Abbiamo sviluppato un metodo di lesione nervosa per esaminare in modo affidabile la reinnervazione muscolare, e quindi la rigenerazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi. Questa tecnica prevede la lesione del nervo peroneale comune tramite un intervento chirurgico semplice e altamente riproducibile. La reinnervazione muscolare viene quindi valutata montando l'intero muscolo estensore lungo delle dita.
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Articolo metodologico
Il nervo del perone Metodo Injury: Un test affidabile di individuare e testare i fattori che Repair neuromuscolari giunzioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) subisce cambiamenti strutturali e funzionali deleteri a causa di invecchiamento, lesioni e malattie. Pertanto, è indispensabile per capire i cambiamenti cellulari e molecolari coinvolti nella manutenzione e riparazione NMJs. A questo scopo, abbiamo sviluppato un metodo per affidabile e coerente esaminare rigenerante NMJs nei topi. Questo metodo comporta la lesione del nervo schiacciamento del nervo peroneo comune che passa sopra la testa laterale del tendine del muscolo gastrocnemio vicino al ginocchio. Utilizzando vecchi topi di sesso femminile di 70 giorni, dimostriamo che assoni motori cominciano a Reinnervate precedenti obiettivi post-sinaptici entro 7 giorni post-cotta. Essi rioccupano completamente le loro precedenti zone sinaptiche da 12 giorni. Per determinare l'affidabilità di questo metodo di infortunio, abbiamo confrontato i tassi di reinnervazione tra i singoli vecchi topi femmina 70 al giorno. Abbiamo scoperto che il numero di siti post-sinaptici reinnervated era simile tra i topi a 7, 9, e 12 giorni post-cotta. Per determinare sequesto test lesione può essere utilizzato anche per confrontare cambiamenti molecolari nei muscoli, abbiamo esaminato livelli di gamma-subunità del recettore nicotinico muscolare (gamma-AChR) e la chinasi muscolo-specifica (MuSK). La subunità gamma-AChR e muschio di sono altamente sovraregolati dopo denervazione e tornare a livelli normali seguenti reinnervazione di NMJs. Abbiamo trovato una stretta relazione tra i livelli di trascrizione di questi geni e lo stato innervazione dei muscoli. Noi crediamo che questo metodo accelererà la nostra comprensione dei cambiamenti cellulari e molecolari coinvolti nella riparazione del NMJ e altre sinapsi.
Introduzione
Negli animali giovani adulti e sani, la giunzione neuromuscolare (NMJ) è una connessione altamente stabile tra la presinapsi, la terminazione nervosa di un assone α-motorio, e la postsinapsi, la regione specializzata di una fibra muscolare extrafusale dove i recettori nicotinici dell'acetilcolina (AChR) si aggregano selettivamente1. L'apposizione quasi perfetta degli apparati pre- e post-sinaptici è necessaria per la corretta neurotrasmissione, la sopravvivenza dei neuroni α-motori e delle fibre muscolari e la funzione motoria. Sfortunatamente, la funzione dell'NMJ è influenzata negativamente dall'invecchiamento, da malattie come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), dalle malattie autoimmuni e dalle lesioni ai muscoli e ai nervi periferici2-5. Questi insulti spesso provocano la degenerazione delle terminazioni nervose presinaptiche, lasciando i muscoli denervati e alterando significativamente le capacità motorie. Per questo motivo, l'identificazione delle molecole che funzionano per mantenere e riparare l'NMJ è diventata una priorità. Poiché i nervi periferici rigenerano e reinnervano i bersagli, i modelli di lesione dei nervi periferici sono stati utilizzati per identificare i cambiamenti molecolari associati alla rigenerazione delle NMJ.
