Un metodo per l'allevamento di Drosophila melanogaster in condizioni axeniche e gnotobiotic è presentato. Fly embrioni vengono dechorionated in ipoclorito di sodio, trasferiti asetticamente alla dieta sterili, e allevati in contenitori chiusi. Inoculando dieta ed embrioni con i batteri porta ad associazioni gnotobiotic, e la presenza di batteri è confermata dalla placcatura di tutto il corpo omogenati Drosophila.
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Articolo metodologico
Allevamento la mosca della frutta
In questo articolo
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Sommario
Abstract
L'influenza dei microbi su una miriade di tratti e comportamenti animali è stata sempre più riconosciuta negli ultimi anni. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è un modello per la comprensione delle interazioni microbiche con gli ospiti animali, facilitato da approcci per allevare campioni di grandi dimensioni di Drosophila in condizioni prive di microrganismi (axenici) o con comunità microbiche definite (gnotobiotici). Questo lavoro delinea un metodo per la raccolta di embrioni di Drosophila, la deteroionazione e la sterilizzazione con ipoclorito e il trasferimento a una dieta sterile. Gli embrioni sterilizzati vengono trasferiti in una dieta sterile in provette da centrifuga da 50 ml e le larve e gli adulti in via di sviluppo rimangono privi di microbi esogeni fino all'apertura delle fiale. In alternativa, i moscerini con un microbiota definito possono essere allevati inoculando dieta sterile ed embrioni con specie microbiche di interesse. Descriviamo l'introduzione di 4 specie batteriche per stabilire un microbiota gnotobiotico rappresentativo in Drosophila. Infine, descriviamo gli approcci per confermare la composizione della comunità batterica, compreso il test se la Drosophila axenica rimane priva di batteri nell'età adulta.
Introduzione
La maggior parte degli animali sono intimamente associati con i batteri ( 'microbiota') dalla nascita alla morte 1. I confronti di ( 'convenzionale') gli animali privi di microrganismi ( 'axeniche') e di microrganismi-associati hanno dimostrato microbi influenzano diversi aspetti della salute degli animali, tra cui metabolica, nutrizionale, vascolari, epatiche, respiratorio, immunologico, endocrino, e la funzione neurologica 2. La mosca della frutta Drosophila melanogaster è un modello chiave per comprendere molti di questi processi in presenza di microbi 3,4 e per studiare l'influenza microbiota su 5,6 salute degli animali. Nessuna specie batterica è presente in ogni individuo ( 'core'), ma Acetobacter e Lactobacillus specie numericamente dominano il microbiota di entrambi D. laboratorio-allevati e catturati in natura melanogaster. Altro Acetobacteraceae (compresi Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicutes (come Enterococcus e Leuconostoc), e Enterobacteriaceae sono sia spesso presente in individui Drosophila a bassa abbondanza, o irregolarmente presenti in grande abbondanza 7-12.
Il microbiota di Drosophila e mammiferi è incostanti all'interno e attraverso le generazioni 14,19. Microbiota incostanza può portare a rumore fenotipica quando si misurano i tratti microbiota-dipendente. Ad esempio, la memorizzazione Acetobacteraceae influenza lipidi (trigliceridi) in Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae sono più abbondanti nella mosche di una fiala che in un altro 19, mosche isogenici possono avere diversi fenotipi 20. Una soluzione per il problema del microbiota incostanza nei topi 14 è stato in pratica dal 1960, con l'introduzione di una comunità definita di 8 specie microbiche dominanti per cuccioli di topo ogni nuova generazione (alterata Schaedler flora),assicurando che ogni cucciolo è esposto agli stessi membri chiave del microbiota del mouse. Questa pratica controlla per la composizione microbica anche quando il microbiota non è l'obiettivo primario di studio 32, e imposta precedente per assicurare la presenza di microbi chiave in una varietà di condizioni sperimentali.
