Isolamento e l'espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Sommario

Qui descriviamo i metodi per la dissezione dei tessuti fetali e materni da placenta umana termine, seguito da isolamento e l'espansione delle cellule stromali / staminali mesenchimali (MSC) da questi tessuti.

Abstract

Le cellule staminali/stromali mesenchimali (MSC) sono candidati promettenti per l'uso nelle terapie cellulari. Nella maggior parte dei casi, la risposta terapeutica sembra essere dipendente dalla dose cellulare. La placenta a termine umana è ricca di MSC ed è un tessuto fisicamente grande che viene generalmente scartato dopo la nascita. La placenta è un materiale di partenza ideale per la produzione su larga scala di dosi cellulari multiple di MSC allogeniche. La placenta è un organo feto-materno da cui è possibile isolare il tessuto fetale o materno. Questo articolo descrive l'anatomia placentare e la procedura per sezionare il tessuto decidua (materno), i villi coriali (fetali) e la placca corionica (fetale). Il protocollo delinea quindi come isolare le MSC da ciascuna regione tissutale sezionata e fornisce un'analisi rappresentativa delle MSC espanse derivate dai rispettivi tipi di tessuto. Questi metodi sono destinati all'isolamento preclinico delle MSC, ma sono stati anche adattati per la produzione clinica di MSC placentare per uso terapeutico umano.

Introduzione

Mesenchimali staminali / cellule stromali (MSC) stanno emergendo come un candidato promettente per l'utilizzo nelle terapie a base di cellule ^1. La maggior parte delle applicazioni sembrano indirizzare MSC-mediata riparazione dei tessuti o regolazione immunitaria ^2. In molte di queste applicazioni, allogenico MSC può essere efficace come MSC autologhe ^3. L'uso di MSC allogeniche ha il vantaggio economico di essere compatibile con la produzione su larga scala di dosi multiple di cellule da un unico tessuto sorgente ⁴ per trattare molti pazienti.

Storicamente, gli studi pre-clinici e clinici hanno utilizzato MSC-derivate dal midollo osseo ^4. Il midollo osseo viene generalmente raccolti dalla cresta iliaca di un donatore volontario. Questo processo è invasivo, e solo una piccola quantità di midollo (~ 20 ml) viene raccolto attraverso un'unica foratura. Generare numeri clinicamente significativi di MSC richiede una espansione in vitro. Cellulare la potenza diminuisce con il numero di passaggio ^{3, creando un paradosso dove il numero teorico di cellule necessario per efficacia clinica è aumentato più la popolazione cellulare è espanso. In contrasto aspirati di midollo osseo, placenta termine è fisicamente grande tessuto di partenza (tipicamente 500-750 g 4), che può essere raccolto asetticamente corso di taglio cesareo senza rischi per il donatore. MSC derivato dalla placenta presentano durature proliferazione 5 e immunomodulante capacità di 6, superiore alle ossa MSC derivate dal midollo. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che un singolo placenta termine conteneva MSC sufficienti per la produzione di fino a 7.000 dosi cliniche 4. Queste caratteristiche rendono placenta un tessuto fonte ideale per la produzione di MSC allogeniche.}

La placenta è un organo feto-materna, che consiste di tessuto fetale e materno ^7, e quindi MSC di origine fetale o materno può essere, teoricamente, isolato. I seguenti riferimenti forniscono deinformazioni tailed sullo sviluppo e la patologia, nonché esame microscopico e macroscopico della placenta umana e degli annessi ^8,9. La placenta corretta è composto in gran parte dei vasi sanguigni fetali e secretoria e cellule di sostegno chiamate trofoblasto, che costituiscono i villi coriali coperti dal frondosum chorion (piatto) ^8. I villi placentari ramificati sono bagnate nel sangue materno consegnati dalle arterie uterine a spirale, che consente di nutrienti, ormoni e lo scambio di gas tra il feto e la madre. La placenta è ancorato al endometrio tramite cellule stromali deciduali materne e fetali trophoblasts extravillious si alternano nella matrice extracellulare ^8. I villi convergono sulla piastra corionica fetale dove formano il cordone ombelicale ^8.

Un risultato del primo workshop internazionale sulle cellule staminali placentari-Derived (2008) è stato un apprezzamento della necessità di standardizzare l'isolamento e characterization di cellule dalla placenta umana termine ^10. A causa dell'anatomia della placenta, dissezione dei diversi tessuti, l'isolamento di MSC e dei risultati attesi cultura può essere schiacciante per i nuovi arrivati ​​al campo. In questo protocollo, la raccolta dei tessuti placentari coriali, seguito da isolamento MSC e l'espansione è accuratamente dettagliata. MSC caratterizzazione mediante citometria di flusso e nella differenziazione in vitro sono considerati di routine ^5,11-13, e quindi solo brevemente descritti.

Come evidenziato in una recente revisione sistematica della letteratura ^14, MSC ottenuto dai villi coriali placentari sono generalmente assunti come fetale. Sebbene, solo il 18% degli studi ha esaminato l'origine del MSC ottenuto, e di questi, solo la metà degli studi riportati MSC fetale e l'altra metà riferito popolazioni MSC materni o misti. Ciascuna delle tre componenti del tessuto descritti (villi coriali, piastra e decidua coriali basale) sono bozzettoosed soprattutto del feto membrana / villi, e una piccola percentuale di cellule materne uterine di derivazione, che rimangono attaccati alla placenta consegnato. Forniamo dati che dimostrino che isolare MSC dal lato materno della placenta, piuttosto che la parte fetale della placenta, come abbiamo riportato in precedenza ^5,11, è un materiale di partenza più appropriato se MSC materna sono desiderati. Questo protocollo descrive anche l'uso di XY FISH per validare contributo fetale o materno per colture cellulari. Mentre questo è un protocollo standard del produttore, questa analisi è spesso trascurato e la sua importanza sottovalutata ^14.

Protocollo

La ricerca comitati umani Etica presso Mater servizi sanitari, il Royal Brisbane e Women 's Hospital, Queensland University of Technology e dell'Università del Queensland ha approvato la ricerca e la raccolta di campioni di placenta umana utilizzati nello studio. Tutti i protocolli rispettate le linee guida di ricerca nazionali. Pazienti hanno fornito consenso informato scritto per l'uso di tessuti a scopo di ricerca.

placente terzo trimestre sono stati ottenuti da madri sane seguenti nascite di routine taglio cesareo (CS) a termine dagli ospedali di cui sopra a Brisbane, in Australia. Maschio gravidanze discordanti per campioni termine sono stati utilizzati in questo studio per distinguere fetale da cellule materne. Fetale genere era stato determinato con l'ecografia prima della nascita e / o il controllo visivo del neonato alla nascita da parte del personale clinico. X e Y fluorescenza cromosoma ibridazione in situ (FISH) è stata utilizzata per validare ulteriormente genere e origine fetale o materna di tessuto conservati dalplacente originali.

