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Summary

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Abstract

Nel complesso, l'adesione cellulare T è un componente critico della funzione, contribuire ai processi distinti di assunzione cellulare per siti di infiammazione e di interazione con cellule presentanti l'antigene (APC) nella formazione di sinapsi immunologica. Questi due contesti di adesione delle cellule T si differenziano che T interazioni cellula-APC può essere considerato statico, mentre le interazioni dei vasi cellule T del sangue sono sfidati dal shear stress generato da circolazione stessa. interazioni cellule T-APC sono classificati come statico dal fatto che i due partner cellulari sono relative statico a vicenda. Solitamente, questa interazione avviene nei linfonodi. Come una cellula T interagisce con la parete dei vasi sanguigni, le cellule arrestano e devono resistere alla sollecitazione di taglio generate. ^1,2 Queste differenze evidenziano la necessità di comprendere meglio l'adesione statica e aderenza in condizioni di flusso come due processi normativi distinti. Il regolamento di adesione delle cellule T possono essere più succintamente descritta come contraina stato affinità delle integrine molecole espresse sulla superficie cellulare, e regolando così l'interazione delle integrine con leganti molecola di adesione espresse sulla superficie della cellula interagenti. La nostra attuale comprensione del regolamento di integrine stati affinità viene dal spesso semplicistico nei sistemi modello in vitro. Il saggio di adesione con condizioni di flusso qui descritte permette la visualizzazione e la quantificazione precisa delle cellule epiteliali interazioni delle cellule T in tempo reale dopo uno stimolo. Un'adesione sotto test flusso può essere applicata a studi di aderenza segnalazione all'interno delle cellule T dopo il trattamento con sostanze inibenti o stimolatori. Inoltre, questo test può essere espansa al di là di segnalazione delle cellule T a qualsiasi popolazione adesiva leucociti e qualsiasi coppia molecola di integrina-adesione.

Introduction

T adesione dei linfociti media una serie di processi distinti in un sistema immunitario sano, ³ giocare un ruolo critico nel traffico delle cellule T e presentazione dell'antigene. Sia durante la sorveglianza immunitaria o una risposta immunitaria attiva queste due grandi ruoli per l'adesione sono fondamentali. ⁴ Gli eventi di segnalazione fisiologiche di cellule endoteliali interazioni delle cellule T sono distinti da cellule T che presentano l'antigene delle cellule (APC) interazioni, e quindi richiedono metodi distinti di studio per comprendere meglio le cascate di segnalazione coinvolte. La ferma adesione di una cellula T a una parete del vaso sanguigno durante linfociti stravaso richiede l'attivazione rapida e dinamica integrina. La stretta interazione tra uno stato attivo integrine e di adesione molecole lungo l'endotelio conduce alla resistenza al flusso di sangue adesione, consentendo alle cellule T per strisciare lungo la superficie alla ricerca di un'area permissivo per il passaggio delle cellule. ⁵ La scansione di un bi cellule T -directionally alonga parete dei vasi sanguigni è legato alla adesione polarizzato, con una distinta adesiva estremità anteriore della cellula T. ⁶ Soprattutto, ferma adesione e la trasmigrazione richiedono resistenza alla forza di taglio generata dal flusso di sangue circolante.

Durante la progettazione di esperimenti per studiare l'adesione dei linfociti, occorre prestare attenzione allo stimolo specifico di interesse. Mentre integrina attivazione è un componente comune e critica di tutte le forme di adesione cellulare T, le cascate di attivazione sono suscettibili di essere unico valle dei singoli recettori e corecettori. Allo stesso modo, le coppie integrina e molecola di adesione funzionano in microambienti specializzate e su sottopopolazioni specifiche. In questo modo, queste coppie possono essere regolati in modo diverso. Il modello qui presentato è l'ideale per lo studio delle cascate di segnalazione che portano alla integrina attivazione che si svolgono in condizioni di stress di taglio. ⁷ Queste interazioni non può essere adeguatamente compreso in un Pellicole staticail sistema a causa dell'impatto hanno dimostrato queste forze di avere direttamente sul comportamento delle cellule T. ⁸ Anche qui presentata con le cellule T e le cellule CHO (ovaio di criceto cinese) ingegnerizzate per esprimere (cellule CHO-ICAM) umana ICAM-1, il sistema può essere facilmente modificato per studiare diverse popolazioni dei leucociti o molecole di adesione.

