Articolo metodologico

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

DOI:

10.3791/54202

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22 agosto 2016

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1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

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I complessi polielettrolitici autoassemblati (PEC) fabbricati da eparina e protamina sono stati depositati su perle di alginato per intrappolare e regolare il rilascio di fattori di crescita osteogenici. Questa strategia di somministrazione consente una riduzione di 20 volte della dose di BMP-2 nelle applicazioni di fusione spinale. Questo articolo illustra i vantaggi e la fabbricazione dei PEC.

Abstract

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Durante interventi di chirurgia ricostruttiva di ossa, quantità sovrafisiologici di fattori di crescita sono empiricamente caricati su ponteggi per promuovere fusione ossea successo. Le grandi dosi di agenti biologici molto potenti sono necessari a causa del fattore di crescita instabilità a seguito della degradazione enzimatica rapida nonché inefficienze carrier nella localizzazione di sufficienti quantità di fattore di crescita nei siti implantari. Quindi, le strategie che prolungano la stabilità dei fattori di crescita come la BMP-2 / NELL-1, e controllare il loro rilascio potrebbe effettivamente ridurre il loro dosaggio efficace e quindi ridurre la necessità di dosi più elevate durante i futuri interventi di rigenerazione ossea. Questo a sua volta consentirà di ridurre gli effetti collaterali e costi dei fattori di crescita. PEC auto-assemblati sono stati fabbricati per fornire un migliore controllo della BMP-2 / NELL-1 consegna via vincolante eparina e l'ulteriore crescita potenziare fattore bioattività, migliorando la stabilità in vivo. Qui illustriamo la semplicità di fabbricazione PEC, che aiuta nella delivery di una varietà di fattori di crescita durante chirurgia ricostruttiva ossee.

Introduzione

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L'incidenza di pseudoartrosi è stato segnalato per essere alto come 10 a 45% in degenerative fusione spinale e revisione chirurgia spinale 1. Per ridurre il tasso di pseudoartrosi durante la fusione spinale e altri interventi chirurgici ricostruttivi ossa, fattori di crescita osteogeniche come BMP-2, Nell-1 1 e fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) sono stati introdotti per la promozione de novo osteogenesi. Tra questi, BMP-2 è una scelta popolare per la fusione spinale 2. Sebbene la potenza di BMP-2 nell'induzione e facilitare la formazione di nuovo osso è stato ben stabilito 3; complicanze clinicamen....

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Protocollo

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1. alginato Soluzione Preparazione

  1. Sciogliere 200 mg di alginato di sodio (non irradiati) o 400 mg di 8 MRad irradiato alginato di sodio in 10 ml di acqua bidistillata e agitare per 1 ora per alginato non irradiata e 15 min per alginato irradiato. Conservare la soluzione di alginato a 4 ° C durante la notte. Filtrare la soluzione di alginato con un filtro siringa da 0,2 micron sterile prima alginato fabbricazione microperla.

2. alginato microperla Fabrication

  1. Disinfettare il generatore elettrostatico tallone e pompa a siringa con il 70% di etanolo e metterli in una classe II Cappa di sicurezza biologica

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Risultati

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Nel nostro vettore, protamina stato scelto come sostituto di poli-L-lisina come ha proprietà chimiche simili ed è approvato dalla FDA come antidoto di eparina. Risultati microscopio ottico mostrato che le microsfere non irradiate sono di forma sferica con un diametro di 267 ± 14 micron. (0,35 millimetri ugello, portata di 5 ml / ora e 5,8 kV). La maggior parte delle microsfere irradiati sono di forma a goccia. Il diametro misurato sulla parte turno delle microsfere irradiati era (ugello .......

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Discussione

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Questo protocollo presenta un metodo per la preparazione dei PEC attraverso layer-by-layer autoassemblaggio. La struttura layer-by-layer viene visualizzato per mezzo analoghi fluorescenti di protamina, eparina, microscopia BMP-2 e Nell-1 e confocale. Assorbimento e rilascio prove dimostrano che l'eparina sulla PEC media osteogenica fattore di crescita l'assorbimento e il rilascio. L'efficienza di assorbimento del metodo PEC è: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Il vettore PEC ha una migliore modulazion.......