1. Prima di Harvest, preparare i seguenti

Nota: Quando si effettuano fino soluzioni enzimatiche, i requisiti e le concentrazioni specifiche fornite dal produttore per ciascun prodotto devono essere seguite. Gli enzimi sono spesso forniti come un mix grezza di proteine, quindi enzimi simili provenienti da diverse aziende possono avere diverse attività / concentrazioni. Per questo motivo il consiglio del produttore dovrebbe essere riconosciuto e preparazione soluzione potrebbe dover essere modificate di conseguenza.

1. Preparare o acquistare 1,5 a 2 L totale sterile soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per questo protocollo.
2. Preparare la soluzione di collagenasi I stock pesando tipo collagenasi I e sciogliere 1 mg / ml di HBSS e vortex delicatamente per garantire la completa dissoluzione. Determinare il volume di HBSS (contenente calcio e magnesio) necessaria per portare soluzione collagenasi a 100 unità (U) / ml (1,000x magazzino soluzione) e poi filtrare con un 0.2 &# 181; filtro siringa m. Aliquota volumi di 1 ml in provette da 1,5 ml e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
3. Preparare soluzione madre dispasi sciogliendo dispasi non sterile a 10 mg / ml in tampone fosfato salina Dulbecco (DPBS) senza calcio o magnesio. Diluire ulteriormente con DPBS senza calcio o magnesio ad una concentrazione finale di 2,4 U / ml. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. Aliquota 1 ml volumi in provette da 1,5 ml e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
4. Preparare deossiribonucleasi -I soluzione madre (DNasi) sciogliendo DNase-I a 10 mg / ml a 0,15 M NaCl. Filtro traverso un filtro siringa da 0,2 micron. Aliquota 1 ml volumi in provette da 1,5 ml e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
5. Preparare la soluzione di digestione di lavoro mediante la combinazione di 100 U ml tipo / collagenasi I, I.5 mg / ml DNasi I e 2,4 U / ml dispasi in DMEM senza siero. Appena sbrinamento e diluire le scorte enzima immediatamente prima dell'uso. Approssimativamente, un rapporto 1: 1 di soluzione di digestionevolume al volume del tessuto è necessaria (ad esempio 10 ml di tessuto, misurati in un tubo da 50 ml, richiede 10 ml di soluzione di digestione).
6. Preparare una soluzione di 4% paraformaldeide (PFA) in PBS e regolare a pH 7,4 ^15. Conservare 25 aliquote ml a -20 ° C per il lungo termine o a 4 ° C per 1 settimana.
7. Preparare MSC terreno di coltura da DMEM-basso livello di glucosio (DMEM-LG) integrato con soluzione antibiotica e antimicotica 1x e non di calore inattivato siero fetale bovino al 10%. FBS MSC-grade possono essere acquistati presso molti fornitori FBS.
8. Autoclave sterilizzare attrezzature dissezione in anticipo come da linee guida istituzionali. Questi includono le forbici, pinze, bisturi, e un grande vassoio di metallo dissezione. Raccogliere ulteriore sterile plasticware coltura di tessuti e materiali di consumo (ad esempio pale bisturi, 50 ml e 15 ml tubi, 25 ml, 10 ml e 5 ml pipette, e 75 o 175 palloni cm ² di coltura cellulare).
9. Utilizzare dispositivi di colture cellulari primarie di laboratorio standard: una classe II Bcabinet iosafety adatto per l'isolamento delle cellule primarie, colture cellulari incubatore fissato al 5% di CO ₂ e 37 ° C, un attuatore in un incubatore a 37 °, e una centrifuga con una capacità di 50 ml provette.
10. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale: un camice da laboratorio, 2 paia di guanti (in tutti i tempi), occhiali di sicurezza, e le scarpe vicino-piantati secondo linee guida istituzionali.
11. Preparare le soluzioni di decontaminazione appropriate per i campioni di sangue umano come da linee guida istituzionali e contenitori per rifiuti biologici liquidi in anticipo.

