A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Generalist pollinatörer som buff-tailed humla, Bombus terrestris, möter både näringsämnen och gifter i blomster nektar de samlar in från blommande växter. Endast ett fåtal studier har beskrivit smak svaren från bin mot gifter i mat, och dessa försök har huvudsakligen använt snabel förlängning svar på återhållsamma honungsbin. Här är en ny beteendeanalys som presenteras för att mäta matnings svaren från fritt rörliga, enskilde arbetstagaren humlor till näringsämnen och gifter. Denna analys mäter mängden lösning intas av varje humlan och identifierar hur tastants i livsmedel påverkar mikrostrukturen hos ätbeteende.
Lösningarna presenteras i en microcapillary rör enskilda humlor som tidigare har svalt för 2-4 timmar. Beteendet fångas på digital video. Finstrukturen av matningsbeteende analyseras genom att kontinuerligt scoring positionen för ProboSCI (mundelar) från videoinspelningar med hjälp av händelseloggning programvara. Positionen för den snabel definieras av tre olika beteendekategorier: (1) snabel utvidgats och i kontakt med lösningen, är (2) snabel förlängas, men inte är i kontakt med lösningen och (3) snabel är stuvat under huvudet. Vidare hastigheten på snabel upprullnings bort från lösningen är också uppskattat.
I föreliggande analys volymen av lösning som konsumeras, antalet utfodring bouts, är varaktigheten av matnings skjutningarna och hastigheten på snabel tillbakadragning efter den första kontakten används för att utvärdera phagostimulatory eller den avskräckande aktiviteten hos de testade föreningarna.
Den nya smaken analys gör det möjligt för forskarna att mäta hur föreningar som finns i nektar påverka ätbeteende av bin och kommer också att vara till nytta för pollinering biologer, toxikologer och neuroethologists studerar humlan smak system.
Växt-pollinerande interaktioner är komplexa. Pollinerare besöker blommor för att få nektar och pollen som livsmedel; i sin tur, pollinatörer underlättar sexuell reproduktion i växter. Även om detta förhållande är mestadels mutualistisk, blommor nektar och pollen innehåller ibland toxiner eller andra växtämnen 1-5 som kan skada pollinerare. Den ekologiska grunden för närvaron av sådana föreningar i nektar och pollen är inte klart i alla inställningar. En kvarstående fråga inom detta område är hur pollinerare såsom bin kan upptäcka och undvika blommor med nektar som innehåller toxiner.
Humlan art, mörk jordhumla (Linnaeus, 1758), är en generalist pollinerare som besöker blommorna av många växtarter, inklusive de som producerar nektar innehåller toxiner 6. Humlor har visats undvika att konsumera lösningar innehållande höga koncentrationer av toxiner i en 24 tim två valsanalysen 7. denna analysfödointag beskrivs av et al. Tiedeken 7 visade att bin kan upptäcka bittra föreningar i lösningar. Men denna analys kunde inte skilja smak från post ingestive processer såsom illamående som också kan påverka ätbeteende under detta tidsintervall 8-10.
Bin har smaksensilla på sina antenner, mundelar och tarsi att upptäcka föreningar 11-13. Snabel förlängning reflex (PER) experiment innebär hållande enskilda bin i en sele och sedan stimulera biets antenn sensilla att producera matnings reflex 14-17. Bin kan begränsas i enskilda selar och sedan stimuleras att producera matnings reflex som en analys av deras förmåga att smaka föreningar 18,19. Andra har ändrat per analys för att studera känsligheten hos antenner eller mundelar för gifter 9,20. Men bin utsätts för stress under utnyttja. Detta kan påverka hurde reagerar på föreningar 21.
Här är en ny analys beskrivs att bedöma beteende smak respons fritt rörliga humlor till sackaros och kinin, en alkaloid som tidigare har rapporterats vara avskräckande 9 och giftiga 10 till honungsbin (Apis mellifera) och humlor (Bombus terrestris) 7, 22. Även kinin inte har hittats i växt nektar, denna alkaloid ofta används som en obehaglig stimulans beteendemässiga och fysiologiska studier i bin 7,9,12,13,22. Metoden involverar videoinspelning humlorna 'mundelar vid stor upplösning under den initiala snabel kontakt med testlösningarna. Närmare bestämt är den fina strukturen av matningssvar undersöktes genom att kontinuerligt scoring beteende under en 2 min intervall. Den volym lösning som förbrukas mäts under utfodringsperioden och så mängden mat som äts kan korreleras med mikrostrukturen hosutfodringsbeteende. Även hastigheten med snabel indragnings mäts, som en indikator av en aktiv undvikande, och därför i förväg ingestive detektering.