Questa analisi fornisce un metodo per quantificare l'adesività delle cellule T e l'attivazione delle integrine con sforzo di taglio, fornendo un modello per lo stadio ferma adesione dei leucociti stravaso. Attraverso l'uso di cellule CHO-ICAM l'affinità di LFA-1 per il suo ligando in cellule vive può essere esaminata in tempo reale in risposta a vari stimoli di interesse. Questa tecnica richiede facilmente ottenuta, disponibili in commercio camere di micro-flusso in combinazione con una pompa a siringa, semplificando notevolmente l'attrezzatura necessaria per modellare il flusso sanguigno e sollecitazione di taglio rispetto ad altri modelli. ⁹ Un altro importante vantaggio di questo saggio è che la segnalazione specificacascate e lo stato di attivazione risultante singoli integrine possono essere pulito studiate attraverso l'uso di cellule CHO ingegnerizzate esprimono molecole di adesione umani di interesse. Inoltre, la combinazione di dati quantitativi con cellule vive è un significativo vantaggio di questo metodo. Nel complesso, mentre sono stati descritti una serie di saggi di adesione cellulare T statica che ben modellare le interazioni delle cellule T-APC, questi modelli non sono sufficienti a catturare il processo dinamico di adesione delle cellule epiteliali-T. Per questo motivo, quando si sceglie un saggio di adesione deve essere considerato lo stimolo in questione.

