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Articolo metodologico

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

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DOI:

10.3791/54202

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22 agosto 2016

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1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

I complessi polielettrolitici autoassemblati (PEC) fabbricati da eparina e protamina sono stati depositati su perle di alginato per intrappolare e regolare il rilascio di fattori di crescita osteogenici. Questa strategia di somministrazione consente una riduzione di 20 volte della dose di BMP-2 nelle applicazioni di fusione spinale. Questo articolo illustra i vantaggi e la fabbricazione dei PEC.

Abstract

Durante interventi di chirurgia ricostruttiva di ossa, quantità sovrafisiologici di fattori di crescita sono empiricamente caricati su ponteggi per promuovere fusione ossea successo. Le grandi dosi di agenti biologici molto potenti sono necessari a causa del fattore di crescita instabilità a seguito della degradazione enzimatica rapida nonché inefficienze carrier nella localizzazione di sufficienti quantità di fattore di crescita nei siti implantari. Quindi, le strategie che prolungano la stabilità dei fattori di crescita come la BMP-2 / NELL-1, e controllare il loro rilascio potrebbe effettivamente ridurre il loro dosaggio efficace e quindi ridurre la necessità di dosi più elevate durante i futuri interventi di rigenerazione ossea. Questo a sua volta consentirà di ridurre gli effetti collaterali e costi dei fattori di crescita. PEC auto-assemblati sono stati fabbricati per fornire un migliore controllo della BMP-2 / NELL-1 consegna via vincolante eparina e l'ulteriore crescita potenziare fattore bioattività, migliorando la stabilità in vivo. Qui illustriamo la semplicità di fabbricazione PEC, che aiuta nella delivery di una varietà di fattori di crescita durante chirurgia ricostruttiva ossee.

Introduzione

L'incidenza di pseudoartrosi è stato segnalato per essere alto come 10 a 45% in degenerative fusione spinale e revisione chirurgia spinale 1. Per ridurre il tasso di pseudoartrosi durante la fusione spinale e altri interventi chirurgici ricostruttivi ossa, fattori di crescita osteogeniche come BMP-2, Nell-1 1 e fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) sono stati introdotti per la promozione de novo osteogenesi. Tra questi, BMP-2 è una scelta popolare per la fusione spinale 2. Sebbene la potenza di BMP-2 nell'induzione e facilitare la formazione di nuovo osso è stato ben stabilito 3; complicanze clinicamente significative come la formazione di osso eterotopico, sieroma e formazione di ematomi, la risposta infiammatoria, radicolite, vertebrali osteolisi corpo, e eiaculazione retrograda continuano ad essere questioni di interesse a causa degli importi utilizzati sovrafisiologici 4,5.

Pertanto, abbassando la dose di BMP-2 rimane una strategia rilevante in alletenta di ridurre al minimo gli effetti collaterali. Inoltre, i sistemi di trasporto efficienti sono tenuti a sopprimere il rilascio scoppio iniziale di BMP-2 osservata in sistemi di trasporto spugna di collagene contemporanea e rafforzare ulteriormente la consegna prolungata e localizzato di questo potente citochina. Il layer-by-layer autoassemblaggio di alternare polielettroliti cationici ed anionici può essere impiegato come metodo sintonizzabile per costruire complessi polielettroliti sulla superficie delle matrici impalcature o materiali impiantabili 6. A questo proposito, eparina (noto per avere la più alta densità di carica negativa di tutti gli agenti biologici) è stato riconosciuto di impegnare avidamente con una varietà di fattori di crescita tramite domini elettrostatiche ed eparina vincolanti. Infatti, eparina ha dimostrato di prolungare l'emivita e potenziarne la bioattività di diversi fattori di crescita così.