Per definire l'influenza dei microbi sulla Drosophila nutrizione, diversi protocolli per derivare linee di volo axenici sono state sviluppate, compresa ipoclorito dechorionation di embrioni (sia derivato de novo ogni generazione o mantenuta generationally mediante trasferimento diete sterili) e trattamento antibiotico 13. Ci sono benefici per diversi approcci, come la facilità e rapidità sia per il trattamento di antibiotici e di trasferimento seriale, contro un maggior controllo delle variabili confondenti con de novo dechorionation (ad esempio, la densità d'uovo, i microbi contaminanti residui, fuori bersaglio effetti antibiotici). Indipendentemente dal metodo dipreparazione, introduzione di specie microbiche specificati axeniche embrioni permette cultura della Drosophila con definite le comunità ( 'gnotobiotic'). In alternativa, mimando l'uso di flora Schaedler, questa comunità potrebbe essere inoculato alle uova convenzionalmente stabilite (seguenti passaggi 6-7 solo) per assicurare la presenza di microbi trait-influenzano in ogni flacone ed evitare complicazioni del microbiota incostanza. Qui si descrive il protocollo per l'allevamento axeniche e gnotobiotic Drosophila da de novo dechorionation di embrioni, e per confermare la presenza di introdotto o contaminazione microbica taxa.
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Protocollo
1. Coltura dei batteri (Inizio ~ 1 settimana prima di prendere le uova)
- Preparare MRS modificato (20) mmrs piastre e tubi di brodo (Tabella 1). Versare 20 ml mMRS agar in ogni piatto 100 millimetri di Petri e lasciare raffreddare / asciugare durante la notte, o 5 ml mMRS brodo in provette mm 18.
- Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, e L. plantarum su mMRS piastre di agar. Incubare Acetobacter notte a 30 ° C. Incubare anaerobicamente Lactobacillus posizionando le piastre in un contenitore ermetico e inondazioni con anidride carbonica prima della sigillatura. Incubare a 30 ° C per una notte.
Nota: L. colonie brevis potrebbero non essere visibili fino 24-48. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C e le colonie possono essere usati fino a 3 settimane. - Due o tre giorni prima di trasferire le uova dechorionated alla dieta sterile (sezione 5), scegliere una singola colonia dalla piastra mMRS in una provetta conmMRS tenenti brodo. Crescere Acetobacter con agitazione e crescere Lactobacillus statico per 24 ore o fino a quando torbido, sia a 30 ° C.
2. Preparare sterile dieta
- Preparare dieta sterile (Tabella 2) in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Microonde la dieta fino a quando non ha bollito per 3 volte consecutive; mix tra ogni ebollizione.
- Porre il pallone su un piatto mescolare per mantenere mescolando durante il trasferimento dieta per provette da centrifuga coniche. Trasferire 7,5 ml di dieta per 50 ml provette da centrifuga. Liberamente tappare i tubi, e mettere in un rack in polipropilene autoclavabile coperto.
- Sterilizzare dieta volo usando autoclave a 121 ° C e 15 psi per 25 min. Rimuovere rack da autoclave, e scuotere immediatamente ciascun rack orizzontale per garantire la dieta non separarsi durante il raffreddamento. Fare attenzione a non scuotere i rack in verticale per impedire il trasferimento di dieta per il coperchio o bordi dei tubi. Lasciare che la dieta raffreddare su un agitatore per esattamente 45 minuti eancora una volta scuotere la dieta in senso orizzontale a mano.
Nota: La dieta può essere conservato a 4-15 ° C per un massimo di una settimana. - Come alternativa all'utilizzo di rack autoclavabili coperte (passaggi 2.1-2.3), o ad alzare le mosche sulle diete contenenti conservante acido, effettuare le seguenti operazioni:
- Preparare 1 L dieta liquida in un pallone 2 L con un ancoretta nel pallone. Autoclave la dieta.
- Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 10 ml di conservanti e mescolare continuamente su un piatto mescolare riscaldata. Quando l'agar è raffreddato a 50-60 ° C, spostare il pallone in una piastra di mescolare riscaldata in un armadio biosicurezza e mantenere la temperatura pallone per riscaldamento a 50-60 ° C.
- Nel gabinetto biosicurezza, pipetta ~ 7,5 ml individualmente in tubi conici.
3. Preparare Gabbie deposizione delle uova
- Fai piastre di agar succo d'uva da microonde 100 ml di acqua, lievito di birra 10 g di birra, 10 g di glucosio, e 1 g di agar. Portare a ebollizione per 3 volte nella fase 1.1 e aggiungere 10 g di uva congelato succo concentrate per aumentare la visibilità delle uova sulla piastra di agar.
- Quando agar è raffreddato a 55 ° C, versare 20 ml in 100 mm Petri e lasciare solidificare.
