Qui, descriviamo un test colorimetrico per rilevare la presenza di zuccheri riducenti durante la germinazione batterica delle spore.
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Articolo metodologico
Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il processo di germinazione delle endospore nel Clostridium difficile, e in altri Clostridia, si sta rivelando sempre più diverso dal batterio modello che forma spore, Bacillus subtilis. La germinazione è innescata da germinanti di piccole molecole e avviene senza la necessità di sintesi macromolecolare. Sebbene esistano differenze tra i meccanismi di germinazione delle spore nelle specie di Bacillus e Clostridium, un requisito comune è l'idrolisi della corteccia simile al peptidoglicano che consente al nucleo delle spore di gonfiarsi e reidratarsi. Dopo la reidratazione, può iniziare il metabolismo e questo, alla fine, porta alla crescita di una cellula vegetativa. Il rilevamento di frammenti di corteccia idrolizzata durante la germinazione delle spore può essere difficile e le modifiche ai saggi precedentemente descritti possono essere confuse o difficili da riprodurre. Pertanto, sulla base del nostro recente rapporto che utilizza questo test, descriviamo in dettaglio un protocollo passo-passo per il rilevamento colorimetrico di frammenti di corteccia durante la germinazione delle spore batteriche.
Introduzione
Endospore sono metabolicamente forme dormienti di batteri che permettono ai batteri di persistono in ambienti sfavorevoli. In molti batteri sporigeni, formazione di spore è indotta da privazione di nutrienti, ma questo processo può essere controllato da cambiamenti di pH, esposizione ad ossigeno o altre sollecitazioni 1. Mentre nella loro forma spore metabolicamente dormiente, i batteri resistono ai raggi UV, essiccazione, temperature più elevate, e il congelamento 2. La maggior parte delle conoscenze sul processo di sporulazione deriva da studi in organismo modello, Bacillus subtilis. Il processo inizia con sporulazione replicazione de....
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Protocollo
1. Generazione di campioni
- Calore attivare C. difficile spore a 65 ° C per 30 min e conservare in ghiaccio.
Nota: C. spore difficile può essere prodotto e purificato come descritto in precedenza 7,9,10. - Preparare la soluzione di germinazione a X + 1 ml dove X è il numero di campioni da prelevare durante il dosaggio.
Nota: La soluzione di germinazione è specifico per le specie di batteri spore in fase di studio. Per saggiare C. difficile germinazione delle spore, abbiamo utilizzato una soluzione di 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicina e 10 mM acido taurocolico in acqua deioni....
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Risultati
La tabella 1 mostra i risultati tipici utilizzando standard NAG. I dati vengono utilizzati per generare una curva standard. La tabella 2 mostra i risultati tipici della un saggio di germinazione in tampone germinazione supplementato con 100 mM glicina e 10 mM TA (condizioni di germinazione-promozione) o 100 mM glicina solo (condizioni non germinazione). In assenza di TA, C. spore difficile del non germinano e c'è poco cambiamento ne.......
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Discussione
Dopo stimolazione, spore sottoposti al processo di germinazione perdono le loro caratteristiche di resistenza senza la necessità per la sintesi macromolecolare. Quando la germinazione delle spore viene attivato, il nucleo spore rilascia DPA in cambio di acqua 2. A causa dell'elevato contenuto DPA della spora dormienti, il nucleo spore è sotto forte pressione osmotica ed il peptidoglicano specializzata, corteccia, aiuta a prevenire il nucleo di gonfiore agendo, presumibilmente, come barriera all'espans.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto descritto è supportato da premio Numero 5R01AI116895 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e Malattie infettive o il National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta con tappo a vite da 2,0 ml | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipetta Eppendorf | |||
| p200 Eppendorf pipetta Eppendorf | |||
| p20 Eppendorf | Eppendorf | ||
| 100 - 1.250 μ l puntali per pipette | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μ ll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetil-D-glucosamina | Sigma | A3286-25G | |
| Acido cloridrico - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Anidride acetica | Alfa Aesar | L04295 | |
| Bicarbonato di sodio | BDH | BDH0280-500G | |
| Tetraborato di potassio tetraidrato | Alfa Aesar | 39435 | |
| Idrossido di sodio | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(dimetilammino)benzaldeide | Sigma | 156477-100G | |
| Fenolo saturo | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acido acetico, glaciale | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Bagno d'acqua riscaldato e circolante | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 Falcon | 353072 | 96 piastre di coltura tissutale ben trasparenti | |
| Provette per | VWR | 89000-506 | |
| liofilizzatore | |||
Riferimenti
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species:....
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Ristampe e permessi
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