Sulla base di questo, il nostro gruppo adattato un protocollo di auto-assemblaggio layer-by-layer per fabbricare un complesso polielettrolita eparina-based (PEC) che carichi e conserva le bioattività dei fattori di crescita osteogeniche durante l'immobilizzazione 7,8. Il nucleo microbead alginato è stato fabbricato per reticolazione α-L-guluronate (G) residui di alginato con ioni bivalenti cationi di calcio e stronzio. Il nucleo alginato è una matrice scaffold biodegradabili; che dopo l'impianto, viene riassorbito nel letto fusion fornire spazio per crescita ossea. Poly-L-lisina (PLL) o protamina viene utilizzato come strato cationico di intrecciare sia con la matrice scaffold (in questo caso, il nucleo alginato carrier microbead) e l'eparina carica negativa; mentre le funzioni di livello eparina anionici per stabilizzare e localizzare fattori di crescita caricati. Il triplo strato PEC ha dimostrato di aumentare la capacità di carico del fattore di crescita in un modello suino 9. Recentemente, vettori PEC hanno dimostrato di ridurre con successo la dose efficace di BMP-2 di almeno 20 volte nel ratto 10 e modelli suina di fusione spinale 8.

S copi "> Qui, riportiamo i metodi di fabbricazione di PEC per una crescita maggiore consegna fattore di fusione spinale e gli altri interventi di chirurgia ricostruttiva delle ossa utilizzando BMP-2 come fattore di modello di crescita osteogenico.

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Protocollo

1. alginato Soluzione Preparazione

  1. Sciogliere 200 mg di alginato di sodio (non irradiati) o 400 mg di 8 MRad irradiato alginato di sodio in 10 ml di acqua bidistillata e agitare per 1 ora per alginato non irradiata e 15 min per alginato irradiato. Conservare la soluzione di alginato a 4 ° C durante la notte. Filtrare la soluzione di alginato con un filtro siringa da 0,2 micron sterile prima alginato fabbricazione microperla.

2. alginato microperla Fabrication

  1. Disinfettare il generatore elettrostatico tallone e pompa a siringa con il 70% di etanolo e metterli in una classe II Cappa di sicurezza biologica (Figura 1).
  2. Posizionare un bacino di vetro con un bastoncino magnetico all'interno del generatore tallone.
  3. Impostare l'elettrodo braccio del generatore tallone 9 cm sopra il bacino.
  4. Collegare il cavo elettrodo del generatore tallone alla vite zigrinata 2 dell'elettrodo braccio e versare 80 ml ​​di soluzione 2 nel SRCLbacino.
  5. Carico 5 ml di 0,2 micron soluzione di alginato filtrata nel tubo siringa e gomma. Dopo aver collegato il tubo di gomma all'elettrodo braccio, accendere la pompa a siringa a 5 ml / h per 2 minuti per espellere l'aria all'interno del tubo e fornire la soluzione di alginato alla punta dell'ugello. Spegnere la pompa a siringa.
  6. Successivamente, accendere encapsulator e poi, la pompa a siringa per iniziare la generazione microperla. Impostare la velocità di flusso di alginato a 5 ml / ora e la tensione a 5,8 kV sul encapsulator. Scartare le microsfere generate durante i primi due minuti (o la soluzione di alginato iniziali 0,5 ml pompato dalla siringa), in quanto queste microsfere tendono ad essere irregolare dimensioni e forma.
  7. Raccogliere le successive microsfere di soluzione di cloruro di 0,2 M di stronzio. Spegnere sia la pompa a siringa e encapsulator (in questo ordine) dopo il pompaggio il volume pre-pianificata di soluzione di alginato. Ripetere questa operazione per le successive partite di microperla fabbricazione. Al termine, girare dif la pompa a siringa prima, seguita dalla encapsulator.
  8. Conservare le microsfere in 20 ml di soluzione di cloruro di stronzio 0.2 M a 4 ° C per una notte per completare reticolazione e stabilizzare il gel.