- Coprire la superficie delle piastre di agar con una pasta di lievito mescolando lievito 1 g di birra con acqua 15 g. Versare pasta di lievito sulla piastra di agar assicurandosi che la superficie è coperta, quindi versare l'eccesso, lasciando dietro di sé una sottile residuo di lievito. Se si utilizzano più piastre, la pasta può essere sequenziale versato a più piastre.
- Trasferire piastre di agar nel fondo di una gabbia.
Nota: Un contenitore deli 32 oz è un buon sostituto per gabbie Fly acrilici.- Rendere coperchi per contenitori deli 32 oz tagliando un foro nella parte superiore e incollando una mesh traspirante sopra il foro con colla non tossici. Se la colla è idrosolubili impediscono esposizione all'acqua al coperchio.
- Trasferimento 200-300 vola nel contenitore e coprire con il coperchio. Coprire il buco rete protetta con un coperchio piatto di Petri vuota Prevent evaporazione dalla superficie agar e aggiungere una carta velina umida all'interno del coperchio se desiderato. Incubare mosche a 25 ° C durante la notte per 16-20 ore.
4. raccogliere le uova
- Preparare un setaccio per la raccolta delle uova, ponendo rete di nylon in una boccola in plastica.
- Per recuperare la piastra con le uova su di esso, rimuovere mosche dalla gabbia trasferendo in un contenitore vuoto. Se stessi mosche saranno utilizzati il giorno successivo, trasferire immediatamente ad una nuova gabbia contenente una piastra di agar succo d'uva appena yeasted. Le mosche possono essere utilizzati per 3-5 giorni sequenziali
- Rimuovere mosche morte dal agar con un pennello pulito, facendo attenzione a non rompere l'agar.
- Raccogliere uova sciacquando piastra di agar con acqua distillata, delicatamente spazzolatura uova dalla superficie agar, e versando l'impasto sulla maglia. Ripetere 3-4 volte fino a quando tutti o la maggior parte delle uova sono state rimosse dalla piastra di agar.
5. Dechorionate uova e trasferimento sterile DIET
- Preparare la armadio biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con il 70% di etanolo. Pulire il fondo con un tessuto di laboratorio, e sterilizzare il cappuccio con luce UV per ~ 15 min. Sterilizzare tutti i materiali di consumo non-biologici (campioni tazze, pennello, pinze, contenitori di rifiuti, 400 ml di acqua e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%), a spruzzo con etanolo e subito messa in cabinet biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 min.
- Avviare il primo di 2 lavaggi di ipoclorito di sodio posizionando la bussola con le uova in una tazza 120 ml campione o altro contenitore sterile. Versare lentamente ~ 90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
- Lavare le uova per 2,5 min. Periodicamente risospendere le uova utilizzando pinze per spostare la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
- Trasferire la bussola direttamente in una seconda tazza esemplare, pre-riempita con 90 ml di candeggina, all'interno dell'armadio biosicurezza.
- Ripeterepasso 5.3 all'interno dell'armadio biosicurezza. Alla fine del secondo trattamento candeggiante, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
- Effettuare i passaggi 5,7-5,8 nell'armadio biosicurezza.
- Eliminare la candeggina e lavare la bussola con acqua sterile per 3 volte. Risospendere le uova più volte durante ogni lavaggio spostando la bussola con una pinza. Alla fine del terzo lavaggio più uova devono essere fissati al lato della boccola.
- Utilizzando un pennello sterilizzati in etanolo, trasferire uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Obiettivo per 30-50 uova per fiala. Lasciare i tappi allentato per permettere l'ossigeno di entrare nel tubo. Se fiale devono rimanere axeniche, trasferimento in un incubatore di insetti; altrimenti, aggiungere batteri come sotto.
6. Fare Gnotobiotic Flies Utilizzando 4 batteriche Specie
- preparare batteri
- Preparare un armadio biosicurezza sterilizzato con forniture necessarie (pipettes, scatole punta pipette, provette da centrifuga sterilizzati, brodo MRS, e rastrelliere provetta) come al punto 4.1. Pulire l'esterno di provette con un laboratorio di etanolo imbevuto wipe prima di mettere in armadio biosicurezza.