2. Isolamento della placenta MSC

1. Preparazione della placenta
   1. Abito in dispositivi di protezione individuale richiesto. Impostare la cappa di sicurezza biologica con materiali necessari, soluzioni e contenitori di rifiuti di effettuare la procedura sino alla digestione enzimatica (sezione 2.5.6).
   2. Ottenere una placenta con il consenso informato e l'approvazione etica. Raccogliere la placenta tramite sec cesareozione in condizioni chirurgiche asettiche, e il pacchetto in una sacca sterile o secchio per il trasporto al laboratorio.
   3. Durante il trasporto e prima di dissezione, memorizzare la placenta a temperatura ambiente oa 4 ° C.
      Nota: il tessuto può essere conservato per un massimo di 6 ore senza compromettere le prestazioni di coltura cellulare.
      1. Limitare il tempo tra la raccolta e il trattamento dei tessuti della placenta, ove possibile. Questa raccomandazione si basa su questioni pratiche. In alcuni casi, abbiamo ritardato il processo di isolamento delle cellule fino a 6 ore dopo la nascita. In questi casi la placenta sono state mantenute a temperatura ambiente oa 4 ° C (in laboratorio o al centro di raccolta). Non sono state osservate differenze rilevabili soprattutto variazione generale donatore, nel MSC ottenute da placenta quando sono stati conservati a 4 ° C oa temperatura ambiente.
   4. Posizionare il contenitore con la placenta nel gabinetto di sicurezza biologica. Aprire il contenitore e trasferire la placenta in un vassoio sterile.
   5. Aprire le membrane fetali (sacco amniotico o laeve amnion-corionica) ^8. Diventa orientato con le parti della placenta. La faccia fetale ha l'inserzione del cordone ombelicale, che è in generale, inserita centralmente nella placenta. Il lato materno (allineato con basalis decidua), che si trova di fronte al lato del feto, ha cotiledoni evidenti (o lobi).
   6. Per iniziare la dissezione, orientare la placenta con il cordone ombelicale rivolto verso l'alto nel vassoio sterile.
      Nota: Questo protocollo è progettato per produrre cellule sufficiente per seme in un pallone T175 da ciascuno dei tre tipi di tessuto. Ogni Digest inizia con circa 10 g di tessuto. Questo è un numero di partenza simile di flaconi come culture MSC avviate da un midollo aspirato da 20 ml osso. Se più celle sono desiderati, quindi più tessuto può essere raccolto e il protocollo può essere scalata in modo lineare. Le dimensioni di tessuto da raccolte sono indicativi di ciò che è pratico con il tessuto placentare. Ci sono pochi definincaratteristiche g nel villi placentale, che può essere utilizzato come punto di riferimento. Le dimensioni indicate servono come stima e il cordone ombelicale viene utilizzato come punto di riferimento sulla superficie fetale.
2. Dissezione del (D) Tissue deciduale
   1. Capovolgere la placenta sopra la superficie in modo materno (basale decidua) è rivolto verso l'alto. Assicurarsi che il lato del feto con il punto di inserimento del cordone ombelicale sia rivolta verso il basso.
   2. Tagliare pezzi di 0,5 cm di spessore dal lato materno della placenta (che contiene il tessuto decidua basale).
   3. Mettere pezzi di tessuto in una capsula di Petri contenente HBSS durante la dissezione per tenere i pezzi di tessuto idratato.
   4. Trasferire il tessuto sufficiente a riempire un tubo fino al segno 10 ml in un tubo da 50 ml (questa è di circa 10 g di tessuto).
3. La dissezione della Piastra corionica (CP) Tissue
   1. Meccanicamente rimozione della membrana amniotica dalla superficie fetale della placenta (non il sacco amniotico), lasciando il chofrondosum rionic (piastra corionica) intatto.
   2. Tagliare pezzi ~ 1 cm di larghezza di 0,5 cm di profondità dalla piastra coriali. Raccogliere la piastra corionica dalla regione vicina al cordone ombelicale, dal bordo della placenta.
   3. Mettere pezzi di tessuto in una capsula di Petri contenente HBSS durante la dissezione per tenerli idratata.
   4. Trasferire il tessuto sufficiente a riempire un tubo da 50 ml fino al segno 10 ml (~ 10 g di tessuto).
4. La dissezione del corionica Villi (CV) Tissue
   1. Sezionare CV tessuto ~ 1 cm ² x 0,5-1 cm di profondità dal tessuto placentare in cui è già stato rimosso il CP. Ancora una volta, il raccolto CV della regione più vicina al cordone ombelicale, dal bordo della placenta. Provate a stare ad almeno 1 cm di distanza dal lato materno della placenta (che contiene il tessuto decidua basale); l'obiettivo è di raccogliere il tessuto dall'interno del tessuto villi placentare.
   2. Mettere pezzi di tessuto in una capsula di Petri contenente HBSS durante la Dissection per tenerli idratata.
   3. Trasferire il tessuto sufficiente a riempire un tubo da 50 ml fino al segno 10 ml (~ 10 g di tessuto).
5. Tritare e digestione enzimatica della D, CP, e CV placentari tessuti
   1. Come ci sono ~ 10 g di D, tessuti CP o CV in tre diverse provette da 50 ml, riempire ogni provetta con circa 40 ml di HBSS e più volte invertono il tubo per lavare il tessuto (ripetere per ~ 10 sec).
   2. Decantare il surnatante e ripetere l'operazione di lavaggio 2-3 volte fino a quando la soluzione è in gran parte libera dal sangue. Utilizzare una pipetta 10 ml o lunghe pinzette per garantire i pezzi di tessuto non vengono persi dal tubo (s) quando decantazione del supernatante.
   3. Rientro pezzi di tessuto di un 10 cm capsula di Petri con il trasferimento di liquidi minimo. Chop / tritare il tessuto in pezzi sottili di circa 1-5 mm ³ con le forbici o lama di rasoio.
   4. Trasferire i tessuti tritate di nuovo in modo appropriato con l'etichetta (D, CP o CV) provette da 50 ml.
   5. Aggiungere appena prepared digest media in almeno un rapporto 1: 1 con il tessuto (ad esempio 10 ml di tessuto più 10 ml di digerire media). Sostituire il tappo su ciascun tubo e invertire i tubi diverse volte per mescolare.
   6. Incubare i tessuti nei tubi con digerire mezzi per 1-2 ore a 37 ° C. Una atmosfera umidificata e 5% CO ₂ non sono necessari per questo passaggio.
      Nota: agitazione Rapid è necessaria per dissociare efficacemente le cellule dal tessuto e massimizzare la resa MSC. Contenuta resa sarà evidente da pochissime cellule attaccate al pallone di coltura a 48 ore ed un primo tempo di passaggio più di 1-2 settimane. Il tempo di incubazione e il metodo agitando dipende dal incubatore a 37 ° disponibili in laboratorio e possono richiedere ottimizzazione.
      1. Per un incubatore con una rapida e controllabile meccanismo di agitazione, luogo dei tessuti e digerire media in un tubo da 50 ml o beuta sterile, posto in incubatrice e impostare velocità di agitazione a 250 giri al minuto. Questo si tradurrà in un digest completoil tessuto in 1 ora.
      2. In alternativa, per un incubatore con un dondolo dolce o nessun meccanismo oscillante, agitare a mano il tubo rapidamente e vigorosamente a mano per 10 secondi ogni 30 minuti per 1,5 a 2 ore. Il periodo di incubazione enzima è un momento adatto per scartare i rifiuti, cancellare l'armadio biosicurezza di oggetti inutili, cambiare camice da laboratorio se sporca e prepararsi per la parte successiva della procedura.
6. Raccolta di cellule mononucleari e placcatura in Boccette
   Nota: Dal passaggio precedente, ci sono tre provette da 50 ml (D, CP o CV) con digerire pezzi di tessuto. Quando la soluzione digest tessuto evolve un aspetto torbido e vasi sanguigni bianchi sono evidenti nel tessuto, la digestione è completa.
   1. Aggiungere 30 ml di media MSC contenente FBS ad ogni provetta per inattivare gli enzimi contenuti nella soluzione di digestione.
   2. Per separare le cellule mononucleate dal detriti di grandi dimensioni non digerito, impulso centrifugare la provetta 50 ml. Brevemente, consentirela centrifuga per raggiungere 340 x g per 5 secondi e poi fermarsi. Questo forzerà il grande detriti sedimentare sul fondo della provetta, lasciando le cellule mononucleari in sospensione liquida.
      Nota: Le cellule mononucleate resteranno in fase liquida se il tubo è solo brevemente (pulsato) centrifugato. Se centrifugazione è esteso, le cellule mononucleari anche sedimentare sul fondo del tubo con i pezzi di tessuto, con conseguente perdita di cellule indesiderabile.
   3. Raccogliere il surnatante, contenente le cellule mononucleari, e trasferire questo in un nuovo tubo 50 ml con una pipetta.
   4. Aggiungere 30 ml di media o HBSS per i detriti tessuto placentare rimanente e agitare vigorosamente. Questo porterà rimanenti cellule mononucleari staccati in sospensione e consentire un secondo raccolto di MSC putativo dal tessuto.
   5. Pulse centrifugare la provetta una seconda volta, e ancora trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 ml. Ripetere questa operazione una terza volta per massimizzare l'efficienza di raccoltadi cellule mononucleate da ciascuna fonte tissutale.
   6. Pool sovranatanti da ciascuno dei singoli tipi di tessuto in due provette da 50 ml. Questo produrrà 6 tubi totali (2 tubi di ogni D, CP e CV). Centrifugare ogni provetta per 5 min a 340 x g. Questo passaggio agglomerare le cellule mononucleari al fondo delle provette.
   7. decantare con attenzione o una pipetta il surnatante nei rifiuti. Non è necessario cercare di eliminare ogni goccia di surnatante.
      Nota: Il pellet cellulare sarà fragile a causa di un gran numero di globuli rossi. Fare attenzione a non eliminare accidentalmente il pellet se si sta decantazione direttamente dal tubetto da 50 ml.
   8. Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, picchietti leggermente la provetta diverse volte con un dito per staccare il pellet. Unire i pellet, in modo che vi sia un unico tubo per ogni D, CP o CV tessuti e risospendere ciascuna in 35 ml di MSC media.
   9. Facoltativo: filtra la frazione mononucleare attraverso un colino cella 100 micron maglia u setp in un tubo da 50 ml per rimuovere grumi di cellule o materiale fibroso.
      Nota: Cura è richiesta come i filtri possono facilmente intasare e sovra-riempimento. Inoltre, le bolle d'aria possono ostruire i filtri si scarichi. Se si verifica ciò, sollevare lentamente il filtro dal tubo per consentire all'aria di fluire sotto il filtro, lavare con filtro attraverso mezzi di coltura cellulare o lo scambio di un nuovo filtro. Escludendo la fase di filtraggio non sembra alterare la resa o la qualità delle successive culture MSC.
      1. Facoltativamente, un globuli rossi (RBC) lisi o densità gradiente di centrifugazione può essere effettuato in questa fase ^15. Tuttavia, la nostra esperienza è che RBC non interferiscono con il collegamento MSC o la proliferazione e, pertanto, RBC lisi non è necessario. Le cellule mononucleate potrebbero essere contati in questa fase se la rimozione RBC è stata effettuata ^15. Sebbene, la stragrande maggioranza delle cellule in questa fase non sarà MSC, ma essere trophoblasts fetali origine, cellule endoteliali e cellule ematopoietiche, nonché macellule ematopoietiche origine Ternal e cellule stromali decidua.
   10. Trasferire la sospensione cellulare per ogni D, CP o tessuto CV in un unico pallone e coltura T175 in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO _2.
7. Espansione post di isolamento delle cellule
   1. A 48 ore dopo l'isolamento iniziale, rimuovere il terreno da ciascuno dei flaconi (D, CP e CV) e sostituire con 35 ml di mezzi freschi MSC. Il mezzo trascorso e le cellule staccate possono essere scartati, come MSC putativo si presume essere collegato al pallone di coltura tissutale ^16. Rientro palloni per l'incubatore per altre 24 ore.
   2. Dopo altre 24 ore di coltura, lavare i flaconi due volte con DPBS (25 ml) per rimuovere i detriti e globuli rossi. Agitare il liquido intorno alla parte inferiore del pallone per rimuovere RBC. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido e detriti. Aggiungere 35 ml di MSC media per i palloni e restituire i palloni per l'incubatore.
   3. Sostituire i media due volte alla settimana, e inculture cubate fino a quando i monostrati cellulari sono 80- 90% confluenti. Questa espansione iniziale richiede 4-14 giorni, a seconda della qualità del tessuto, la quantità di materiale e di efficienza e tempo di incubazione iniziano con la soluzione di analisi.