3. Misurazione Dimensioni di microperle alginato

  1. Raccogliere 0,5 ml di microsfere di alginato con una pipetta di plastica e posizionarlo su un vetrino. Guarda le microsfere sotto un microscopio ottico a 10X di ingrandimento. Prendere dieci immagini delle microsfere con una telecamera CCD microscopio. Salvare le immagini con barra della scala (500 micron) in formato TIFF a una risoluzione di 2.048 x 1.536.
  2. Utilizzando gli strumenti di lunghezza in ImageJ, misurare le dimensioni delle microsfere e barra di scala (figura 2). Convertire la lunghezza microperle da pixel a micrometro.
    1. Clicca sugli strumenti di linea e tracciare una linea attraverso il centro del tallone alginato.
    2. Fai clic su "Analizza" sulla barra dei menu e selezionare "Measure". Viene visualizzata una finestra pop-up.
    3. Ripetere i punti 3.2.1-3.2.2 per misurare tutte le perline alginato all'interno dell'immagine. Misurare la barra della scala sull'immagine.
    4. Convertire il diametro del tallone alginato alla lunghezza reale utilizzando la formula: lunghezza del cordone di alginato / lunghezza della barra della scala x 500 um. Ad esempio, 1.420 (il diametro misurato da ImageJ) / 2.657 (scala di lunghezza misurata dal bar ImageJ) * 500 micron = 267 micron.
  3. Si consideri la dimensione media di 100 microsfere (media ± deviazione standard) come la dimensione rappresentativo di ciascun lotto di microsfere.

4. Sterilizzazione

  1. Raccogliere le microsfere con un 100 micron nylon colino e lavare le perline con acqua bidistillata.
  2. Utilizzando una spatola, trasferire tutti i microperle fatte da 0,1 ml di soluzione di alginato in una provetta 2 ml e coprire con una garza per evitare l'essiccazione.
  3. Infine, sterilizzare le microsfere in autoclave utilizzando la modalità di liquido (115 ° C, 15 min) o in conformità con mle specifiche del fabbricante. Aggiungere 1,5 L di acqua distillata alla camera per evitare perline da essiccazione.

5. protamina e Eparina Coating

  1. All'interno della cappa BSL-2, incubare le microsfere sterili con 1 ml di 2 mg / ml soluzione protamina (sterilizzato utilizzando un filtro a siringa da 0,2 micron) per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Dopo l'incubazione le microsfere per 1 ora (Step 5.1), raccogliere 150 ml di soluzione di protamina per il test di micro acido bicinconinico (microBCA) (sezione 6).
  3. Lavare le microsfere rivestite protamina due volte con acqua bidistillata. Spin giù utilizzando una centrifuga da banco a 200 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare l'acqua con una siringa.
  4. Incubare rivestito protamina microsfere con 1 ml di 0,5 mg / ml soluzione di eparina (sterilizzato utilizzando un filtro a siringa da 0,2 micron) per 30 minuti per creare complessi polielettrolita (PEC).
  5. Dopo l'incubazione il rivestito protamina microsfere fo 30 minuti (punto 5.4), raccogliere 400 ml di soluzione di eparina per determinare il contenuto di eparina (sezione 7).
  6. Dopo l'incubazione, lavare l'eparina non legato dai PEC lavando due volte con acqua bidistillata.

6. protamina contenuti

  1. Eseguire il test microBCA secondo le istruzioni del produttore. In breve, aggiungere 150 ml soluzione di protamina (raccolti prima e dopo incubazione con microsfere) in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 150 ml soluzione di lavoro microBCA.
  2. Utilizzare soluzione di albumina (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 e 200 mcg / ml) come standard di calibrazione.
  3. Incubare la miscela per 60 minuti a 60 ° C. Misurare l'assorbanza con uno spettrofotometro a 562 nm.
  4. Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di protamina ciascun campione sconosciuto secondo le istruzioni del produttore.
  5. Determinare il contenuto protamina delle microsfere sottraendo la quantità totale di protamina nelsoluzione di rivestimento (prima dell'incubazione con microsfere) dalla quantità di protamina rimanente nella soluzione di rivestimento (dopo incubazione con microsfere).

7. eparina contenuti

  1. Preparare i 10 ml di soluzione di lavoro sciogliendo 4 mg blu di toluidina e 20 mg di cloruro di sodio in 0,01 N di acido cloridrico.
  2. Aggiungere 400 microlitri di campione (dal punto 5.5) alla soluzione di lavoro con un rapporto di 2: 3 e vortex per 30 sec.
  3. Aggiungere 600 ml di n-esano (volume equivalente alla soluzione di reagente di lavoro) e agitare la miscela per estrarre il toluidina complesso eparina blu.
  4. Aspirare 200 ml di fase acquosa di siringa dopo la separazione di fase.
  5. Misurare la quantità di blu di toluidina un-estratto contenuta nella fase acquosa utilizzando uno spettrofotometro a 631 nm.
  6. Preparare soluzioni standard con eparina di 0-20 mg / ml.
  7. Tracciare la lettura 631 nm di ogni standard di eparina vs concentrazione di eparina in mg / ml. Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di eparina di ciascun campione.

