Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Sommario

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Abstract

Nel complesso, l'adesione cellulare T è un componente critico della funzione, contribuire ai processi distinti di assunzione cellulare per siti di infiammazione e di interazione con cellule presentanti l'antigene (APC) nella formazione di sinapsi immunologica. Questi due contesti di adesione delle cellule T si differenziano che T interazioni cellula-APC può essere considerato statico, mentre le interazioni dei vasi cellule T del sangue sono sfidati dal shear stress generato da circolazione stessa. interazioni cellule T-APC sono classificati come statico dal fatto che i due partner cellulari sono relative statico a vicenda. Solitamente, questa interazione avviene nei linfonodi. Come una cellula T interagisce con la parete dei vasi sanguigni, le cellule arrestano e devono resistere alla sollecitazione di taglio generate. ^1,2 Queste differenze evidenziano la necessità di comprendere meglio l'adesione statica e aderenza in condizioni di flusso come due processi normativi distinti. Il regolamento di adesione delle cellule T possono essere più succintamente descritta come contraina stato affinità delle integrine molecole espresse sulla superficie cellulare, e regolando così l'interazione delle integrine con leganti molecola di adesione espresse sulla superficie della cellula interagenti. La nostra attuale comprensione del regolamento di integrine stati affinità viene dal spesso semplicistico nei sistemi modello in vitro. Il saggio di adesione con condizioni di flusso qui descritte permette la visualizzazione e la quantificazione precisa delle cellule epiteliali interazioni delle cellule T in tempo reale dopo uno stimolo. Un'adesione sotto test flusso può essere applicata a studi di aderenza segnalazione all'interno delle cellule T dopo il trattamento con sostanze inibenti o stimolatori. Inoltre, questo test può essere espansa al di là di segnalazione delle cellule T a qualsiasi popolazione adesiva leucociti e qualsiasi coppia molecola di integrina-adesione.

Introduzione

T adesione dei linfociti media una serie di processi distinti in un sistema immunitario sano, ³ giocare un ruolo critico nel traffico delle cellule T e presentazione dell'antigene. Sia durante la sorveglianza immunitaria o una risposta immunitaria attiva queste due grandi ruoli per l'adesione sono fondamentali. ⁴ Gli eventi di segnalazione fisiologiche di cellule endoteliali interazioni delle cellule T sono distinti da cellule T che presentano l'antigene delle cellule (APC) interazioni, e quindi richiedono metodi distinti di studio per comprendere meglio le cascate di segnalazione coinvolte. La ferma adesione di una cellula T a una p....

Protocollo

1. placcatura le cellule CHO-ICAM

Nota: Lo scopo di questa fase è quello piastra cellule CHO-ICAM nelle camere di flusso per la crescita notte con l'obiettivo di generare un monostrato confluente.

1. Mantenere le cellule CHO-ICAM a 10 cm di tessuto-coltura trattata piatti della cultura in 10 ml di mezzi RPMI con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (CHO-ICAM completa terreni di coltura) a 37 ° C con 5% CO _2.
2. Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina-EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto agitando delicatamente. Neutralizzare la tripsina con 4 ml di media.
3. C....

Risultati

Risultati rappresentativi sono mostrati dal saggio di adesione flusso utilizzando Jurkat e ^cellule T CD3 umani primari, come indicato, stimolate con SDF-1α. I controlli negativi in ​​tutti gli esperimenti riportati sono cellule non stimolate. Una adesione soglia basale percentuale di cellule non stimolate è compresa tra 5 - 10%; Adesione bassa in particolare al di sopra di questo intervallo indica un esperimento problematico e suggerisce la popolazione inizio di cellule T sono.......

Discussione

Per analizzare correttamente l'adesione delle cellule T, lo stimolante da includere nello studio deve essere considerato nella scelta di un metodo in vitro. Mentre ci sono diversi metodi per studiare i segnali che portano a LFA-1 attivazione e ICAM-1 vincolante tutti i metodi non sono intercambiabili. Un test di adesione statica ¹⁰ è più adatto per studiare le interazioni delle cellule T-APC; In alternativa, il metodo descritto qui sforzo di taglio è ideale per modellare cellule epiteliali intera.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Campioni di cellule T (linea cellulare o primarie)	ATCC	TIB-152	Cellule T umane periferiche
Cellule CHO-ICAM-1	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
Flacone in vetro da 500 ml	Fisher	FB800500
Flacone in vetro da 250 ml	Fisher	FB800250
Silicone tubo 0,8 mm	ibidi	10841
Microscopio confocale con camera incubatrice	Ziess	700	Qualsiasi microscopio fluorescente a campo largo
Pompa a siringa	New Era Pump Systems	NE-300
Siringa da 60 ml	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1&;	R& D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuga	Eppendorf	5424
D-glucosio	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Software Volocity	Perkin Elmer	Versione 6.2.1
Software ImageJ		NIH Versione 1.48V
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale	Falcon	353003
Tripsina-EDTA (0,25%) Rosso fenolo	Gibco	25200114
FBS inattivato a caldo	Denville	FB5001-H
Penicillina/Streptomicina	Fisher	BP295950