3. sottocultura di PMSC

1. Quando le culture sono 80-90% confluenti, lavare due volte con 20 ml 1x HBSS o DPBS e scartare lavaggi. Aggiungere tripsina-sostituto per ogni pallone (cioè usare 5 ml per un pallone T175).
2. Incubare le beute per 5 min a 37 ° C per liberare MSC dalla superficie di coltura tissutale. Toccare le pareti del pallone ogni ~ 2 min per facilitare il distacco.
3. Quando le cellule vengono staccate dalla superficie e in una sospensione di cellule singole, lavare le cellule dal matraccio con supporto MSC e raccogliere le cellule in provette. I media MSC diluire e disattivare la tripsina-sostituto (uso ~ 15 ml di MSC supporto per bombola T175).
4. Trasferire il contenuto di ogni pallone di coltura di tessuto ad un 50tubo ml.
5. Tubi centrifugare a 340 xg per 5 minuti per agglomerare le cellule.
6. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 1 ml di MSC media.
7. Diluire 10 ml di sospensione cellulare in 10 microlitri trypan blu. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il numero totale di cellule ^15.
8. Trasferire le cellule a nuovi flaconi a 1.150 cellule / cm ² in mezzi freschi MSC e incubare in un incubatore di coltura tissutale. A questa densità di semina, semi di 200.000 MSC in ogni nuovo pallone T175 in 35 ml di MSC media. Nutrire le cellule due volte a settimana fino a 80-90% confluenti. Seed passaggi successivi a 1.150 cellule / cm ² o 200.000 MSC in ogni pallone T175.
9. Quando il passaggio 1 (P1) o cellule P2 sono confluenti, cryopreserve la maggioranza delle cellule per uso futuro, e reinizializzare solo un pallone T175 per ulteriore moltiplicazione e caratterizzazione. Le cellule propagate possono essere usati a P3 o P4 per i test di differenziazione mesoderma e caratterizzazione delle cellule tramite flOW citometria.
   Nota: Nei primi passaggi, ci possono essere poche colonie scarsamente separati, ma la densità cellulare locale all'interno di ogni colonia può essere molto elevata. Questo non è ideale, come l'imballaggio densa locale delle cellule comporta inibizione da contatto, ritardando la crescita e riducendo le prestazioni cultura. Si consiglia quando si osservano colonie dense, le cellule devono essere raccolte e reseeded in un nuovo fiasco. Questo processo di ridistribuzione fornisce le cellule con stanza a proliferare, e le prestazioni generali della cultura sarà migliorata.
10. Per cryopreserve MSC, raccogliere ~ 1 x 10 ⁶ cellule in 1 ml di 90% FCS e 10% dimetilsolfossido (DMSO) e congelare utilizzando protocolli standard.
    Nota: Nella sezione rappresentante risultati, ci sono descrizioni di MSC caratterizzazione mediante citometria a flusso, la differenziazione mesoderma e l'analisi FISH XY per determinare il sesso del tre differenti (D, CP e CV) popolazioni di cellule espanse. Nel nostro studio, placente sono stati da neonati maschi; così tutticellule fetali potrebbero essere distinti come maschio (cromosoma Y) e tutte le cellule materne potrebbero essere distinti come femmina (solo cromosoma X).