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Dichiarazioni

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Non abbiamo alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questi studi sono stati finanziati dal National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 e NMRC EDG/0022/2008.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acrodisc per scienze della vita 25  mm Filtro a siringa con 0,2  µ m Membrana Supor PALL PN4612Protamina sterile, soluzione di eparina mediante ultrafiltrazione
piastra a 24 pozzettiCell Star 662160
Piastra a 96 pozzetti Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro), MTTSigma AldrichM5655Misura della citotossicità di PEC-NELL-1
AcetoneFisher ScientificA/0600/17Precipitato CF-405
Protamina marcata
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025Misura della citotossicità del kit di
dosaggio della fosfatasi alcalina (ALP)AnaspecAS-72146
Cloruro di ammonioMerckArt 1145Reagente di arresto nella marcatura FITC
Dimetil solfossido anidro (DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345Solvente per isotiocianato fluorescente I
Dimetilsolfossido ( DMSO)Sigma AldrichDissolve  formazan 
AutoclaveHirayamaHU-110Sterilizzare le perle di alginato a vapore
Beta-glicerofosfatoSigma AldrichG9422
BMP-2 (Infondere l'innesto osseo Large II Kit) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA7510800Fattore di crescita osteogenico, la dialisi è necessaria per rimuovere il componente stabilizzatore che interferisce con l'accoppiamento FITC
Carbossibenzoilchin-2-carbossaldeide (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222Per quantificare la proteina NELL-1
Filtro cellulare (100  µ m)BD Science352360Tenere PEC per il test ALP
Raschietto cellulare 290  mm Larghezza lama 20  mmSPL Life Science90030Staccare la cellula dalla piastra a 24 pozzetti
CF 405S, Succinimidyl EsterSigma Aldrich SCJ4600013Colorante fluorescente blu per l'etichettatura della protamina
CF 594, HydrazideSigma AldrichSCJ4600031Colorante fluorescente rosso intenso per l'etichettatura dell'eparina
CentrifugaBeckman CoulterMicrofuge 22R
Microscopio confocaleOlimpo FV1000
DesametasoneSigma AldrichD4902Componente del mezzo di crescita osteogenico
destrano Colonne di desalinizzazionePierce (Thermo Scientific) 43230
DMEM Gibco 12320
BMP-2 Kit ELISA QuantikineR& D SystemDBP200Determinare il rilascio di BMP-2
Siero fetale bovino FBSHycloneSV30160.03
Isotiocianato di fluoesceina, Isomero ISigma AldrichF7250Colorante fluorescente verde per la marcatura NELL-1 e BMP-2
Inserti per colture cellulari ThinCert,
Per piastre a 24 pozzetti, Greiner sterile		 662630Previene il dilavamento PEC quando si cambia il mezzo osteogenico
Pompa a siringa Havard Appartus (11 plus)Apparato Havard70-2208
n-esano (>99%)Sigma Aldrich139386
EparinaSigma AldrichH3149Si lega con il fattore di crescita osteogenico
con dominio di legame dell'eparina
Acido cloridrico (37%)Merck100317altamente corrosivo
C8150
Kit di analisi delle proteine MicroBCAThermoscientific23235
Lettore di micropiastreTecanInfinite M200Per saggi ALP e microBCA
Incapsulatore cellulare Nisco NiscoEngineering IncUnità di incapsulamento VAR V1
Microscopio fluorescenteOlympusScaffold IX71
mPCL-TCP (la dimensione dei pori è 1,3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Tenere PEC per studio in vivo
Penicillina-Streptomicina 10.000 unità/ml, 100  mlColtura cellulare HycloneSV30010Antibiotico
10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)VivantisPB0344-1L10x Soluzione,
Poli-L-lisina di grado ultra puro MW 15.000-30.000Sigma AldrichP2568Sale di solfato di protamina per policatione
, da SalmonSigma AldrichP4020Agitatore per policatione
LabnetS2025
Tubo per dialisi in pelle di serpente 3.500 MWCO 22  mm x 35 piediThermo Fisher Scientific68035Rimuovere il FITC non reagito mediante dialisi
Cloruro di sodioMerck1.06404.1000
Idrossido di sodioQrecS5158
Bicarbonato di sodioUS BiologicalS4000Buffer
Carbonato di sodioSigma AldrichS7795-500GBuffer
Cloruro di stronzio EsaidratoSigma Aldrich 255521Crosslinker per alginato
Spatola3dia
Siringa da 5 mlTerumo140425RIl diametro della siringa influisce sulla portata
75 cm2 Pallone per colture cellulari Collo inclinatoCorning730720
Toluidina BlueSigmaAldrich 52040Saggio
Tripsina 1xColtura cellulare di icloneSH30042.01
Alginato di sodioNovamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGMateriale di base delle microsfere
PEC-BMP-2 Legante per incubatore dell'eparina

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C.

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