I modelli di lesione dei nervi periferici spesso comportano il taglio completo o lo schiacciamento di specifici rami nervosi6. Dopo un taglio, il tubo endoneuriale deve essere riformato, ritardando la rigenerazione assonale e la reinnervazione delle cellule e dei tessuti bersaglio. La gravità di questo tipo di lesione fa sì che gli assoni si allontanino dal loro percorso originale, con conseguente incapacità di raggiungere i bersagli originali. Questo è in contrasto con i nervi danneggiati da schiacciamento in cui l'endoneurio rimane contiguo, fornendo un percorso per una ricrescita efficiente e corretta degli assoni rigeneranti. Consente inoltre agli assoni di trovare e reinnervare i loro partner originali delle fibre muscolari. Indipendentemente dal modello di lesione, ci sono una serie di cambiamenti cellulari e molecolari che devono verificarsi affinché gli assoni si rigenerino e reinnervano i bersagli. Dopo una lesione, il segmento nervoso prossimale al bersaglio viene scomposto e rimosso attraverso un processo chiamato degenerazione walleriana7. Questo processo comporta la riprogrammazione e la de-differenziazione delle cellule di Schwann in cellule non mielinizzanti che secernono fattori rigenerativi, eliminano la mielina e reclutano macrofagi nel sito della lesione8. I macrofagi a loro volta completano l'eliminazione della mielina e dei detriti assonali, che altrimenti impedirebbero la crescita dell'assone9 rigenerante. Parallelamente, i neuroni motori e sensoriali attivano i meccanismi necessari per promuovere la rigenerazione dei loro assoni recisi. Una volta che l'assone rigenerante raggiunge il bersaglio, deve trasformarsi da un cono di crescita a una terminazione nervosa in grado di trasmettere correttamente (per gli assoni motori) o ricevere (per gli assoni sensoriali) informazioni10. A questo proposito, gli assoni alfa-motori subiscono una serie di cambiamenti ben orchestrati che culminano nel differenziarsi del loro cono di crescita in una terminazione nervosa presinaptica completamente funzionale che si oppone quasi perfettamente al sito post-sinaptico sulla fibra muscolare bersaglio11.
I nervi sciatico, tibiale e accessorio sono state le scelte primarie per studiare la rigenerazione assonale e NMJ12-14. Tuttavia, ci sono una serie di svantaggi quando si utilizzano questi modelli per esaminare i cambiamenti cellulari e molecolari associati alla rigenerazione di NMJ tra animali e in condizioni diverse. In primo luogo, il nervo sciatico fornisce la maggior parte dei muscoli dell'arto posteriore, con lesioni che limitano significativamente sia il movimento che la sensazione. Non è quindi possibile utilizzare questo metodo per studiare l'impatto dell'esercizio da solo o in combinazione con altri fattori. Inoltre, il nervo sciatico è una struttura piuttosto spessa e quindi richiede una grande quantità di forza di compressione per ferire completamente tutti gli assoni. Questo a sua volta può comportare la completa transezione degli assoni più superficiali, lasciando intatto il tubo endoneuriale degli assoni più profondi, introducendo una significativa variabilità nella velocità e nella fedeltà della rigenerazione tra questi assoni. La transezione completa di questo nervo è ancora meno desiderabile dato che molti assoni non riusciranno a riconnettersi con le stesse fibre muscolari. A complicare le cose, il nervo sciatico possiede una variabilità anatomica intrinseca, sia nel numero che nel sito di origine dei suoi rami nervosi terminali. È quindi molto difficile lesionare lo stesso sito. Sebbene il nervo tibiale sia più piccolo e più suscettibile di schiacciare le lesioni, non esiste nemmeno un punto di riferimento prontamente disponibile che funga da sito di lesione per questo ramo nervoso.