8. confocale Immagine di Struttura Layer-by-layer

  1. Fabbricare protamina, eparina e Nell-1 / BMP-2 analogico fluorescente CF-405 protamina (blu), CF 594 eparina (rosso) e FITC etichettato Nell-1 / FITC marcato (verde) BMP-2 + eparina + protamina secondo il fornitore di scheda tecnica.
  2. Coat 100 mcg microsfere con 300 ml di analogico fluorescente (metodo di rivestimento come descritto in 5,3-5,6) CF-405 protamina (blu) (2 mg / ml, incubazione 1 ora), CF 594 eparina (rosso) (0,5 mg / ml, 30 min) e FITC etichettati Nell-1 / FITC marcato (verde) BMP-2 (1,5 mg / ml, durante la notte). Lavare le microsfere due volte con acqua distillata per eliminare la non legato protamina fluorescenti, eparina e Nell-1 / BMP-2.
  3. Osservare la struttura layer-by-layer (Figura 3) utilizzando un microscopio confocale a ingrandimento 10X. 7

9. BMP-2e Nell-1 assorbimento e di rilascio

  1. Carico 13.3 ml di 1,5 mg / ml di BMP-2 o NELL-1 soluzione sul 100 mg di PEC. Incubare PEC a 4 ° C sotto i 30 giri che agitano le 10 ore.
  2. Porre le microsfere in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C con costante agitazione (30 rpm).
  3. Raccogliere 1 ml del supernatante e sostituirlo con 1 ml di PBS dopo 1, 3, 6, 10 e 14 giorni.
  4. Valutare l'assorbimento e il rilascio efficienza della BMP-2 con il metodo ELISA secondo il protocollo del produttore. Valutare l'assorbimento e il rilascio efficienza di Nell-1 utilizzando il metodo di determinazione della proteina carboxybenzoyl chinolina-2-carboxaldehyde (CBQCA) secondo il protocollo del produttore.
  5. Determinare rilascio progressivo al tempo (t):
    rilascio cumulativo al momento (t) = uscita al momento (t) + rilascio precedente al momento (t-1).
  6. Tracciare rilascio cumulativo di BMP-2 e Nell-1 contro il tempo.

10. In Vitro bioattivitàdi Nell-1

Nota: la bioattività di Nell-1 rilasciato dalla PEC è stata valutata misurando la sua capacità di aumentare l'espressione di fosfatasi alcalina (ALP) nelle cellule staminali del midollo coniglio ossee (rBMSC).

  1. Seed 20.000 rBMSCs per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e consentire loro di crescere per un giorno con 1 ml di Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) + 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di 1 ml di un mezzo osteogenico (DMEM supplementato con 10% FBS, 2% di penicillina streptomicina, / ml di acido ascorbico 50 mg, 10 mmol / L beta-glicerofosfato e 10 -8 mol / L desametasone ) per 7 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2.
  3. Mettere 300 mg PEC-nell-1 (dal punto 8.2) e PEC all'interno inserti colture cellulari (TC insert) per mantenere i PEC separati dalle cellule (questo evita il dilavamento delle microsfere PEC durante la osteogenica cambio medio). Luogo TC inserire nel 24 ben plmangiato per 14 giorni.
  4. Una volta ogni tre giorni, aspirare 1 ml del mezzo osteogenico inserendo un ago al di fuori l'inserto TC, e sostituirlo con 1 ml di mezzo fresco osteogenico.
  5. Dopo 7 e 14 giorni di incubazione, determinare l'attività ALP con un kit di test ALP secondo il protocollo del produttore del kit.
    1. cellule Lisare con tampone contenente 0,1% TritonX-100 a 4 ° C per 10 min. Raschiare le cellule aderito con un raschietto cellulare. Incubare sospensione cellulare a 4 ° C sotto agitazione per almeno 60 min.
    2. Centrifugare la sospensione cellulare a 2500 xga 4 ° C per 10 min. Raccogliere il surnatante per il saggio ALP.
    3. Aggiungere 50 ml di soluzione standard di fosfatasi alcalina serialmente diluiti 200-0 ng / ml ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Gli importi finali delle serie fosfatasi alcalina sono 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15, e 0 ng / pozzetto.
    4. Aggiungere il surnatante dal punto 10.5.2 (50 ml / pozzetto) e diluire con la diluizione bUffer.
    5. Aggiungere 50 ml di p -nitrophenyl soluzione di fosfato (pNPP) substrato in ciascun pozzetto. Mescolare i reagenti agitando delicatamente la piastra per 30 sec. Incubare la miscela per 30 minuti al buio. Misurare l'assorbanza a 405 nm con lettore di piastre.
    6. Calcola l'attività ALP alla curva di taratura.
  6. Determinare contenuto proteico utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​microBCA secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare l'attività ALP dividendo l'attività ALP dal contenuto proteico.

