli due canali di immagine (QE e Aem). Il calcolo di EQE da questi canali richiede solo la correzione di Aem per QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem/Aem è facilmente stimabile utilizzando due immagini da un campione di calibrazione, dove Dem è l'emissione del donatore sotto eccitazione del donatore con accettore sbiancato. Il FAP in qualsiasi istante può essere calcolato confrontando ESE o EQE con l'Ei della sonda.

In definitiva, la selezione del rapporto FRET (ESE = cSE/Aem vs. EQE = QE/cAem) dovrebbe basarsi sulla considerazione del tipo di sonda e dei canali con il segnale migliore. Entrambi gli approcci includono la correzione del rumore di fondo delle immagini per fotogramma, come descritto sopra, per tenere conto dei cambiamenti nell'autofluorescenza nel tempo. Si presume che non ci sia alcuna sovrapposizione della luce di eccitazione Aem nello spettro di eccitazione Dem, cosa che spesso accade a causa del design della sonda e della configurazione del filtro del microscopio. Le sonde a catena singola possono utilizzare entrambi e la selezione si basa sul miglior segnale della sonda (luminosità) rispetto al rumore della telecamera e al segnale di fondo sui canali SE e QE. Per la sonda ICUE1 e le condizioni sperimentali utilizzate qui (tipi di cellule e idrogel), SE ha un segnale più forte del QE. Le sonde a doppia catena richiedono l'uso di ESE a causa della distribuzione non equimolare dei fluorofori donatori e accettori. Per le sonde che diminuiscono di FRET dopo il legame dell'analita, come ICUE1, l'efficienza FRET può essere "invertita" per presentare una variazione positiva del segnale dopo il legame dell'analita, come facciamo qui, con ESE = 1 - cSE/Aem o EQE = QE/(Aem x QS).

L'analisi del FAP è sensibile alla corretta correzione dei rapporti FRET e alla stima dell'Ei. Può essere stimato con lo stesso campione di calibrazione utilizzato per il QS e un saggio di efficienza FRET con endpoint convenzionale come Ei = 1-(QE/Dem) (immagine QE seguita da fotobleaching accettore e un'immagine Dem)28, ma è necessario prestare attenzione per ridurre al minimo lo sbiancamento accidentale del donatore. Descriviamo una versione modificata in cui viene sostituita la stima di Dem basata su Aem rettificato per QS, ovvero Ei = 1 - (QE/(Aem x QS)). In alternativa, è possibile utilizzare Ei = cSE/Aem. La stima dell'Ei nelle cellule viventi richiede che tutte le sonde siano guidate al FRET completo. Questo è difficile da ottenere nella pratica per le sonde, come ICUE1, che diminuiscono di FRET dopo aver legato l'analita. Un calcolo in vitro dell'Ei utilizzando lisati cellulari e analita purificato è il migliore, ma al di fuori dell'ambito di questo lavoro. Qui si consiglia di utilizzare la 2',5'-dideossiadenosina per ridurre il cAMP nelle cellule. Tuttavia, un FAP relativo può essere calcolato utilizzando una stima dell'Ei derivata dal livello di riferimento della segnalazione. Per questi motivi, gli studi riportano più spesso il rapporto FRET (come fatto qui) o un FAP relativo basato sulla calibrazione dell'endpoint, dove la linea di base di segnalazione prima dell'aggiunta dell'agonista è il limite inferiore e il segnale dopo l'aggiunta di un secondo agonista che satura la segnalazione è il limite superiore. La forskolina è spesso usata come agonista di controllo per saturare il segnale del cAMP. In alternativa, può essere utilizzato un analogo del cAMP come l'8-bromoadenosina 3',5'-monofosfato ciclico. Si raccomandano controlli positivi utilizzati al completamento degli studi per identificare potenziali cambiamenti nella via di segnalazione tra i trattamenti sperimentali.

