Articolo metodologico

Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

DOI:

10.3791/54146

⸱

25 giugno 2016

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un test colorimetrico per rilevare la presenza di zuccheri riducenti durante la germinazione batterica delle spore.

Abstract

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Il processo di germinazione delle endospore nel Clostridium difficile, e in altri Clostridia, si sta rivelando sempre più diverso dal batterio modello che forma spore, Bacillus subtilis. La germinazione è innescata da germinanti di piccole molecole e avviene senza la necessità di sintesi macromolecolare. Sebbene esistano differenze tra i meccanismi di germinazione delle spore nelle specie di Bacillus e Clostridium, un requisito comune è l'idrolisi della corteccia simile al peptidoglicano che consente al nucleo delle spore di gonfiarsi e reidratarsi. Dopo la reidratazione, può iniziare il metabolismo e questo, alla fine, porta alla crescita di una cellula vegetativa. Il rilevamento di frammenti di corteccia idrolizzata durante la germinazione delle spore può essere difficile e le modifiche ai saggi precedentemente descritti possono essere confuse o difficili da riprodurre. Pertanto, sulla base del nostro recente rapporto che utilizza questo test, descriviamo in dettaglio un protocollo passo-passo per il rilevamento colorimetrico di frammenti di corteccia durante la germinazione delle spore batteriche.

Introduzione

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Endospore sono metabolicamente forme dormienti di batteri che permettono ai batteri di persistono in ambienti sfavorevoli. In molti batteri sporigeni, formazione di spore è indotta da privazione di nutrienti, ma questo processo può essere controllato da cambiamenti di pH, esposizione ad ossigeno o altre sollecitazioni 1. Mentre nella loro forma spore metabolicamente dormiente, i batteri resistono ai raggi UV, essiccazione, temperature più elevate, e il congelamento 2. La maggior parte delle conoscenze sul processo di sporulazione deriva da studi in organismo modello, Bacillus subtilis. Il processo inizia con sporulazione replicazione del DNA e la formazione di un 3,4 filamento assiale. Un setto asimmetrica quindi divide la cella in due compartimenti di dimensioni disuguale. Il vano più grande, la cellula madre, avvolge il vano più piccolo, il forespore. Sia la cellula madre e forespore coordinare l'espressione genica a maturare le spore e la cellula madre alla fine lisa, rilasciando il Dormant spore nell'ambiente circostante 1.

La struttura e la composizione delle spore si conserva in molte specie batteriche. Il nucleo spora ha un contenuto d'acqua inferiore a quella cellula vegetativa ed è ricco di acido dipicolinico (DPA) 1,2. Durante la formazione di spore, DPA viene pompato nel nucleo spore in cambio di acqua. Che circonda il nucleo è una membrana spore interno dove, nella maggior parte dei formare spore dei batteri, i recettori che riconoscono le piccole molecole che stimolano la germinazione (germinants) si trovano 2. Situato appena fuori membrana interna della spora è uno strato di peptidoglicano della parete cellulare. Uno strato peptidoglicano specializzata (corteccia) circonda la peptidoglicano della parete cellulare ed è composto da molti degli stessi componenti come peptidoglicano della parete cellulare [alternati N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM)]. Tuttavia, circa il 50% dei residui NAM nella corteccia sono stati convertiti in muramico-δ-lattame 5,6 . Durante la germinazione delle spore, questi residui muramico-δ-lattamici sono riconosciuti dalle spore corteccia enzimi litici (SCLEs), consentendo in tal modo la corteccia di essere degradata (un processo essenziale per completare la germinazione), ma non la parete cellulare. Intorno corteccia è una membrana esterna e diversi strati di proteine ​​di rivestimento 2.

Controllo del processo di germinazione è di fondamentale importanza per la sporulazione. La germinazione è iniziato quando i recettori germinant interagiscono con i loro rispettivi germinants 2. In molti sporulazione, questi germinants sono aminoacidi, zuccheri, nucleotidi, ioni o loro combinazioni 2. C. difficile germinazione è avviata da combinazioni di alcuni acidi biliari, [ad esempio, acido taurocolico (TA)] e amminoacidi (ad esempio, glicina) 7-10. Anche se ci sono differenze tra il C. percorso di germinazione difficile e le vie studiate in altri sporebatteri, come B. subtilis, comune a tutti è il requisito assoluto per degradare la corteccia spore per consentire una cellula vegetativa a crescere dal spore germinato 2,8. Il degrado della corteccia può essere compiuta dal SCLEs CwlJ / SleB (come si trova in B. subtilis) o SLEC (come si trova in molti clostridi). Cortex idrolisi riduce il vincolo sulla parete cellulare e spore. Questo permette di reidratazione pieno centro, un passo necessario per riattivare molte delle proteine ​​necessarie per il metabolismo cellulare 2.