11. vitalità cellulare

  1. Incubare 200 mg di PEC-nell-1 con 1 ml di DMEM + 10% FBS a 37 ° C per 24 ore per la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) saggio.
  2. Seme 2.000 rBMSCs per pozzetto (in 100 ml di DMEM con 10% FBS) in una piastra da 96 pozzetti e incubare per 1 giorno a 37 ° C, 5% CO 2.
  3. Sostituire DMEM + 10% FBS con 100 ml di estratto di PEC-nell-1 / PEC e incubarea 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Dopo 1 giorno o 3 giorni di incubazione, aggiungere 10 ml di 5 mg / ml soluzione MTT e in seguito incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 4 ore al buio.
  5. Aggiungere 100 ml di DMSO soluzione ad ogni pozzetto per sciogliere i cristalli formazano.
  6. Determinare l'assorbanza a 570 nm con un lettore di micropiastre.
  7. Calcolare il tasso di crescita relativo:
    figure-protocol-1

12. Imballaggio in Ponteggio e BMP-2 & NELL-1 Caricamento in corso

  1. Confezione i PEC nei pori di una bioresorbable grado medico Polycaprolactone - fosfato tricalcico (MPCL-TCP) scaffold usando una spatola sterilizzato all'interno di una camera BSL-2.
  2. Aggiungere 1,5 mg / ml soluzione di BMP-2 o NELL-1 sul patibolo MPCL-TCP imballato con PEC e incubare una notte a 4 ° C.

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Risultati

Nel nostro vettore, protamina stato scelto come sostituto di poli-L-lisina come ha proprietà chimiche simili ed è approvato dalla FDA come antidoto di eparina. Risultati microscopio ottico mostrato che le microsfere non irradiate sono di forma sferica con un diametro di 267 ± 14 micron. (0,35 millimetri ugello, portata di 5 ml / ora e 5,8 kV). La maggior parte delle microsfere irradiati sono di forma a goccia. Il diametro misurato sulla parte turno delle microsfere irradiati era (ugello ...

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Discussione

Questo protocollo presenta un metodo per la preparazione dei PEC attraverso layer-by-layer autoassemblaggio. La struttura layer-by-layer viene visualizzato per mezzo analoghi fluorescenti di protamina, eparina, microscopia BMP-2 e Nell-1 e confocale. Assorbimento e rilascio prove dimostrano che l'eparina sulla PEC media osteogenica fattore di crescita l'assorbimento e il rilascio. L'efficienza di assorbimento del metodo PEC è: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Il vettore PEC ha una migliore modulazion...