Il ramo nervoso accessorio (parte del nervo cranico XI) che fornisce il muscolo sternocleidomastoideo è stato utilizzato anche per studiare la rigenerazione dei NMJ15. Questo nervo è particolarmente attraente perché le NMJ nel muscolo sternocleidomastoideo possono essere visualizzate più facilmente negli animali vivi rispetto alle NMJ in altri muscoli. Ma simile ai nervi sciatico e tibiale, non esiste un punto di riferimento specifico che possa essere utilizzato per ferire questo nervo nella stessa posizione, limitandolo come modello per confrontare la rigenerazione di NMJ tra i singoli animali di una coorte sperimentale. Un sito di lesione incoerente introduce variabilità nei tassi di reinnervazione della NMJ. A causa di queste carenze, la procedura qui presentata utilizza la lesione di un diverso ramo nervoso periferico per esaminare i NMJ rigeneranti.
Il nervo peroneale comune, chiamato anche nervo peroneo comune, contiene molte caratteristiche che lo rendono un nervo affidabile per esaminare la rigenerazione dei NMJ tra animali e attraverso diversi trattamenti. Il nervo peroneale comune ha un decorso anatomico prevedibile in quanto corre sopra il tendine della testa laterale del muscolo gastrocnemio nel ginocchio, l'intersezione funge da punto di riferimento stabile per le lesioni. Al nervo si accede attraverso una piccola incisione minimamente invasiva vicina ma anatomicamente segregata dai muscoli di interesse. I risultati qui presentati dimostrano che la rigenerazione degli assoni motori inizia a riformare le NMJ nel muscolo estensore lungo delle dita (EDL) 8 giorni dopo aver schiacciato il nervo fibulare in topi femmine giovani adulte di 70 giorni. È importante sottolineare che il modello e il tasso di reinnervazione sono coerenti tra animali della stessa età e sesso e quindi forniscono un modello di lesione affidabile che accelererà significativamente la nostra comprensione dei cambiamenti cellulari e molecolari necessari per mantenere e riparare gli NMJ.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida NIH e protocolli animali approvati dal Comitato di Virginia Tech Istituzionale Animal Care e Usa.
1. Gli animali prepara per la chirurgia
- Anestetizzare topi con una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) mediante iniezione sottocutanea con inguinale sterile 1 ml siringa da insulina. soluzione Carrier contiene una miscela di soluzione fisiologica 0,9%, 17,4 mg / ml ketamina e 2,6 mg / ml xilazina. Mettere gli animali di nuovo in gabbia in attesa che il farmaco abbia effetto.
NOTA: Se la dose di carico non fornisce anestesia sufficienti per la durata del procedimento, un ulteriore 25% della dose di carico può essere iniettato. - animali Monitor dopo l'iniezione per verificare la frequenza respiratoria e la depressione costante appropriato di livelli di eccitazione. Controllare il livello di eccitazione con un pizzico zampa posteriore, che dovrebbe suscitare alcuna risposta quando sufficientemente anestetizzati.
NOTA: Questo richiede di solito 3-5min per un giovane topo adulto in media da 25 a 30 g. Se l'animale è ancora reattivo dopo la post iniezione 10 min, un ulteriore 25% della dose di carico anestetico può essere iniettato. - Applicare vaselina e olio minerale leggero pomata oftalmica per gli occhi degli animali per prevenire la secchezza. Rimuovere gli animali da gabbia e posto su una superficie piana e pulita. Radere l'arto posteriore desiderato dal piede al bacino tramite un trimmer capelli elettrici, esponendo solo l'aspetto laterale dell'arto.
- Applicare un dispositivo di rimozione dei capelli chimica al sito rasato per 1 min. Rimuovere manualmente i capelli con salviette di laboratorio. Pulire la zona depilata con laboratorio wipe imbevuto di etanolo.
2. Procedura chirurgica
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici tramite autoclave o altro metodo appropriato. Pulire il sito chirurgico e bordo chirurgica con l'80% di etanolo / H 2 0. Disinfettare il sito chirurgico con proviodine. Posizionare il mouse sul bordo chirurgico e allinearsi con restrizioni degli arti. Tenerel'arto destinazione posteriori in posizione anatomica naturale con il ginocchio leggermente esteso senza rotazione interna o esterna.