Risultati

La procedura di isolamento MSC placentare è riassunto in Figura 1. Le tre aree anatomiche placentare da cui sono stati isolati MSC sono evidenziate nella figura 2. Questi sono i decidua materna, così come i tessuti fetali gran parte della piastra corionica e villi corionica. Molti libri di testo, articoli e on-line dettaglio le risorse per lo sviluppo e il ruolo funzionale dei vari tessuti placentari (si rimanda riferimento ^8).

Morfologia delle culture 48 ore dopo l'isolamento e la rimozione dei detriti di tessuto.
Dopo 48 ore di cultura, la MSC avrà attaccato alla plastica coltura di tessuti, mentre i globuli rossi e molti altri detriti cellulari non hanno attaccato. A questo punto, il mezzo deve essere sostituito con 35 ml di terreno di coltura fresco. Prima di questo mezzo di scambio, è difficile fare osservazioni precise causa dellagran numero di globuli rossi, che ostruiscono valutazione visiva. L'aspetto del surnatante cultura può variare notevolmente tra i donatori placenta. Questa variazione può essere visto visivamente nell'esempio 1 e 2 (Figura 3A). Questi due isolamenti MSC, che sembrava essere molto diverso, sono state eseguite contemporaneamente da due placente diverse. Tuttavia, una volta lavato, entrambe le culture apparivano simili (vedi esempio lavato 3, Figura 3A).

Sotto un microscopio, dopo lo scambio supporti 48 hr, solo alcune cellule saranno fissate al pallone (Figura 3B), e le cellule appariranno significativamente diverso da MSC più estesamente espanse. Alcuni detriti e GR saranno visibili come grumi galleggianti o allegate e questi non interferiscano con la crescita del MSC. Le cellule più fibroblastica aderito al fondo del pallone sono suscettibili di essere una miscela di cellule compresi MSC, ematopoietico,trofoblasto o cellule endoteliali. Anche in questo caso, le cellule non-MSC non compromettono le culture MSC, come queste cellule non saranno generalmente sopravvivere più di 1-2 passaggi nelle condizioni di coltura MSC. Nonostante qualche variazione nel aspetto iniziale delle culture, i successivi risultati di espansione sono generalmente coerenti.

Morfologia delle culture MSC nel corso del tempo.
In questo esempio rappresentativo, sette giorni di isolamento, piccole colonie MSC fibroblastici erano visibili, anche se le cellule non-MSC potrebbe anche essere visto come rotonda o cellule debolmente collegate (figura 4a). Le cellule attaccate sono ciò che è stato originariamente definito una "unità formanti colonia -fibroblast "(CFU-F) ¹⁷ e successivamente chiamato MSC ^18. Tredici giorni dopo l'isolamento, le colonie MSC fibroblastic erano grandi (Figura 4B). Generalmente, il monostrato sarà 80-90% confluenti a questo punto e le celle deve essere passa GED. Dal passaggio 2 in poi, la MSC monostrato placentare svilupperà la caratteristica morfologia idromassaggio simile a confluenza (Figura 4C). A meno che le cellule sono diversi passaggi a bassa densità, non sarà più osservata la formazione CFU-F. A bassa densità, MSC placentare-derivati ​​hanno un aspetto più piccolo, più squadrata di adulti osso MSC derivate dal midollo ^1. Mentre MSC placentare di derivazione e del midollo osseo MSC-derivati ​​mostrano tassi di proliferazione simili, le cellule placentari di derivazione sono meno inclini ad una rapida senescenza ^5.

Caratterizzazione delle MSC placentare in vitro.
Ciascuna popolazione cellulare estesa deve essere caratterizzata per garantire che sia conforme ai criteri MSC standard di ^16, tra (1) aderenza plastica (2) la presenza di marcatori di superficie mesenchimali e l'assenza di marcatori di superficie ematopoietiche, e (3) la capacità di subire mesodermal differenziazione.

1 ":" fo = together.within-Restare-"> placentare MSC sono aderenti plastica.
Come mostrato in figura 4, le cellule staminali mesenchimali in coltura sono plastico aderente e hanno una morfologia fibroblastica simile; Ciò conferma che le cellule rispondono ai primi criteri che definiscono MSC ^16.

Mostra MSC marcatori di superficie mesenchimali placentare.
La seconda caratteristica distintiva MSC è la presenza di marcatori di superficie mesenchimali e l'assenza di marcatori di superficie ematopoietiche ^16. Poiché non esiste un unico indicatore in grado di identificare definitivamente un MSC, pannelli di marcatori sono generalmente utilizzati in combinazione con l'analisi di citometria a flusso per identificare le cellule che sono mesenchimali, ma non ematopoietiche. Nel set di dati rappresentativi qui fornite (Figura 5A), abbiamo valutato l'espressione di marcatori di cellule mesenchimali CD73, CD105, CD90, CD146, e CD44, i marcatori emopoietiche CD45 e CD34 e HLA-DR, come well come il CD31 marcatore endoteliale. Tutti gli anticorpi utilizzati in questo processo di caratterizzazione placentare MSC sono elencati nella tabella dei materiali / attrezzature. La colorazione è stata eseguita secondo le istruzioni del fabbricante, con metodi di analisi descritti qui ^19.

Le cellule sono stati positivi per i marcatori mesenchimali CD73, CD105, CD44, e negativi per i marcatori di superficie delle cellule CD45, CD34, HLA-DR e CD31, come previsto ^5,20. Approssimativamente, il 37% e il 57% delle cellule del nostro insieme di dati rappresentativi sono stati positivi per CD90 e CD146 ^21, rispettivamente. Sia CD90 e CD146 sono comunemente utilizzati MSC marcatori ^21. Profili di marcatori di superficie delle cellule MSC possono essere diversi a seconda della fonte di MSC tessuto, la composizione media, o il numero di passaggio ^22. Nei nostri molti anni di esperienza, non abbiamo osservato la contaminazione a lungo termine della placenta-derived MSC con cellule non mesenchimali dopo 1-2 passaggi ^5,11.