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Dichiarazioni

Non abbiamo alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questi studi sono stati finanziati dal National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 e NMRC EDG/0022/2008.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acrodisc per scienze della vita 25  mm Filtro a siringa con 0,2  µ m Membrana Supor PALL PN4612Protamina sterile, soluzione di eparina mediante ultrafiltrazione
piastra a 24 pozzettiCell Star 662160
Piastra a 96 pozzetti Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro), MTTSigma AldrichM5655Misura della citotossicità di PEC-NELL-1
AcetoneFisher ScientificA/0600/17Precipitato CF-405
Protamina marcata
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025Misura della citotossicità del kit di
dosaggio della fosfatasi alcalina (ALP)AnaspecAS-72146
Cloruro di ammonioMerckArt 1145Reagente di arresto nella marcatura FITC
Dimetil solfossido anidro (DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345Solvente per isotiocianato fluorescente I
Dimetilsolfossido ( DMSO)Sigma AldrichDissolve  formazan 
AutoclaveHirayamaHU-110Sterilizzare le perle di alginato a vapore
Beta-glicerofosfatoSigma AldrichG9422
BMP-2 (Infondere l'innesto osseo Large II Kit) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA7510800Fattore di crescita osteogenico, la dialisi è necessaria per rimuovere il componente stabilizzatore che interferisce con l'accoppiamento FITC
Carbossibenzoilchin-2-carbossaldeide (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222Per quantificare la proteina NELL-1
Filtro cellulare (100  µ m)BD Science352360Tenere PEC per il test ALP
Raschietto cellulare 290  mm Larghezza lama 20  mmSPL Life Science90030Staccare la cellula dalla piastra a 24 pozzetti
CF 405S, Succinimidyl EsterSigma Aldrich SCJ4600013Colorante fluorescente blu per l'etichettatura della protamina
CF 594, HydrazideSigma AldrichSCJ4600031Colorante fluorescente rosso intenso per l'etichettatura dell'eparina
CentrifugaBeckman CoulterMicrofuge 22R
Microscopio confocaleOlimpo FV1000
DesametasoneSigma AldrichD4902Componente del mezzo di crescita osteogenico
destrano Colonne di desalinizzazionePierce (Thermo Scientific) 43230
DMEM Gibco 12320
BMP-2 Kit ELISA QuantikineR& D SystemDBP200Determinare il rilascio di BMP-2
Siero fetale bovino FBSHycloneSV30160.03
Isotiocianato di fluoesceina, Isomero ISigma AldrichF7250Colorante fluorescente verde per la marcatura NELL-1 e BMP-2
Inserti per colture cellulari ThinCert,
Per piastre a 24 pozzetti, Greiner sterile		 662630Previene il dilavamento PEC quando si cambia il mezzo osteogenico
Pompa a siringa Havard Appartus (11 plus)Apparato Havard70-2208
n-esano (>99%)Sigma Aldrich139386
EparinaSigma AldrichH3149Si lega con il fattore di crescita osteogenico
con dominio di legame dell'eparina
Acido cloridrico (37%)Merck100317altamente corrosivo
C8150
Kit di analisi delle proteine MicroBCAThermoscientific23235
Lettore di micropiastreTecanInfinite M200Per saggi ALP e microBCA
Incapsulatore cellulare Nisco NiscoEngineering IncUnità di incapsulamento VAR V1
Microscopio fluorescenteOlympusScaffold IX71
mPCL-TCP (la dimensione dei pori è 1,3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Tenere PEC per studio in vivo
Penicillina-Streptomicina 10.000 unità/ml, 100  mlColtura cellulare HycloneSV30010Antibiotico
10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)VivantisPB0344-1L10x Soluzione,
Poli-L-lisina di grado ultra puro MW 15.000-30.000Sigma AldrichP2568Sale di solfato di protamina per policatione
, da SalmonSigma AldrichP4020Agitatore per policatione
LabnetS2025
Tubo per dialisi in pelle di serpente 3.500 MWCO 22  mm x 35 piediThermo Fisher Scientific68035Rimuovere il FITC non reagito mediante dialisi
Cloruro di sodioMerck1.06404.1000
Idrossido di sodioQrecS5158
Bicarbonato di sodioUS BiologicalS4000Buffer
Carbonato di sodioSigma AldrichS7795-500GBuffer
Cloruro di stronzio EsaidratoSigma Aldrich 255521Crosslinker per alginato
Spatola3dia
Siringa da 5 mlTerumo140425RIl diametro della siringa influisce sulla portata
75 cm2 Pallone per colture cellulari Collo inclinatoCorning730720
Toluidina BlueSigmaAldrich 52040Saggio
Tripsina 1xColtura cellulare di icloneSH30042.01
Alginato di sodioNovamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGMateriale di base delle microsfere
PEC-BMP-2 Legante per incubatore dell'eparina

Riferimenti

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