- Mettere animale e tavola sotto il microscopio operatorio. Orientare al corretto sito di incisione attraverso la palpazione dei punti di riferimento superficiali, in particolare il ginocchio ossuto e il crinale tra il tibiale anteriore e muscoli gastrocnemio.
- Fare un'incisione di circa 3 centimetri attraverso la pelle con un bisturi o forbici primavera durante l'utilizzo di pinze generali per la presa. Rendere l'incisione perpendicolare al corso di fondo del nervo peroneo comune.
- Continuare l'incisione attraverso la fascia superficiale, esponendo il bicipite femorale e vasto laterale muscoli. Separare questi muscoli tagliando attraverso la fascia profonda di collegamento. Un taglio 1-2 cm dovrebbe essere sufficiente.
- Ritrarre muscolo bicipite femorale caudale utilizzando divaricatori meccanici, rivelando il nervo peroneo comune.
- Tracciare il nervo prossimalmente fino alla sua trasezione con il tendine del capo laterale del muscolo gastrocnemio è trovato. Nota: L'esposizione può richiedere ulteriori manipolazione della pelle ritratta e muscoli. Questa intersezione viene utilizzato come punto di riferimento stabile per la lesione del nervo.
- Afferrare il nervo con una pinza sottile, allineando le punte in modo parallelo al bordo laterale del tendine gastrocnemio. Schiacciare il nervo peroneale comune applicando costante, pressione dura per 5 sec.
- Corroborare pieno schiacciamento del nervo mediante ispezione visiva attraverso l'ambito chirurgico. Apparirà traslucida presso il sito di lesione. Se si utilizza topi che esprimono proteine fluorescenti in assoni periferici, la fluorescenza scompare dal sito di lesione.
- Rimuovere divaricatori e riallineare i muscoli nelle loro posizioni anatomiche. Chiudere il sito di incisione con 6-0 punti di sutura in seta. 1-3 punti staccati semplici è sufficiente. Mettere recupero del mouse su una piastra elettrica in una gabbia pulita.
- Monitorare tutti gli animali per 2 ore post-operazione per controllare la respirazione e le eventuali reazioni avverse all'anestesia. Somministrare una dose iniziale di buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg tramite iniezione sottocutanea inguinale subito dopo il recupero da un intervento chirurgico. Dare 3 ulteriori dosi ogni 12 hr per il prossimo 48 hr. Dopo il recupero completo, tornare topi per la casa di cura degli animali.
3. Isolamento e colorazione di estensore lungo delle dita Muscoli (EDL)
- Sacrificare animali con isoflurano. Dispensare 0,5 ml isoflurano liquido in un tubo da 50 ml piena di labwipes assorbenti. Posizionare il tubo non livellata con l'animale in una camera stagna 2500 centimetri 3. Almeno 4 minuti di esposizione è sufficiente. Test per la perdita di palpebrale bilaterale, toe-pinch, e riflessi coda pizzico per garantire che ogni animale è incosciente prima di procedere con la perfusione.
- Transcardially profumato 16 animali prima con 10 ml di 0,1 M PBS, poi 25 ml di 4% paraformaldeide in PBS 0,1 M (pH 7,4). Eparina (30 unità / 20g di peso animale) può essere aggiunto con il PBS (10 unità / ml) per prevenire la coagulazione del sangue nei piccoli capillari, migliorando i risultati di perfusione.
- Rimuovere la pelle che copre arti posteriori utilizzando forbici per tagliare trasversalmente attraverso la cute intorno alla circonferenza dell'addome. Sbucciare giù la pelle oltre le arti e le zampe posteriori con pinze.
- Rimuovere fascia superficiale degli arti posteriori afferrando e peeling con una pinza. Se si utilizza topi che esprimono proteine fluorescenti negli assoni periferici, post-risolvere tutto topi durante la notte nel 4% PFA in provette da 50 ml. Risciacquare tre volte con PBS.