- Pellet i batteri in primo luogo il trasferimento di 500 ml di crescita durante la notte per una provetta per microcentrifuga sterile. Se la densità batterica è bassa, aggiungere fino a 1,5 ml a ciascuna provetta o in sequenza rimuovere surnatante e aggiungere la cultura in più per lo stesso tubo. Rimuovere campioni dal cabinet biosicurezza e centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g. Utilizzare puntali con filtro per evitare la contaminazione tra i campioni.
- Determinare la densità di ciascuna coltura misurando OD 600. Se si utilizza un lettore di piastre multi-bene, trasferire 200 ml di ogni cultura ad una piastra a 96 pozzetti in 1, 2 e 4- diluizioni.
- Determinare la quantità di mMRS in cui diluire ciascun pellet cellulare (5.2.2) utilizzando uno spettrofotometro lettura della piastra e le seguenti equazioni. Piano di aggiungere abbastanza brodo per inoculare 50 &# 956; l per ogni flacone mosca.
- Raccogliere OD 600 letture di 1: 1, 1: 2 e 1: 4 diluizione ciascuna coltura batterica su uno spettrofotometro piastriforme lettura. Selezionare la diluizione per ogni ceppo batterico che produce un valore di 600 OD sono compresi tra 0,1 e 0,2 e utilizzare questo valore e il suo fattore di diluizione corrispondente come 'O' e 'D' nelle formule indicate in 6.1.4.2 o 6.1.4.3.
- Se si utilizza le 4 specie qui descritte, normalizzare le cellule per unità formanti colonia equivalente (CFU) / ml densità (OD 600 alla conversione CFU determinato in precedenza 20) utilizzando questa equazione:
E = ((OB) x V x D) / C
dove E = volume di risospendere pellet in (ml), O = OD 600 batteri, B = OD 600 supporti vergini, D = fold-diluizione, V = coltura batterica ml prima della centrifugazione, C = OD 600 di costante predeterminata. Vedere file di codice supplementare per gli esempi di calcoli utilizzando queste equazioni. per spettrofotometros che automaticamente vuoto, usare "O" al posto di "OB".
Nota: Le costanti predeterminate (unità OD 600, normalizzati a 10 7 CFU ml -1, costanti derivati in 20) sono i seguenti: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). - Se si utilizzano altre specie batteriche (senza CFU / OD 600 costante è disponibile), normalizzare la densità di OD 600 = 0.1 utilizzando questa equazione:
E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
Nota: Le unità sono le stesse come nel passaggio 6.1.4.2. Vedere file di codice supplementare per gli esempi di calcoli utilizzando queste equazioni.
- Nel gabinetto biosicurezza, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in mMRS freschi o PBS come calcolato al punto 6.1.4.2.
- Seminare batteri
- Trasferimento 50 ml di batteri ai tubi conici con sterili dieta und dechorionated uova in armadio biosicurezza. Aggiungere batteri dopo il trasferimento uovo per evitare contaminazione tra fiale.
- Posizionare provette inoculate in un incubatore a 25 ° C.
7. Misurare CFU carico / prova di sterilità
- Per misurare il carico CFU in tutto omogenati corpo mosca, trasferimento 5 mosche (5-7 giorni dopo Eclosion) in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga contenente 125 ml di sfere di ceramica e 125 ml di brodo mMRS. Omogeneizzare mosche usando un omogeneizzatore tessuto per 30 secondi a 4,0 m / sec.
- In alternativa, omettono perline e mano omogeneizzare in provette da microcentrifuga con pestelli in plastica per 1 min.
- Se la quantificazione del microbiota intestinale, superficie sterilizzare le mosche per rimuovere i microbi esogeni 22. Trasferimento vola a una provetta contenente 100 ml etanolo al 70% per 1 min, aspirare l'etanolo, e trasferimento in una nuova provetta per homogenizations. Se il contenuto di DNA dell'intestino sarà misurato, sciacquare fo 1 min con ipoclorito di sodio 0,6% prima del lavaggio etanolo.
- Diluire l'omogeneizzato con 875 microlitri mMRS, vortex per 5 secondi, e pipetta 120 ml di omogeneizzato nel primo pozzetto di una micropiastra.
- Eseguire due sequenziali 1: 8 diluizioni con 10 microlitri omogeneizzato e 70 microlitri MRS nei prossimi due pozzi.