Quando spore germinano, i cambiamenti spore dormienti da uno stato di fase luminoso ad uno stato di fase buia e questo processo può essere misurato da un cambiamento di densità ottica (OD) a 600 nm 11. Un rapporto precedente suggerisce che gran parte di questo cambiamento di OD è dovuto al rilascio di DPA dalla spore 12. Durante il nostro recente studio, abbiamo cercato di confrontare i tempi di C. difficile la germinazione delle spore e monitorato ilrilascio di DPA e corteccia frammenti 9. Per questo studio è stato fondamentale per monitorare il rilascio di frammenti di corteccia come hanno cominciato ad essere rilasciato dalla germinazione delle spore.

Il saggio colorimetrico qui usato si basava su un metodo per rilevare gli zuccheri con estremità riducenti sviluppato Ghuysen et al. 13. Perché altri hanno descritto i protocolli per la rilevazione di zuccheri riducenti 14 o hanno modificato i protocolli 15, la letteratura su questo argomento può essere fonte di confusione. Qui, noi dettaglio un metodo step-by-step per la determinazione colorimetrica di zuccheri riduttori liberati da germinare C. spore difficile. Anche se questo studio utilizza C. spore difficile, gli zuccheri riducenti liberati durante la germinazione di spore da altri batteri sporigeni sono in grado di essere rilevato con questo protocollo 9,16,17.

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Protocollo

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1. Generazione di campioni

  1. Calore attivare C. difficile spore a 65 ° C per 30 min e conservare in ghiaccio.
    Nota: C. spore difficile può essere prodotto e purificato come descritto in precedenza 7,9,10.
  2. Preparare la soluzione di germinazione a X + 1 ml dove X è il numero di campioni da prelevare durante il dosaggio.
    Nota: La soluzione di germinazione è specifico per le specie di batteri spore in fase di studio. Per saggiare C. difficile germinazione delle spore, abbiamo utilizzato una soluzione di 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicina e 10 mM acido taurocolico in acqua deionizzata.
  3. Prima di iniziare il test, estrarre un campione della soluzione di germinazione 1,0 ml senza spore per servire come bianco per il rilevamento frammento corticale.
  4. Aggiungere spore ad un OD 600 di ~ 3,0 alla soluzione germinazione e vortex rapidamente.
    Nota: per i nostri studi di germinazione in B. subtilis, abbiamo utilizzato la stessa OD 600 spore come per C. difficile.
    Nota: Questa quantità di spore ha funzionato bene per il monitoraggio corteccia rilascio frammento durante C. difficile la germinazione delle spore. La quantità di spore saggio utilizzare deve essere determinato sperimentalmente per ogni batterio o ceppo.
  5. Rimuovere un campione 1,2 ml subito dopo aver aggiunto le spore e centrifugare a temperatura ambiente per 1 min a 14.000 xg. Questo è il punto di tempo zero.
  6. Trasferire 1,0 ml del surnatante dal campione centrifugato in una nuova provetta per la successiva analisi di frammenti corteccia.
    Nota: Dovrebbe DPA devono essere monitorati, rimuovere un campione di 100 microlitri separato per il rilevamento di DPA nella soluzione utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza terbio 9,18,19.
  7. Congelare il campione raccolto a -80 ° C.
  8. Ripetere i punti 1.4 e 1.5, a intervalli regolari fino a quando tutti i punti di tempo completati.
    Nota: A causa dei tempi necessari per la centrifugazione e campionamento, punti di tempo meno esimoun 2 min a parte, non fosse possibile durante la nostra procedura, così i nostri intervalli di campionamento sono stati una volta ogni 2 min per 14 min.
  9. Come controllo positivo per ridurre rilevamento zucchero e quantificazione, includere le seguenti quantità di N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000. Preparare questi campioni allo stesso tempo come campioni corteccia e correre lungo con i campioni di corteccia in modo che la curva standard è rilevante ai dati generati da germinare spore.
  10. Dopo che tutti i campioni punto di tempo vengono raccolti, liofilizzare i campioni.
    Nota: liofilizzato nostri campioni in tubi con tappo a vite 2 ml.