NOTA: fissa i topi possono essere memorizzati in PBS a 4 ° C. In caso contrario, saltare questo passaggio e passare al punto 3.6, senza animali pubblicare truccate. - Sezionare i muscoli EDL 18 da topo arti posteriori, essendo sicuri di mantenere il più possibile intatto prossimale e distale tendini.
- Incubare muscoli EDL in tampone bloccante (1x PBS contenente 0,5% Triton X-100, 3% BSA e 5% siero di capra) per almeno 1 ora.
- Per visualizzare gli assoni a motore e dei loro terminali nervosi, posto muscoli in provette contenenti neurofilament (1: 1.000) e synaptotagmin-2 (1: 250) anticorpi diluito in tampone di bloccaggio per 3 giorni. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta. Nota: Ignorare questo passaggio se si utilizzano topi che esprimono proteine fluorescenti (XFP) in assoni periferici.
- Colorare il controlaterale indenne EDL come controllo positivo per la completa innervazione NMJ. I controlli negativi dovrebbero comprendere l'EDL ottenuto a 4 giorni post-lesione, un punto temporale in cui il NMJ è completamente denervato, nonché un EDL colorate con solo anticorpo secondario.
- Incubare i muscoli con opportuni anticorpi secondari fluorescente con tag per rilevare neurofilament e synaptotagmin-2 per 1 giorno. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta. Nota: Questa operazione può essere effettuata con passo 3.10. Ignorare questo passaggio se si utilizzano topi che esprimono proteine fluorescenti in assoni periferici.
- Per visualizzare il postsyregione naptic del NMJ, incubare i muscoli con 5 mg / ml di Alexa-555 coniugato Alfa Bungarotossina diluito in tampone di bloccaggio per almeno 2 ore. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta.
- Per montare i muscoli interi su vetrini con carica positiva, posizionare il muscolo direttamente sulla diapositiva, aggiungere qualche goccia di glicerolo media sulla slitta di montaggio basati e coprire con un vetrino. Premere il vetrino contro il vetrino per appiattire il muscolo. Impregna fuori dal mezzo di montaggio dal perimetro della diapositiva e coprioggetto utilizzando salviette di laboratorio. Applicare lo smalto per sigillare i bordi tra il vetrino e scivolo.
4. Imaging e analisi dei dati
- Per analizzare la struttura di NMJs, l'immagine del muscolo EDL utilizzando un microscopio confocale a scansione laser attrezzato per eccitare 488, 555 e 633 nm di luce e catturare la luce emessa con 20X e 40X obiettivi.
- Per visualizzare tutta NMJs, creare immagini di proiezione massima intensità del sec otticazioni distanziate da 1 a 2 micron che si estende a parte il più basso al più alto regioni visibili della NMJ. Crea proiezioni di massima intensità utilizzando software di imaging disponibili in commercio.
- Per determinare i tassi di reinnervazione, catalogare NMJs come: 1) completamente denervato = sito post-sinaptica è completamente privo di contatto con gli assoni, meno del 5% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. 2) parzialmente innervato = l'assone si sovrappone parzialmente il postsynapse, 5-95% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. 3) innervazione completa = quasi perfetta apposizione tra il pre e post-sinapsi, superiore al 95% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. Esclusione NMJs che giacciono perpendicolare al piano di imaging e non pienamente visualizzabili nell'immagine. Nota: In tutti questi esperimenti, di almeno 3 animali e 50 NMJs per animale sono stati esaminati. I risultati sono stati ritenuti significativi utilizzando un t-test di Student con un valore di P inferiore a 0,05.
- Per accecare l'operatore, individui separati possono eseguirel'intervento chirurgico e l'immagine di analisi. Senza la conoscenza dei gruppi di trattamento, l'analizzatore può essere obiettivo con NMJ punteggio. In alternativa, le immagini possono essere randomizzati e presentati all'operatore per analisi senza la conoscenza dell'animale sorgente.