Il calcolo della risposta media di segnalazione per cella richiede la considerazione di diversi fattori. Innanzitutto, il rapporto FRET medio deve essere calcolato come la media dei rapporti in ogni pixel all'interno di una cella, ad esempio (∑(QE⁄cAem))/(numero di pixel), anziché il rapporto tra il QE medio e l'Aem in una cella, ad esempio (∑QE)⁄(∑cAem). Sebbene quest'ultimo non richieda un'attenta mascheratura poiché il rumore di fondo è basso, sottostima gravemente il vero rapporto FRET medio. Tuttavia, i rapporti dei pixel richiedono un calcolo in virgola mobile e un attento mascheramento binario dell'area della cella per definire le ROI ed evitare l'inclusione di rapporti spuri generati dal rumore di fondo all'esterno della cella. L'intera area cellulare deve essere quantificata per evitare di distorcere i risultati sulla forma della cellula. Potrebbe essere necessario ridefinire il mascheramento nel tempo a seconda dei cambiamenti nella forma e nella migrazione delle cellule. In alternativa, è possibile utilizzare ROI superiori alla cella se vengono definiti criteri di esclusione per rimuovere i rapporti di pixel dai segnali QE e Aem che scendono ben al di sotto dei livelli cellulari e sono vicini ai livelli di fondo. I metodi di analisi descritti descrivono in dettaglio i passaggi di base utilizzati in questo lavoro per l'analisi FRET senza software/plug-in specializzati. I produttori di microscopi e altri fornitori vendono moduli aggiuntivi per il loro software per microscopi, che supportano l'analisi raziometrica e FRET automatizzata. Allo stesso modo, il software ImageJ di pubblico dominio ha diversi plug-in disponibili per l'analisi di particelle e FRET, come RiFRET. In secondo luogo, il rapporto FRET medio basato sui pixel sottostima il vero rapporto medio della struttura cellulare 3D perché viene utilizzata un'immagine 2D. I segnali 2D rappresentano e fanno la media lungo l'asse z. Il calcolo della distribuzione spaziale 3D dei rapporti FRET nelle cellule vive non è possibile senza l'imaging 3D ad alta velocità (ad esempio, utilizzando la microscopia confocale a disco rotante). Questo è un problema sia per le colture 2D che per quelle 3D, ma ha un effetto maggiore nelle 3D poiché la maggior parte della struttura cellulare esiste fuori dal piano. Questo è di grande preoccupazione per le sonde che si localizzano nelle strutture cellulari, come la sonda EPAC1 della membrana plasmatica PM-ICUE. Vedi Spiering et al. 2013 per suggerimenti per correggere gli effetti dello spessore delle celle sui calcoli del rapporto24. L'analisi della distribuzione di Aem può essere utilizzata per rilevare se la sonda si accumula nelle regioni della cella e se il piano di imaging è regolato. Ciò aiuterà anche a interpretare la distribuzione spaziale dei rapporti FRET e ad eliminare i risultati spuri, ad esempio l'identificazione della saturazione della sonda (ad esempio, una regione Aem bassa avrà una bassa concentrazione della sonda e potrebbe mostrare una saturazione della sonda e un rapporto FRET elevato). In terzo luogo, diversi livelli basali di FRET possono indicare una differenza nell'efficienza di trasfezione, nell'espressione della sonda o nella segnalazione basale tra i gruppi sperimentali. L'"Analisi relativa" (Passaggio 10.1.1) aiuta a rimuovere la deriva nel rapporto FRET nel tempo, se presente. Facilita il confronto dell'entità relativa delle risposte tra i campioni, ma impedisce il confronto con l'andamento temporale della risposta per il campione di riferimento (il grafico di controllo è una linea piatta). L'"analisi assoluta" (passaggio 10.1.2) facilita il confronto del tasso di risposta tra i campioni, ma ostacola il confronto dell'entità della risposta perché ogni riga è scalata da una costante dissimile. Gli studi utilizzano spesso una regressione lineare sulla linea di base per correggere la deriva del rapporto FRET nel tempo.