Display MSC placentare potenziale di differenziazione mesenchimale
Per definizione, MSC deve possedere in vitro mesoderma capacità di differenziazione ^5,13. potenziale di differenziazione mesoderma è comunemente valutata sia attraverso saggi di differenziazione tri- o bi-lignaggio. saggi Bi-lignaggio generalmente valutano osteogenico e la capacità di differenziazione adipogenico, mentre le analisi tri-lignaggio valutare ulteriormente la capacità di differenziazione condrogenico. Nei risultati rappresentativi qui presentati, si dimostra che le popolazioni MSC Formulario di entrambi i depositi di calcio, indicative di differenziazione osteogenico, e vacuoli lipidici, indicativo di adipogenesi (Figura 5B).

Per caratterizzare le popolazioni MSC qui riportati, abbiamo seminato cellule in 24 pozzetti di coltura a 6 x 10 ⁴ cellule in 1 ml di terreno di induzione. Il compo medionenti sono elencati nella tabella dei materiali / attrezzature. Mentre induzione formulazioni medie sono comuni in letteratura, esiste una notevole variabilità nelle formulazioni pubblicati. Per questo motivo riportiamo brevemente le nostre formulazioni di induzione di media e approcci di colorazione qui. induzione a media Osteogenic conteneva DMEM-HG, 10% FBS, 1x soluzione antimicotico antibiotico, 10 mM β-glicerolo fosfato, 100 nM desametasone, e 50 mM di acido L-ascorbico 2-fosfato. induzione a media adipogenico conteneva DMEM-HG, 10% FBS, 1x soluzione antimicotico antibiotico, 10 ug / ml di insulina, 100 nM desametasone, 200 pM indometacina, e 500 pM xantina 3-isobutil-1-metil. Qui, le colture sono state mantenute a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore e coltivate per 14 giorni. medio induzione è stato scambiato due volte alla settimana durante il periodo della cultura. Dopo 14 giorni di induzione, le culture sono stati caratterizzati sia per matrice ossea-like (osteogenesi) o vacuoli lipidici (adipogenesis) come per la nostra prevpubblicazione pagherò ^5. Osteogenico analisi deposizione di matrice di calcio è stato ottenuto prima aspirando il mezzo, che fissa le culture con 4% paraformaldeide per 20 minuti, lavare il monostrato con DPBS, e poi colorazione con Alizarina Rossa S secondo le istruzioni del fabbricante. induzione adipogenico stata valutata aspirando il mezzo, che fissa le culture con 4% paraformaldeide per 20 minuti, lavare il monostrato, e colorazione con soluzione Oil Red O secondo le istruzioni del fabbricante. depositi di calcio macchiati e vacuoli di petrolio sono stati poi visualizzati con un microscopio ottico, e le immagini salvate per riferimento futuro.

In pubblicazioni precedenti, abbiamo caratterizzato il potenziale di differenziazione delle MSC placentare di derivazione più estesamente ^4,5. Placentare di derivazione MSC osteogenesi è simile a quella dell'osso MSC derivate dal midollo, mentre adipogenesi è generalmente meno efficiente nella placenta-derived MSC ^{5 <}/ Sup>. Non abitualmente svolgiamo differenziazione condrogenico per diversi motivi, anche se questo è stato riportato in precedenza da noi per placentare-MSC ^5. In primo luogo, mentre la capacità di differenziazione mesoderma è una caratteristica distintiva della MSC, è probabile che di secondaria importanza ^23-25, specialmente dove il beneficio terapeutico è probabile che sia derivato dalle secrezioni MSC paracrini ^26. In secondo luogo, anche se Dominici et al. Ha proposto i criteri minimi per la produzione clinica degli adulti osso MSC derivate dal midollo umano ^16, studi più recenti indicano MSC provenienti da diverse nicchie hanno differenti proprietà intrinseche e capacità di differenziazione ^5,13,27-32. In realtà, Parolini et al. Ha proposto che MSC placenta-derived dovrebbe differenziarsi in linee "uno o più mesodermiche", piuttosto che tutte e tre le linee ^10. Infine, molti studi MSC incluse differenziazione condrogenico come si verifica attraverso una similepathway di segnalazione intracellulare come osteogenesi (TGFβ percorso di famiglia) ^33-35.

Placentare MSC sono materna in origine utilizzando questo metodo di coltura, nonostante la posizione anatomica del materiale di partenza.
Molte pubblicazioni per scontato che le cellule isolate dal rendimento corion MSC fetale fetale sulla cultura ^14. Tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza ^5, tutte le culture derivati ​​da chorion del feto, utilizzando questo protocollo, rapidamente diventato arricchito per materno MSC come sarebbe intuitivamente essere previsto per le materne culture MSC deciduali. In questi risultati rappresentativi abbiamo usato tessuto placentare da neonati maschi in modo che fosse possibile delineare facilmente il contributo delle cellule fetale e materno nelle popolazioni cellulari espansi. Per questi studi è stato utilizzato il kit di FISH XY elencati nella tabella dei materiali / attrezzature, e seguito le istruzioni del produttore.

(Figura 6) . In passaggio 2, le popolazioni cellulari derivate da tessuti materni erano ~ 100% cellule materne (XX), e le cellule fetali (XY) erano rilevabili. Questo suggerisce che la dissezione fisica del tessuto materno portato ad arricchire cellule materne nelle colture successive. Tuttavia, è fondamentale prendere in considerazione gli esiti della cultura dal villi coriali fetale e culture piastra di derivazione coriali. Al passaggio 0, sia fetale villi corionica e corionici piastra derivato colture erano ~ 85% XY, o di origine fetale, indicando che la dissezione mirato arricchita in cellule fetali (Figura 6). Al passaggio 0, entrambe le culture contenevano ~ (XX) contaminazione del 15% delle cellule materna. Sorprendentemente, al passaggio 2, entrambe le culture fetali sono stati popolati con ~ 100% di cellule materne (XX), e le cellule fetali (XY)non erano più rilevabili. XY analisi FISH rivela che le cellule materne (cromosomi XX) rapidamente e costantemente pubbliche di acquisto delle culture derivano dai tessuti fetali coriali. Si tratta di una osservazione critica della cultura che viene spesso trascurato ^5. Il dettaglio di questa analisi è incluso in questo protocollo perché dimostra l'osservazione molto importante che le cellule materne rapidamente popolano tutte le culture quando DMEM supplementato con 10% FBS viene utilizzato senza ulteriori fattori destinati a sostenere le popolazioni fetali-derivati.