2. Misura Cortex Frammenti

  1. Risospendere campioni liofilizzati in 120 ml di 3 N HCl integrato con 1% di fenolo e 0,5% β-mercaptoetanolo.
  2. Trasferire i campioni risospeso in provette con tappo a vite a 2 ml.
    Nota: Per la riproducibilità, garantire tutto il campione liofilizzato viene risospeso e trasferito.
  3. Incubare i campioni in un bagno d'acqua di ricircolo a 95 ° C per 4 ore.
  4. Dopo l'incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non sono cool.
  5. Neutralizzare i campioni con 120 ml di 3 M NaOH.
  6. Aggiungere 80 ml di una soluzione satura di sodio bicarbonato e 80 ml di una soluzione di anidride acetica 5% per ciascun campione e vortex.
  7. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min.
  8. Trasferire i campioni di nuovo al bagno di acqua C 95 ° per esattamente 3 min.
    Nota: questo passaggio è il tempo periodi sensibili e più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale a valle.
  9. Rimuovere campioni dal bagnomaria e raffreddare su ghiaccio.
  10. Aggiungere 400 ml di 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O per ogni provetta e vortex.
  11. Incubare i campioni in un bagno d'acqua di ricircolo a 95 ° C per esattamente 7 min.
    Nota: questo passaggio è il tempo periodi sensibili e più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale a valle.
  12. Rimuoverei campioni e posto in ghiaccio per 5 min.

3. Colore reagente

  1. Mentre i campioni sono sul ghiaccio (Passo 2.12), preparare il reagente colorato. Sciogliere 0,320 g di p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente di Ehrlich) in 1,9 ml di acido acetico glaciale.
    Nota: Il reagente è tempo, temperatura e sensibile alla luce e non dovrebbe essere fatta in anticipo.
  2. Dopo il DMAB dissolve completamente, aggiungere 100 ml di 10 N HCl e vortice.
  3. Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale e vortice.

4. reazione colorimetrica

  1. Trasferire 100 ml di ogni campione raffreddati corteccia in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Aggiungere 700 ml di soluzione di colore appena preparata per ogni campione.
  3. trasferire immediatamente i campioni ad un bagno d'acqua C 37 ° e incubare per esattamente 20 minuti.
  4. Trasferire 200 ml di ogni campione in una piastra a 96 pozzetti chiaro.
  5. Quantificare i campioni a 585 nm su un piattolettore. I campioni dovrebbero iniziare in un colore giallo e una reazione positiva si sposteranno al viola. Il più corticale presente, il più profondo il colore viola.

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Risultati

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La tabella 1 mostra i risultati tipici utilizzando standard NAG. I dati vengono utilizzati per generare una curva standard. La tabella 2 mostra i risultati tipici della un saggio di germinazione in tampone germinazione supplementato con 100 mM glicina e 10 mM TA (condizioni di germinazione-promozione) o 100 mM glicina solo (condizioni non germinazione). In assenza di TA, C. spore difficile del non germinano e c'è poco cambiamento nella ...

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Discussione

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Dopo stimolazione, spore sottoposti al processo di germinazione perdono le loro caratteristiche di resistenza senza la necessità per la sintesi macromolecolare. Quando la germinazione delle spore viene attivato, il nucleo spore rilascia DPA in cambio di acqua 2. A causa dell'elevato contenuto DPA della spora dormienti, il nucleo spore è sotto forte pressione osmotica ed il peptidoglicano specializzata, corteccia, aiuta a prevenire il nucleo di gonfiore agendo, presumibilmente, come barriera all'espans...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il progetto descritto è supportato da premio Numero 5R01AI116895 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e Malattie infettive o il National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta con tappo a vite da 2,0 mlUSA scientific1420-3700
p1000 Eppendorf pipetta Eppendorf
p200 Eppendorf pipetta Eppendorf
p20 EppendorfEppendorf
100 - 1.250 μ l puntali per pipetteVWR89079-486
1 - 200 μ ll pipet tipsVWR89079-458
N-acetil-D-glucosaminaSigmaA3286-25G
Acido cloridrico - 10 NBDH-AristarBDH3032-3.8LP
Anidride aceticaAlfa AesarL04295
Bicarbonato di sodioBDHBDH0280-500G
Tetraborato di potassio tetraidratoAlfa Aesar39435
Idrossido di sodioBDHBDH8019-500G
4-(dimetilammino)benzaldeideSigma156477-100G
Fenolo saturoFisherBP1750-400
2-MercaptoetanoloAldrichM6250-100ML
SpectraMax M3Molecular Devices
Acido acetico, glacialeBDHBDH3098-3.8LP
Bagno d'acqua riscaldato e circolanteVWR ScientificModel 1136
Microtest 96 Falcon35307296 piastre di coltura tissutale ben trasparenti
Provette perVWR89000-506
liofilizzatore
colture Macchina a vortice per blocchi di calore

Riferimenti

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