- Rimuovere 10 ml dal primo pozzo e aggiungerlo al secondo pozzetto contenente 70 ml MRS. Mescolare il contenuto del secondo pozzo accuratamente, trasferimento 10 microlitri dal secondo pozzo alla terza pozzetto contenente 70 microlitri MRS, e omogeneizzare. Questo porta a 3 le concentrazioni totali di originale omogeneizzato 1.000 ml: Non diluito, 1: 8, e 1:64.
- Trasferire 10 ml di ogni diluizione ad una lastra mMRS (utilizzando una pipetta multicanale se desiderato). Leggermente inclinare il piatto per diffondere la diluizione diversi millimetri verso il basso la superficie agar e consentire il liquido si asciughi prima di spostare il piatto. Il liquido si asciuga in The piastra rapidamente se le piastre sono 2 giorni di età, riducendo miscelazione di due goccioline adiacenti.
- Incubare a 30 ° C per 1-2 giorni. Rimuovere le piastre dal termostato volta distinti, singole colonie sono visibili, e contare da una diluizione con 10-100 colonie isolate.
- Calcola CFU per volare utilizzando l'equazione E = C x D / P x V / F, dove E = CFU per volare, C = numero di colonie contato, D = diluizione, P = ml placcato, V = volume di volare omogenato, e F = numero di mosche omogeneizzati.
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Risultati
Allevamento di successo di mosche axeniche è confermata da isolamento di non CFU da homogenizations tutto il corpo di D. adulti melanogaster (figura 1). In alternativa, se l'omogeneizzato placcato produce colonie, i flaconi sono contaminati e devono essere eliminati. Per mosche gnotobiotic, ciascuna delle quattro isolati batterici sono stati isolati da pool di 5 maschi adulti, dimostrando differenze CFU vitali totali associati con mosche adulte
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Discussione
Il metodo qui descritto è uno dei diversi approcci per embrione dechorionation 8,11,18,25,26,27, insieme con altri metodi di allevamento mosche axeniche, tra cui il trasferimento seriale di adulti axeniche 18,27 o 13,18 trattamento antibiotico. Altri metodi includono dechorionation lavaggi etanolo e ridurre 11,25,26 o estendono 8 Trattamento ipoclorito. Diverse fasi di lavaggio può essere di aiuto l'allevamento di diversi genotipi mosca: in un precedente s...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Alcuni dettagli di questo protocollo sono state ottimizzate con l'aiuto del Dr. Adam Dobson, che ha anche fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per il National Institutes of Health (FNIH) codice di autorizzazione R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH codice di autorizzazione 1F32GM099374-01 (PDN), e Brigham Young University fondi di avvio (JMC, MLK, MV). costi di pubblicazione sono stati sostenuti dalla Brigham Young University College of Life Sciences e del Dipartimento di Scienze della flora e fauna.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lievito di birra | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucosio | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% succo d'uva concentrato | Walmart o altri negozi di alimentari | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| gabbia: 32 once Contenitore per gastronomia rotondo traslucido | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Coperchio per contenitore per gastronomia rotondo traslucido | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Bottiglie | Stock Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Tappi | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Rete in nylon | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Boccola in plastica | Home Depot | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| Tappo boccola in plastica | Home Depot | 100153897 | http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in boccola isolata in plastica rigida-2-Pack-2-27529/100153897 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Provette per centrifuga | TrueLine TrueLine | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Scatole per alimenti | USA Scientifico | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Matrice di lisi D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Puntali per pipette con filtro, 300 &; l | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Piastre di Petri | Vendita di prodotti da laboratorio | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Pennello | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Pinze | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Candeggina per uso domestico (6-8% ipoclorito) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| estratto di lievito | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 Fosfato dipotassico | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0& mode=match%20partialmax& lang= en& regione=US& focus=prodotto |
| Citrato di ammonio | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0& mode=match%20partialmax& lang= en& regione=US& focus=prodotto |
| Acetato di sodio | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Solfato di magnesio | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Solfato di manganese | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20parzialemax& lang=en& region =US& focus=prodotto |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| Lettore di piastre a 96 pozzetti | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html |
| 1,7 ml Provette per centrifuga | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Puntali per pipette con filtro, 1.000 μ l | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| Piastre da 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/ |
| Perline in ceramica | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | |
| Omogeneizzatore tissutale | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Classe 1 Cabina di BioSicurezza | Thermo Scientific | Modello 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
Riferimenti
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- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
- Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
- Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
- Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