Figura 1:. Riassunto delle procedura di isolamento MSC placentare (Fase 1) orientarsi con l'anatomia placenta. (Fase 2) sezionare manualmente 10 g di tessuto sia dal decidua, villi coriali o la piastra corionica con le forbici. (Fase 3) Mince tha sezionato porzioni di decidua, villi coriali o tessuti piastra coriali in pezzi sottili con le forbici o un bisturi.
(Fase 4) Liberate le cellule dai pregiati pezzi tramite una digestione 1-2 ore in dispasi e collagenasi I.
(Fase 5) separare le cellule dal tessuto fibroso mediante centrifugazione impulsi e / o lavaggio attraverso un colino cella. Raccogliere e risospendere le cellule in terreno di coltura e messo in fiasche di coltura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

cellule stromali mesenchimali (MSC) saranno selezionati in base alla loro propensione per l'adesione di plastica e la capacità di sopravvivere e proliferare nel terreno di coltura. Infine, nella sezione risultati, il MSC espansa può essere caratterizzato e conservato per esperimenti futuri.

Figura 2:. Anatomia della placenta termine e tessuti umani isolati in questa procedura Il primo tessuto da raccolta è decidua materna. Decidua è tessuto che rimane in uno strato sottile sulla superficie della placenta dopo che è versato dalla parete uterina (decidua viene identificato dai marcatori verdi). Il secondo tessuto che verrà raccolto dall'interno della placenta è fetale villi corionica (marcatori blu). Il terzo tessuto per essere raccolto è piatto fetale corionica (indicatori rossi) (adattato da riferimento ^36). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Morfologia delle culture 48 ore dopo l'isolamento e rispostando i detriti dei tessuti. (A) L'aspetto del surnatante cultura può variare notevolmente tra i donatori placenta prima di lavare via i detriti. Esempio culture 1 e 2 dimostrano questa variazione. Questi due isolamenti sono stati eseguiti simultaneamente, ma da due diverse placenta. Una volta lavati culture sarà chiaro di globuli rossi e detriti dei tessuti, come mostrato nell'esempio 3. I successivi risultati di espansione sono generalmente coerenti. (B) In seguito allo scambio dei media 48 ore, solo poche cellule verrà allegato al pallone. Scala bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Morfologia di culture MSC nel corso del tempo (A) Sette giorni dopo l'isolamento, piccola fcolonie MSC ibroblastic sono visibili anche se le cellule non-MSC saranno presenti anche come rotonda o cellule vagamente collegati. (B) 13 giorni dopo l'isolamento, le colonie MSC fibroblastic sono grandi e spesso il monostrato di MSC è confluenti e pronto per il passaggio. (C) dal passaggio 2 in poi, il monostrato MSC svilupperà una morfologia caratteristica idromassaggio simile a confluenza. Scala bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. MSC caratterizzazione mediante citometria di flusso e la differenziazione mesodermica (A) La gonadotropina MSC placentare villi-derivato visualizzare un classico profilo marcatore MSC mediante citometria a flusso di analisi, anche se per questi marcatori di superficie delle cellule, Expressione è simile per tutti i tipi di MSC umana. Ogni istogramma mostra l'intensità del segnale (asse x) rispetto al numero di celle normalizzato y (% del massimo). In questi dati rappresentativi set le cellule erano positive per CD73, CD105 e CD44, e negativo per i marcatori ematopoietici CD45 e CD34 e HLA-DR. (B) placentare MSC generalmente sottoposti robusto differenziazione osteogenico, tuttavia (C) differenziazione adipogenico può essere meno efficiente con l'osso MSC derivate dal midollo. Immagini in didascalie B e C sono state prese a 40X di ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6: MSC placentare sono materna in origine utilizzando questo metodo di coltura, nonostante la posizione anatomica del materiale di partenza.I grafici mostrano la quantificazione del feto (maschile, XY) e materna (femmina, XX) la composizione delle cellule delle culture MSC placentari isolati da decidua, villi coriali e tessuti piastra coriali ad ogni secondo passaggio. cellule materne (XX) rapidamente e riproducibile prendere in consegna le culture derivate da tessuti fetali coriali. Fetale = maschio = cromosomi XY rilevati in una cella singola, materni = femmina = xx cromosomi rilevati in una cella singola. I dati presentati qui era da N = 3 placente donatori indipendenti di neonati di sesso maschile, con un minimo di 100 cellule colorate per XY FISH e contati per ogni punto di dati. Barre rappresentano le medie, e barre di errore riflettono una deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

La placenta è fisicamente grande organo feto-materna, da cui MSC fetale o materno può essere isolata ^22. Qui, abbiamo fornito una panoramica dettagliata di anatomia placentare e istruzioni su come sezionare specificamente decidua (materna), villi coriali (fetale), e il tessuto piatto corionica (fetale) (Passo 2.2-2.4). Successivamente, abbiamo delineato un protocollo robusto che permette l'isolamento MSC da ciascuno di questi tre tessuti (passo 2.5-2.6). Espansione placentare MSC è efficiente e culture apparire simile a midollo osseo culture MSC (Figure 3 e 4). Differenziamento osteogenico è affidabile (Figura 5B), mentre la differenziazione adipogenico è generalmente meno efficiente (Figura 5C) ^5.

Molti nuovi arrivati ​​al campo saranno presumere che le culture derivate da fetale villi coriali o tessuti piastra coriali saranno arricchiti per fetale MSC. Tuttavia, nelle nostre mani fearricchimento delle cellule tal è solo transitoria quando media espansione MSC standard come DMEM-LG + 10% FBS è utilizzato ^5. Qui forniamo risultati rappresentativi utilizzando tessuti placentari derivati ​​da un bambino di sesso maschile. Utilizzando tessuti di placenta da un bambino di sesso maschile, le cellule fetali sono facilmente identificabili come avere i cromosomi XY, mentre le cellule materne sono identificabili come avere i cromosomi XX. La figura 6 mostra XY risultati FISH per una cultura rappresentante. Mentre MSC fetale (XY) sono arricchiti (fino all'80%) nelle colture iniziali derivate da fetale villi corionica o tessuti piastra coriali, queste stesse culture sono rapidamente superate (~ 100%) materna (XX) MSC nei primi due passaggi . In mezzo standard, composto da DMEM-LG + 10% FBS, i pochi MSC materno-derivati ​​che contaminano i tessuti fetali outcompete le cellule fetali di derivazione nella cultura.