Il metodo FRET 3D descritto è un modo utile e pratico per fabbricare ed eseguire l'imaging time-lapse di idrogel 3D carichi di cellule, che può essere applicato ad altre sonde e modalità di imaging. Altri sistemi FRET oltre alle sonde binarie a catena singola richiederanno una correzione più complessa dei segnali basati sull'intensità, come discusso sopra. In alternativa, l'imaging a fluorescenza del tempo di vita di FRET (FLIM-FRET) può essere utilizzato per calcolare l'efficienza FRET tramite una variazione della durata di emissione del donatore della sonda. A differenza del FRET basato sull'intensità, FLIM-FRET è insensibile al rumore di fondo, al bleed-through spettrale, all'efficienza quantistica e alla sensibilità spettrale del rivelatore2. Tuttavia, i sistemi FLIM sono costosi, complessi e rari e funzionano meglio con fluorofori con decadimento a singolo espone e nessun deflusso FLIM 49. Il metodo descritto può essere utilizzato anche con piattaforme di microscopio più avanzate (ad esempio, FRET-TIRF, anisotropia a fluorescenza e FRET a correlazione spettrale). L'applicazione di questo metodo all'imaging 3D con microscopia confocale e multifotone ad alta velocità faciliterà l'analisi della distribuzione subcellulare della risposta di segnalazione e aumenterà l'accuratezza dell'analisi di segnalazione. Questo metodo FRET 3D consentirà studi avanzati di biologia cellulare in microambienti cellulari 3D simulati. In quanto tale, può essere facilmente applicato alle esigenze di farmacologia e medicina rigenerativa, compreso lo studio della segnalazione intercellulare e lo screening della risposta ai farmaci in microtessuti ingegnerizzati a base di idrogel.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della School of Dental Medicine dell'Università di Pittsburgh, il premio K01 AR062598 del National Institutes of Health e la sovvenzione P30 DE030740. Gli autori ringraziano anche il Dr. Jin Zhang per il plasmide ICUE1, Wayne Rasband per lo sviluppo di ImageJ e Michael Cammer per la macro ImageJ.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polidimetilsilossano (PDMS) [Kit elastomero Sylgard 184]Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)NC0162601Reagenti
Polietilenglicole dimetacrilato (PEGDM)Preparato secondo Lin-Gibson con PEG di Sigma Aldrich95904Reagenti
3-(Trimetossisilil)metacrilato di propileSigma AldrichM6514Reagenti
3- GlicidossipropiltrimetossisilanoSigma Aldrich440167Reagenti
DimetilfenilfosfonitoSigma Aldrich149470-5gReagenti
2,4,6-trimetilbenzoilcloruroScientificAC244280100Reagenti
2-ButanoneFisher ScientificAC149670010Reagenti
Bromuro di litioFisher ScientificAC199871000Reagenti
IsopropanoloSigma Aldrich190764Reagenti
Sigmacote (reagente siliconizzante)Sigma AldrichSL2Reagenti
Toluene ScientificAC36441-0010Reagenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Reagenti HycloneSH3025601
Opti-MEM Siero ridotto Medium, senza rosso fenolo (terreno privo di fenolo e siero)Life Technologies11058-021
Reagenti FuGENE HD Transfection Reagent (reagente di trasfezione)Reagenti PromegaE2311
Cellstripper (cellulare Corning25-056-CIReagenti
Fattore di crescita Matrigel ridotto, senza fenoloCorning356231Reagenti
ForskolinSigma AldrichF6886Reagenti
Puntali per pipette (10.200,1.000 &; l) Fisher Scientific02-707-474, 02-707-478, 02-707-480Attrezzatura da laboratorio monouso
Guanti da esplorazione senza polvereFisher Scientific19-149-863BAttrezzatura da laboratorio monouso
Foglio di alluminioFisher Scientific01-213-100Attrezzatura da laboratorio monouso
Punzone per biopsia (3 mm)Miltex3332Attrezzatura da laboratorio monouso
Vetrini coprioggetti in vetroFisher Scientific12-544CAttrezzatura da laboratorio monouso
Vetrini coprioggetto prerivestiti (epossisilano)ArrayitCCSLAttrezzatura da laboratorio monouso
VetrinoFisher Scientific12550DAttrezzatura da laboratorio monouso
Fiale sterili (15 ml, 50 ml conico)Fisher Scientific14-959-70C, 14-959-49AAttrezzatura da laboratorio monouso
Piatto per colture cellulari (6- Falcon351146Attrezzatura da laboratorio monouso
Microscopio a epifluorescenza con tavolino motorizzatoNikonMEA53100 (Eclipse TiE invertito)Attrezzatura da laboratorio grande/non monouso
Supporto per campioni regolabile per tavolino XYNikon77011393Attrezzatura da laboratorio non monouso
Obiettivo 60X (1,3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)NikonMRD01605Sorgente
luminosa CFP/YFP e portafiltri di eccitazione/emissione (sorgente luminosa e ruota Lambda, sistema di filtro emissione Lambda)Nikon (rivenditore Sutter Instrument)77016231, 77016088Attrezzatura da laboratorio non monouso
Set di filtri CYF/YFPNikon (Chroma Technology Corp)77014928Attrezzatura da laboratorio non monouso
Fotocamera (ORCA Flash 4.0 v1)Nikon (Hamamatsu rivenditore)77054076Attrezzature da laboratorio non monouso
NIS-Elements 40.20.02 software per microscopiNikonMQS31100 Attrezzatura da laboratorio non monouso
Prism (foglio di calcolo e software grafico)GraphPad Software, IncVersione 6Attrezzatura da laboratorio non monouso
Sistema di lampade per polimerizzazione a punti UV OmniCure S1000 con filtro da 365 nm o altra sorgente luminosa (λ = 365 o 405)OmniCureS1000Attrezzatura da laboratorio grande/non monouso
Pipette Aid Drummond Scientific Co.DP-100Attrezzatura da laboratorio non monouso
EmatocitometroHausser ScientificReichert Bright-Line 1475Attrezzatura da laboratorio non monouso
Camera essiccante/degasatore sottovuotoQualsiasiattrezzatura da laboratorio di grandi dimensioni/non monouso
Cappuccio per coltura tissutale Qualsiasiattrezzatura da laboratorio di grandi dimensioni/non monouso
CappaQualsiasiattrezzatura da laboratorio grande/non usa e getta
FornoQualsiasiAttrezzatura da laboratorio grande/non usa e getta
SpatolaQualsiasiAttrezzatura da laboratorio non monouso
BecherQualsiasiAttrezzatura da laboratorio non usa e getta
Incubatrice Qualsiasiattrezzatura da laboratorio di grandi dimensioni/non monouso
Fisher Fisher ) chimica

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. , InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002(2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. , Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170(2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

FRET ImagingThree dimensional HydrogelsWidefield MicroscopyCyclic AMP SignalingChondrocyte CellsPhotocrosslinking HydrogelThermoresponsive HydrogelRatiometric FRET ProbesQuenched Emission FRETBackground Subtraction

Articoli correlati