Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Summary

Cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) rappresentano un netto miglioramento rispetto coltura cellulare in ambienti 2-D (ad esempio, flaconi o piatti). Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità fornito ruotando parete dei vasi (RWV) bioreattori.

Abstract

Poiché le cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) hanno il potenziale per colmare molte lacune di coltivazione di cellule in ambienti 2-D (ad es., Flaconi o piatti). In realtà, è ampiamente riconosciuto che le cellule coltivate in fiaschi o piatti tendono a de-differenziarsi e perdere funzioni specializzate dei tessuti da cui sono stati derivati. Attualmente, ci sono principalmente due tipi di sistemi di coltura 3-D dove le cellule vengono seminate in ponteggi che mimano la matrice nativa extracellulare (ECM): modelli (b) utilizzando bioreattori (a) modelli statici e. La prima svolta è stato il modelli statici 3-D. modelli 3-D utilizzando bioreattori come la rotazione-parete del vaso (RWV) bioreattori sono uno sviluppo più recente. Il concetto originale dei bioreattori RWV è stato sviluppato al Johnson Space Center della NASA nei primi anni 1990 e si crede di superare i limiti dei modelli statici, come lo sviluppo di ipossia, nuclei necrotiche. I bioreattori RWV potrebbero aggirare °è problema fornendo fluidodinamica che permettono la diffusione efficiente di nutrienti e ossigeno. Questi bioreattori sono costituiti da una base dei rotatori che serve a sostenere e ruotare due diversi formati di recipienti di coltura che si differenziano per il loro tipo di fonte di aerazione: (1) di tornitura lenti Vessels laterale (STLVs) con un ossigenatore coassiale al centro, o (2 ) Le navi ad alta Aspect Ratio (HARVs) con l'ossigenazione tramite un appartamento, membrana di trasferimento di gas in gomma siliconica. Questi vasi consentono il trasferimento del gas efficiente, evitando la formazione di bolle e la conseguente turbolenza. Queste condizioni determinano flusso laminare e forza di taglio minimo che i modelli di gravità ridotta (microgravità) all'interno del recipiente di coltura. Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana composta di una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti coltivati ​​in microgravità fornito dal bioreattore RWV. </ P>

Introduction

Il primo passo avanti nella costruzione di un modello 3-D è stata riportata nei primi anni del 1980, quando gli scienziati hanno iniziato a studiare i diversi tipi di ponteggio (ad es., Laminina, collagene di tipo I, collagene IV, e fibronectina) e cocktail di fattori di crescita per migliorare cellula-cellula e le interazioni ECM di modelli 3-D "statiche" ^1-7. Da allora, il problema principale con questi modelli ha limitazioni nel trasferimento dei nutrienti e ossigeno all'interno del mezzo e del tessuto costrutti ^8. In contrasto con le cellule per l'ambiente in vivo che riceve un flusso costante di nutrienti e ossigen....

Protocol

Dichiarazione etica: Tutti i campioni di sangue sono stati prelevati da volontari che hanno partecipato in numero di protocollo HP-00.040.025-1. L'Università del Maryland Institutional Review Board ha approvato questo protocollo e ha autorizzato la raccolta di campioni di sangue di volontari sani per gli studi inclusi in questo manoscritto. Lo scopo di questo studio è stato spiegato ai volontari, e tutti i volontari ha dato informato, firmato il consenso prima del prelievo di sangue.

Nota: Vedere la Tabella 1 per la preparazione supplemento di media. Vedere la Tabella 2 per la preparazione di terreni di coltura 3-D.

Results

Precedentemente abbiamo progettato un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana comprendente una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti coltivati ​​in condizioni di microgravità ²⁴ (Figura 1). Fibroblasti e cellule endoteliali sono stati incorporati in una matrice di collagene I arricchito con proteine ​​di membrana aggiuntiva intestino seminterrato ⁴⁵ (es.,<.......

Discussion

In questo manoscritto, descriviamo lo sviluppo di un modello bioengineered della mucosa intestinale umana composto di tipi cellulari multipli inclusi linfociti primari umani, fibroblasti e cellule endoteliali, così come le linee di cellule epiteliali intestinali ^24. In questo modello 3-D, le cellule sono coltivate all'interno di una matrice extracellulare ricca di collagene in condizioni di microgravità ^24.

Come descritto in precedenza, le caratteristiche principali.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioreattore Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV)	Synthecon	RCCs-4DQ	Per un massimo di 4 recipienti. Sono disponibili anche modelli con più o meno serbatoi.
Scatola monouso	Synthecon	D-405	con 4 vasi
HCT-8 cellule epiteliali	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblasti	ATCC	CRL-1459
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fattore di crescita dei fibroblasti-Basic	Sigma	F0291	bFGF
	Sigma	S7901	SCF
	Sigma	H1404	HGF
Endotelina 3	Sigma	E9137
Laminina	Sigma	L2020	Isolato dal tumore di topo Engelbreth-Holm-Swarm
Fattore di crescita endoteliale vascolare		VEGF Sigma	V7259
	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenina	Sigma	A2786
Insulina	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-tironina	Sigma	T-6397	T3 Tossina
del colera	Sigma	C-8052
Fibronectina	BD	354008	Isolato da plasma umano
apo-transferrina	Sigma	T-1147
Eparina		Sigma H3149
Eparan solfato  proteoglicano	Sigma	H4777	Isolato dalla membrana basale del topo  Tumore di Engelbreth-Holm-Swarm
Collagene IV	Sigma	C5533	Isolato dalla placenta umana
Siero bovino fetale inattivato termicamente	Invitrogen	10437-028
D-MEM, polvere	Invitrogen	12800-017
10% formalina... PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Collagene bovino di tipo I	Invitrogen	A1064401
tripsina-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Piruvato di sodio	Invitrogen	11360-070
Gentamicina	Invitrogen	15750-060
Penicillina/streptomincina	Invitrogen	15140-122
L-Glutammina	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Aquila media basale	Invitrogen	21010-046
BME RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endoteliale Lonza media basale		CC-3156	EBM-2
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali	Millipore	02-102	ECGS