Un passo fondamentale delineato in questo protocollo è un apprezzamento dell'anatomia placentare e da dove fetalee dei tessuti materni può essere più efficace raccolta. Come indicato nella sezione rappresentante risultati, la dissezione di tessuto fetale non consentire l'arricchimento transitoria per MSC feto-derivati. Miglioramenti in espansione medio formulazione, attraverso specifiche medie supplementazione fattore di crescita esogena dovrebbero consentire l'espansione selettiva delle popolazioni MSC fetali-derivati, e la produzione di un prodotto cellulare che si arricchisce per fetale piuttosto che cellule materne (il nostro gruppo sta attualmente sviluppando tali formulazioni di media). La fabbricazione delle popolazioni MSC fetali può avere un numero di vantaggi, come MSC fetale sono preteso per avere una maggiore angiogenesi e proprietà immunosoppressive che equivalente popolazioni MSC materni ^37.

In ciascuno dei protocolli di isolamento descritti, abbiamo usato circa 10 g di tessuto. Un intero placenta è tipicamente 500-750 g, e nel lavoro precedente abbiamo dimostrato che attraverso il tessuto automatizzato digest e un bioreattore proc espansione delle celluleesses che dovrebbe essere possibile produrre oltre 7.000 dosi di cellule clinici da una sola placenta ^4. Questi numeri evidenziano la potenziale idoneità di MSC placentare-derivati ​​nelle terapie MSC allogeniche, e il significato di questo metodo indipendentemente dall'origine MSC (fetale o materno). Dal punto di vista terapeutico, è più critico che gli utenti hanno una comprensione completa del prodotto cellulare e la capacità di produrre in modo affidabile questo prodotto cellulare. Ci auguriamo che il nostro video vi aiuterà i ricercatori a capire l'anatomia della placenta, isolare MSC dalla placenta, e anticipare la probabile composizione delle cellule fetali o materna delle loro culture.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagents
HBSS	Gibco/Invitrogen	14185-052	Nome lungo: Soluzione salina bilanciata Hanks
FBS	Gibco/Invitrogen		Nome lungo: Siero fetale bovino sostitutivo
tripsina	Gibco/Invitrogen	12563-029	Nome lungo: TrypLE Select
DMEM-LG	Gibco/Invitrogen	11885-092	Nome lungo: Dulbecco' s Modified Eagles Glucosio medio-basso
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Nome lungo: Dulbecco' s Eagles modificato Glucosio medio-alto (4,5 g/L)
PBS (senza Mg+Ca+)	Gibco/Invitrogen	14190-250	Nome lungo: Dulbecco's Phosphate tamponato soluzione salina, magnesio e calcio libero
Anti- anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Nome lungo: soluzione antibiotica-antimicotica x100
polvere di paraformaldeide o soluzione al 4%	qualsiasi
Collagenasi I	Invitrogen	17100-017	2.500 U/ml
Dnase I	Sigma	D5025	10 mg/ml in  0,15 M NaCl
Dispase	Invitrogen	17105-041	10 mg/ml in acqua (20.000 U/ml).
Materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Monouso:
50 ml provette da centrifuga	Falcon o di qualsiasi marca
, plactico sterile (25 cm e 10 cm di diametro)	Nunc
Filtri cellulari (100 μ m)	Becton Dickinson	352340
175 e 75 cm2 (T175 e T75) fiasche per colture tissutali	Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml pipette serologiche sterili	qualsiasi marca
Materiale	Azienda<	forte>Numero di catalogo	Commenti
Equipaggiamento:
Centrifuga
incubatore per coltura tissutale 37 ° C, 5% CO2
Armadio
Forbici e pinzette
Rack per tubi
Pipette-boy o equivalenti
tipo Gilson pipetter e puntali sterili 1.000 &; l, 200 & micro; l, 20 µl.
incubatrice a dondolo o agitante (37 ° C)
dispositivi
soluzioni per la pulizia (adatte per sangue)
contenitori per rifiuti, contenitori per lo smaltimento corretto di tessuti/sangue
Reagenti per la caratterizzazione delle MSC
Anticorpo (Clone ID)	Produttore	N. di catalogo	Isotype
CD73 (AD2)	Miltenyi Biotec	130-095-183	IgG1 di topo
CD105 (43A4E1)	Miltenyi Biotec	130-094-941	IgG1 di topo
CD90/Thy-1 (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-403	IgG1 di topo
CD45 (5B1)	Miltenyi Biotec	130-080-202	IgG2a di topo
CD34 (AC136)	Miltenyi Biotec	130-090-954	IgG2a di topo
HLA-DR (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-298	IgG2a di topo
CD31 (PECAM-1)	BD Pharmingen 555446		IgG1 di topo
CD146 (541-10B2)	Miltenyi Biotec	130-092-849	IgG1 di topo
CD44 (DB105)	Miltenyi Biotec	130-095-180
Controlli dell'isotipo IgG1 di topo (ID clone)	Produttore	N. di catalogo
Isotipo di IgG1 di topo (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-214
Isotipo di IgG1 di topo (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-212
Isotipo IgG1 di topo (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-213
IgG2a di topo (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-091-837
IgG2a di topo (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-098-849
Tampone MACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Differenziazione osteogenica	Produttore	Codice prodotto
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Nome lungo: Dulbecco' s Modified Eagles Medio-alto glucosio (4,5 g/L)
FBS	Gibco/Invitrogen		Nome lungo: siero fetale bovino
Anti- anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Nome lungo: soluzione antibiotico-antimicotica x100
Desametasone	Sigma	D4902
β-glicerolo Phophate	Sigma	50020
Acido L-ascorbico 2-fosfato	Sigma	A8960-5G
Alizarin Red S	Sigma	A5533-25G	Per colorazione con matrice di calcio
Differenziazione adipogenica	Manufacturer	Codice prodotto
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Nome lungo: Dulbecco' s Modified Eagles Medio-alto glucosio (4,5 g/L)
FBS	Gibco/Invitrogen		Nome lungo: siero fetale bovino Anti
- anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Nome lungo: soluzione antibiotica-antimicotica x100
insulina	Sigma	I2643
Desametasone	Sigma	D4902
Indometacina	Sigma	I7378
3-isobutile-1-metil xantina	Sigma	I5879
Olio Red O soluzione		Sigma O1391-250ML	Per colorazione del vacuolo lipidico
XY Kit FISH per determinare l'origine fetale o materna delle cellule
XY kit FISH omosoma	Vysis (Abbott Molecular)	07J20-050	Nome lungo: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Kit di sonde per DNA fluorescenti con etichetta diretta