5. PCR quantitativa
- Sacrificare animali utilizzando isoflurano e dislocazione cervicale. Togliere la pelle e fascia superficiale che copre i muscoli delle gambe in base al punto 3.3. Sezionare tibiale anteriore e muscoli EDL in base al punto 3.4.
- Flash congelare l'intera tibiale anteriore e muscoli EDL in una provetta da 1,5 ml over azoto liquido. Rimuovere il tessuto dal tubo e posto in un mortaio di pre-raffreddata parzialmente immerso in azoto liquido. Macinare muscolo congelato in una polvere fine con un mortaio e pestello.
- Sciogliere in polvere muscolare congelati in un reagente di estrazione dell'RNA disponibili in commercio e procedere all'estrazione del RNA e la rimozione DNA genomico con un kit disponibile in commercio secondo i produttoreSTRUZIONI.
- Eseguire la trascrizione inversa con un mix trascrittasi inversa disponibili in commercio in base alle istruzioni del produttore.
- Eseguire qPCR utilizzando un kit disponibile in commercio utilizzando opportuni geni housekeeping (vedi tabella dei materiali). Utilizzare un quantitativo termociclatore PCR disponibile in commercio per eseguire la PCR (vedi tabella dei materiali).
- Impostare la temperatura di ricottura a 58 ° C. Regolare i parametri di ciclismo aggiuntive alle specifiche del costruttore di Taq polimerasi / SYBR mix verde. Includere una fase curva di fusione finale in programma termociclatore comprensivi di 0,5 ° aumenti incrementali C da 65 ° C a 95 ° C per testare primer specificità PRIMER formazione dimero.
- Determinare relativi livelli di espressione dell'mRNA per il 2 - metodo di ΔΔCT 21 utilizzando 18S RNA come il gene di controllo.
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Risultati
Il nervo peroneale comune, chiamato anche il nervo peroneo comune, nasce dal nervo sciatico di sopra della fossa poplitea, dove si oscilla intorno alla testa del perone alla faccia anteriore della gamba (Figura 1A). Ci si dirama nei nervi peroneale superficiali e profondi, insieme fornendo i flessori dorsali del piede e dita del piede (tibiale anteriore, estensore lungo delle dita e brevis, e alluci estensori muscoli longus), e le everters del piede (muscoli peronei). Qu...
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Discussione
Il metodo presentato in questo manoscritto fornisce opportunità uniche per identificare i meccanismi coinvolti nella riparazione di giunzioni neuromuscolari (NMJ). Questo metodo comporta la frantumazione del nervo peroneo comune che passa sopra il gastrocnemio tendine vicino al ginocchio. Abbiamo dimostrato che dopo soli 5 secondi di compressione del nervo con una pinza, completa degenerazione è notato da 4 giorni dopo l'infortunio. Nei topi giovani adulti, gli assoni alfa-motori cominciano a Reinnervate precedenti ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Valdez per l'input intellettuale sugli esperimenti e i commenti sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ketamina | VetOne | 501072 | |
| Xilazina | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorfina | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Rasoio elettrico | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Siringa da | |||
| Forbici | a mollaVannas | 91500-09 | |
| No. 15 bisturi | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Pinze Dumont | 11252-00 | ||
| 6-0 sutura di seta su ago da taglio inverso | Sutura Express | 752B | |
| Termoforo per roditori | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| sonde molecolari | alfa-BTX coniugate | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscopio | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Microscopio confocale | Zeiss | ||
| Pompa per perfusione peristaltica a portata variabile | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet unguento | Puralube | 1621 | |
| Sinaptotagmina-2 anticorpi | Anticorpi-Online | ABIN401605 | |
| Anticorpi antifilamento neurofilamento-Online | ABIN2475842 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