Protocol

1. placcatura le cellule CHO-ICAM Nota: Lo scopo di questa fase è quello piastra cellule CHO-ICAM nelle camere di flusso per la crescita notte con l'obiettivo di generare un monostrato confluente. Mantenere le cellule CHO-ICAM a 10 cm di tessuto-coltura trattata piatti della cultura in 10 ml di mezzi RPMI con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (CHO-ICAM completa terreni di coltura) a 37 ° C con 5% CO 2. Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina-EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto agitando delicatamente. Neutralizzare la tripsina con 4 ml di media. Contare le cellule CHO-ICAM utilizzando un emocitometro e calcolare 0.75 x 10 5 cellule per camera. Nota: In questo esperimento: saranno necessari 2,25 x 10 5 cellule per seminare 3 camere. Centrifuga 0,75 x 10 5 cellule CHO-ICAM per camera per 5 minuti a 500 xg, a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 30 ml per camera di CHO-ICAM Terreni di coltura completo. Nota: In questo esperimento saranno necessari 90 ml di sementi 3 camere. Aggiungere lentamente le cellule in un serbatoio della camera di flusso. Permettono alle cellule di stabilirsi per 5 minuti nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. Aggiungere 200 ml di terreni di coltura completo tra i due serbatoi di ciascuna camera. aggiunte alternare tra i due per evitare il movimento delle cellule, come il sistema equilibra. Incubare le cellule durante la notte all'interno di un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2. 2. Preparazione delle cellule T Nota: Questo test può essere fatto con le cellule umane T primarie o una linea cellulare T. Un protocollo su isolamento delle cellule T da sangue è stato descritto in precedenza. 10 Se si utilizzano cellule T umane primarie utilizzano cellule appena isolate per i migliori risultati. Se si utilizza una linea cellulare T, seguire il protocollo coltura specificato dalla fonte delle cellule. Al fine di individuare le cellule su un microsco fluorescentepe le cellule T sono etichettati con carbossi estere succinimidyl fluoresceina (CFSE). Contare le cellule T utilizzando un emocitometro e calcolare 2 x 10 6 cellule per camera. Nota: In questo esperimento, saranno necessari 6 x 10 6 cellule per 3 camere. Centrifugare 2 x 10 6 cellule per T camera per 5 min a 500 xg, a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) contenente 1% di glucosio o 2% FBS. Aggiungere CFSE a 1: 1.000 diluizione (magazzino fatta a 5 mm). Coprire dalla luce e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente Spin a 500 xg per 5 minuti, RT. Risospendere il pellet cellulare con 240 pl per condizione (vedere il paragrafo 4 "Note") di RPMI mezzi privi di siero. In questo esperimento, risospendere il pellet cellulare in 720 ml di pianura RPMI. Dividere le celle vuote in provette da 1,5 ml etichettate per ciascuna camera, 240 ml per provetta. Mantenere le cellule in un blocco C di calore 37 ° fino al momento dell'uso. 3. Impostazione °e Input / Output condutture e pompa a siringa Riscaldare il microscopio dal vivo camera di imaging a 37 ° C. Preparare il tubazioni di ingresso: Riempire una bottiglia di vetro da 500 ml con acqua e fare 2 fori nel coperchio. Etichettare i fori "in" e "out". Questo fungerà da un bagno di acqua di riscaldamento per i mezzi di ingresso. Eseguire l'ingresso getti attraverso i fori del coperchio e nel bagno d'acqua. Assicurarsi che il lato della tubazioni che collega alla siringa passa attraverso il "in" foro e la parte che si collega al serbatoio di ingresso passa attraverso il "out" buco. Lavare l'ingresso getti con 60 ml di acqua per rimuovere l'aria dal sistema. Primo l'ingresso getti con i media RPMI privo di siero riscaldato a 37 ° C. Riempire una siringa da 60 ml e spingere attraverso i media fino a quando il tubazioni è completamente innescato e privo di eventuali bolle d'aria. Nota: A seconda del length di tubo utilizzato il volume richiesto per primo varierà. Calcolare il volume del supporto necessari per l'esperimento moltiplicando la velocità del flusso (qui 0,3 ml / min) per il numero di minuti (5 min) per il numero di camere nell'esperimento (qui 3); in questo esperimento, utilizzare 4,5 ml media. Nota: Si consiglia con 5 ml di volume extra (qui per un totale di 9,5 ml) rimanendo nella siringa dopo aver riempito. Posizionare l'intera impostazione di ingresso nel recinto di immagini dal vivo del microscopio per mantenere 37 ° C. Eseguire il tubazioni e la siringa fuori del recinto e caricare la siringa nella pompa a siringa. Preparare il tubazioni di uscita: Effettuare un foro nel coperchio di una bottiglia da 250 ml da utilizzare come rifiuti uscita. Eseguire il tubo di uscita attraverso il foro e nella bottiglia. Liberamente fissare il coperchio, non chiudere tutta la strada. Posizionare la messa a punto di uscita nel recinto di immagini dal vivo del microscope. Calcolare la portata (ml / min) necessario per generare la tensione di taglio desiderata (dyn / cm 2). Lo sforzo di taglio varia nei diversi compartimenti vascolari, quindi prendere in considerazione il modello globale che comprende tipi di cellule da studiare e trattamenti momento di decidere su un livello di stress di taglio. Nota: Questi esperimenti sono condotti a 0,4 dine / cm 2 per imitare da vicino un piccolo ambiente vena. Prendere le dimensioni della camera in considerazione nel calcolo sforzo di taglio. Utilizzare la seguente formula (fornita dal produttore 11) per le camere a flusso usati qui (vedi Tabella dei Materiali): T = η * 176,1 * ø dove lo stress T = taglio, η = viscosità dinamica, ø = portata. Nota: La viscosità dinamica dei media RPMI a 37 ° C è 0.007. 