Med denna nya beteendeanalys är kinin visat att avskräcka matning av buff-tailed humla. Den reducerade snabel kontakttid och utfodring skjutningen ofta vatten eller sackaroslösning spetsad med kinin tolkas här som en vägran att inleda ytterligare livnär sig på icke-näringsmässiga eller potentiellt giftiga lösningar. När kinin sättes till en M sackaroslösning, humlor inte bara minska volymen av lösningen som de konsumerar, de också dra in snabel snabbare, vilket minskar kontakttiden mellan mouthparts och lösningen innehållande ett toxin. Tillsammans antyder dessa resultat att kinin uppfattas av de smakreceptorceller på mouthparts av humlan, såsom redan tidigare identifierats i honungsbiet 9. Kinin är ett toxin för insekter som inducerar sjukdomskänsla liknande beteende i honungsbiet 10 och knockdown i malariamyggan (Anopheles gambiae) 23. Denna analys kan mycket väl leda till att identificatjon av vissa avskräckande och potentiellt giftiga ämnen som uppfattas av smakreceptorceller på mundelar i humlor.
Det är avgörande för microcapillary röret fyllas med en tillräcklig volym av testlösning för att hålla hela testfasen. Det rekommenderas att åtminstone omkring tre fjärdedelar av microcapillary röret (t.ex. 70-80 l) är fylld. Dock bör försiktighet iakttas för att inte helt fylla microcapillary röret för att minska risken för spill under processen med avsökning och fästa microcapillary röret till den experimentella apparaten. Man bör också tas när man presenterar 500 mM sackaros droppe till humlan, så att försöksledaren undviker läcker droppen i hållarcellen.
4 mm hål vid spetsen av fasthållningsröret är tillräckligt stor för en vuxen arbetare humla naturligt utvidga sina snabel mot testlösningen. Det är dock möjligt atthumlor kan smaka lösningen med sina antenner innan utvidga sina proboscises. Detta kan påverka sannolikheten för snabel förlängning som PER kunde framkallas i humlor genom att stimulera deras antenner med en sockerlösning 15. I själva verket antenner Hymenoptera som parasitsteklar (Trissolcus brochymenae) 24 eller honungsbiet 13 är utrustade med smak sensilla, ger dem möjlighet att smaka socker och gifter som kinin. Följaktligen kunde inledande antenn kontakter med lösningar innehållande mycket avskräckande föreningar som kinin också minska motivationen hos en humla att utvidga sin snabel och därmed påverka den experimentella framgång. Även antenn kontakt med testlösningen inte kan kontrolleras, i denna studie vi inte finna någon signifikant effekt av antenn kontakt på snabel förlängning mot testlösningen. I denna analys omedelbart inrätta microcapillary röret efter förtest fas whöna humlorna "antenner är fortfarande inom fasthållningsröret kan minska möjligheten för humlorna att smaka provlösningen med sina antenner.
Den största begränsningen av denna analys uppstår vid spårning snabel dementi från testlösningen efter den första snabel kontakt med den motion tracking videoprogram. Videofilmer visar endast 2D rörelse av snabel, så den givna utsignalen från hastighetsmätningen kan vara under eller över beräknade. Dock med vissa modifieringar, kan denna aspekt av analysen förbättras.
Denna analys kan användas för att observera naturliga matningssvar mot lösningar innehållande olika föreningar inkluderande naturliga förekommande växt sekundära metaboliter. Beaktande av omedelbara utfodring svar med denna analys ger detaljerad information om hur humlor upptäcka dessa föreningar. Detta är fördelaktigt över befintliga "go-no go" metoder som PER 18,19 </sup> Och över två valsanalyser 7 eftersom denna metod ger flera beteendesvarsåtgärder, inklusive livsmedelskonsumtion under en diskret matning skjutningen.
Mätning flera parametrar samtidigt tillåter en bättre utvärdering av smak av en förening. Till exempel i vår analys, undviker humlor konsumerar vatten eller sackaroslösning spetsad med kinin. Indragning av snabel kan orsakas av en förändring i svaren från sockerreceptorceller 12,13. Vår analys visar att humlor dra snabel snabbare efter kontakt med sackaros plus kinin lösning än enbart vatten; Detta kan tyda på att kinin påverkar en distinkt uppsättning av neuroner förutom att hämma socker avkänning nervceller 9,12,13,25.
Vår analys medger analys av den tidsmässiga mönster av beteendereaktioner under utfodring. Ett liknande protokoll där tidsåtgången och antalet anfall mäts har alredo genomförts för att utvärdera matningssvar Drosophila till närings och icke-närande socker 26. Vi förutspår att bina kommer att uppvisa en mer tillförlitlig svar på utfodring stimulantia i vår analys än i andra metoder såsom PER eftersom bina är fria att röra sig i uppehållsröret 21. Denna teknik kommer att möjliggöra en uttömmande analys av de tröskelvärden smak för näringsämnen och gifter för att belysa mekanismerna för utfodring i humlor och eventuellt andra bee arter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Leverhulme förtroende bidraget (RPG-2012-708) och en BBSRC bidrag (BB / M00709X / 1) till GAW.
Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
ImageJ software version 1.48 | ImageJ |