4. Caricamento delle Camere di flusso e stimolazione delle cellule Nota: Al fine di avviare l'adesione,Le cellule T devono essere stimolati. Nel seguente esperimento le cellule o rimanere non stimolata o vengono stimolati con SDF-1α 12 o acetato forbolo miristato (PMA; controllo positivo) 13. Per una corretta presentazione delle chemochine a cellule T, cellule CHO-ICAM sono preincubate con SDF-1α (seguito da lavaggi di serie), che consente per la presentazione sulla superficie cellulare. PMA è un estere del forbolo che è strutturalmente simile al secondo messaggero diacil glicerolo (DAG); qui viene utilizzato come controllo positivo. Le cellule T sono direttamente trattati con PMA prima del caricamento nella camera di flusso. Posizionare il vetrino camera di flusso sul microscopio e impostare il piano focale sul monostrato CHO-ICAM con l'obiettivo 20X. Mantenere le cellule T CFSE-colorate per tutte le altre condizioni del blocco C di calore 37 °. Preparare le cellule CHO-ICAM o T come segue immediatamente prima del test per la condizione: Per la condizione non stimolato (camera 1), tenere un tubo / ch flussoambra non trattata, per servire come controllo negativo per la stimolazione. Per la stimolazione PMA (camera 2), di stimolare un tubo di cellule T con PMA (10 ng / ml) per servire come controllo positivo; il trattamento subito prima di caricare in camera di flusso. Per la stimolazione SDF-1α, (camera 3), stimolano la terza camera di flusso con SDF-1α (100 ng / ml) rimuovendo 70 microlitri alla volta 3 volte dal serbatoio superiore (serbatoio output) e quindi aggiungendo 70 ml di SDF -1α (100 ng / ml) nella (serbatoio ingresso) inferiore serbatoio. Incubare per 5 min. Rimuovere e gettare 70 microlitri alla volta 3 volte dal serbatoio di uscita di una camera. Aggiungere 70 ml di sospensione pre-trattati (a seconda dei casi) delle cellule T nel serbatoio di ingresso 3 volte. Attendere 5 min per permettere alle cellule di muoversi dalla ingresso della camera ( "In"), e per raggiungere l'uscita prossimale ( "Out") della camera. Durante questo tempo, immagine 5campi per le cellule T CFSE-macchiati. Scegliere campi che sono dispersi in tutto il centro della camera (Figura 1). Utilizzare le seguenti condizioni di eccitazione / emissione: eccitazione lunghezza d'onda del laser: 488 nm; filtro di raccolta di emissione: 500 – 540 nm. Queste immagini serviranno come i conteggi delle cellule pre-flow. Collegare il tubo di ingresso e uscita contemporaneamente ai serbatoi camera di flusso. Nota: fissaggio della tubazione contemporaneamente è critico in modo da non introdurre bolle d'aria nella camera e mantenere equilibrio globale entro la camera. Inizia flusso a 0,3 ml / min (0,4 dine / cm 2), mentre la visualizzazione delle cellule T CFSE-macchiati. Come flusso comincia, soprattutto con la prima camera, vi è spesso un ritardo tra l'avvio del flusso e osservando rotolamento delle cellule T, quindi iniziare a cronometrare 5 min all'inizio del movimento delle cellule T. Termina flusso dopo 5 min, e di immagine 5 campi nel canale CFSE. Scegli campi dispersi casualmente throughout centro della camera di flusso (Figura 1). Queste immagini serviranno come i conteggi delle cellule post-flow. 5. determinazione della percentuale di cellule aderenti Nota: Determinazione del numero delle cellule nelle immagini acquisite avviene oggettivamente con software automatizzato. Per i nostri studi abbiamo utilizzato il software Volocity (versione 6.2.1), ma altri software come ImageJ (versione 1.48V) sono applicabili anche. Determinare il numero di cellule per campo pre-flusso per ogni condizione. La media dei 5 campi è il "numero di celle media pre-flow." 7 Determinare il numero di cellule per campo post-flusso per ogni condizione. La media dei 5 campi è il "numero di celle media post-flow." 7 Calcolare la percentuale di cellule aderenti utilizzando la seguente formula: Percentuale di cellule aderenti = (post-flow conteggio medio delle celle) / (numero di cellule media pre-flow) x 100%.

Representative Results

Risultati rappresentativi sono mostrati dal saggio di adesione flusso utilizzando Jurkat e cellule T CD3 umani primari, come indicato, stimolate con SDF-1α. I controlli negativi in ​​tutti gli esperimenti riportati sono cellule non stimolate. Una adesione soglia basale percentuale di cellule non stimolate è compresa tra 5 – 10%; Adesione bassa in particolare al di sopra di questo intervallo indica un esperimento problematico e suggerisce la popolazione inizio di cellule …

Discussion

Per analizzare correttamente l'adesione delle cellule T, lo stimolante da includere nello studio deve essere considerato nella scelta di un metodo in vitro. Mentre ci sono diversi metodi per studiare i segnali che portano a LFA-1 attivazione e ICAM-1 vincolante tutti i metodi non sono intercambiabili. Un test di adesione statica ¹⁰ è più adatto per studiare le interazioni delle cellule T-APC; In alternativa, il metodo descritto qui sforzo di taglio è ideale per modellare cellule epiteliali int…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950