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Articolo metodologico

Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l'immunità reattiva dell'inferta

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⸱

DOI:

10.3791/54242

⸱

7 giugno 2017

 , 
1Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Immunología de Trasplantes, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III

In questo articolo

Sommario

I macrofagi sono cellule plastiche del sistema ematopoietico che hanno un ruolo fondamentale nell'immunità protettiva e nell'omeostasi. In questa relazione, descriviamo tecniche ottimizzate in vitro per caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente macrofagi regolatori infiltranti che si accumulano nell'organo trapiantato in condizioni tolerogene.

Abstract

L'accumulo di macrofagi negli organi trapiantati è da tempo riconosciuto come una caratteristica del rifiuto di allograft 1 . I monociti immunogenici infiltrano l'allograft presto dopo il trapianto, montano una risposta reattiva dell'innesto contro l'organo trapiantato e iniziano il rigetto dell'organo 2 . Recenti dati suggeriscono che i macrofagi soppressivi facilitano il successo del trapianto a lungo termine 3 e sono necessari per l'induzione della tolleranza al trapianto 4 . Ciò suggerisce un concetto multidimensionale di ontogenesi, attivazione e funzione dei macrofagi, che richiede una nuova tabella di marcia per l'isolamento e l'analisi della funzione macrofagi 5 . A causa della plasticità dei macrofagi, è necessario fornire una metodologia per isolare e caratterizzare i macrofagi, a seconda dell'ambiente tissutale, e per definire le loro funzioni secondo diversi scenari. Qui, abbiamo descriEssere un protocollo per la caratterizzazione immunitaria dei macrofagi infiltranti innestati e dei metodi che abbiamo usato per valutare funzionalmente la loro capacità di inibire la proliferazione CD8 + T e promuovere l'espansione di CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .

Introduzione

Questo protocollo descrive tecniche in vitro per studiare la funzione dei macrofagi infiltranti del tessuto isolati da allograft cardiaci, in base alla loro capacità di modulare le risposte delle cellule T. Ampiamente descritti in letteratura, i coloranti fluorescenti di monitoraggio delle cellule in combinazione con la citometria a flusso sono strumenti potenti per studiare la funzione soppressiva di specifici tipi di cellule in vitro e in vivo. Il nostro protocollo segue il metodo estere carbossfluoresceina succinimidile (CFSE) per il monitoraggio della proliferazione linfocitaria in vitro .

Quando una cellula etichettata con CFSE si divide, la sua progenie acquisisce la metà del numero di molecole taggate con carbossiofluoresceina 6 . La corrispondente diminuzione della fluorescenza cellulare mediante citometria a flusso può essere utilizzata per valutare la divisione cellulare, monitorando la capacità dei macrofagi soppressivi di modulare le risposte immunitarie delle cellule T. Dal momento che CFSE è un colorante a base fluoresceina, è compatibile con un brLa gamma di altri fluorochromi, rendendola applicabile alla citometria a flusso multi-colore. La scelta appropriata dei fluorochromi per la fenotipizzazione è altrettanto importante per evitare sovrapposizioni spettrali eccessive e l'incapacità di riconoscere cellule positive di anticorpi, in particolare con coloranti proteici visibili come CFSE 7 .

Ci sono molti vantaggi dell'uso di coloranti fluorescenti sulle tecniche alternative che misurano la proliferazione cellulare, come il test di incorporazione della timidina, che utilizza la timidina radiotestata (TdR) 8 . Questo saggio utilizza la timidina tritiata ( 3 H-TdR) che è incorporata in nuovi fili di DNA cromosomico durante la divisione cellulare mitotica. Una preoccupazione di sicurezza associata a questo test è l'uso di radioisotopi, in quanto viene utilizzato un beta-contatore di scintillazione per misurare la radioattività del DNA recuperato dalle cellule al fine di determinare l'entità della divisione cellulare. Metodologicamente, il culo timidina tritiatoAy non è abbastanza flessibile per soddisfare importanti vincoli di laboratorio clinico come il numero ridotto di celle e l'analisi ritardata dopo la colorazione. Al contrario, la colorazione CFSE ha dimostrato di prevenire la proliferazione cellulare e di interferire con marcatori di attivazione critici, come CD69, HLA-DR e CD25 9 . Pertanto, la comprensione dei vantaggi e delle limitazioni di ciascuna metodologia, in particolare negli studi multicolori in cui vengono utilizzati diversi coloranti per tenere traccia di tipi diversi di cellule, è fondamentale per ottenere risultati accurati e riproducibili.

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Protocollo

In questo studio, i topi sono alloggiati in conformità con gli orientamenti degli Stati Uniti Dipartimento per l'Agricoltura e le raccomandazioni della Guida Sanitaria Pubblica Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le tecniche sperimentali che coinvolgono l'uso degli animali sono state eseguite in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali e di utilizzazione (IACUC) della Scuola di Medicina Monte Sinai.

1. Preparazione dei supporti

  1. Preparare il mezzo completo RPMI 1640 con 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 U / mL) utilizzando 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato di sodio, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 5 mM HEPES e 0,05 mM 2 -mercaptoetanolo.

2. Isolamento di allograft e sospensione a cellule singole

NOTA: La tecnica di trapianto e anastomosi dell'arteria polmonare e della vena cava inferiore è stata descritta inizialmente da Corry e collaboratori e può essere visualizzata in Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( Figura 1A ).

  1. Anestetizza un topo trapiantato con 4-5% di isoflurano in una camera di induzione. Sacrificarlo per dislocazione cervicale.
  2. Effettuare una incisione addominale mediana con forbici standard e rimuovere i contenuti addominali per localizzare l'aorta.
    NOTA: Il cuore trapiantato sarà sul lato destro dell'adorto addominale ricevente ( Figura 1B ).
  3. Estrarre l'innesto dolcemente con delle pinze fine-taglienti e metterlo immediatamente in un mezzo RPMI ghiacciato.
    NOTA: Usando una forbice da chirurgia per separare l'innesto dall'aorta può danneggiare l'innesto e causare un certo tessuto a rimanere aderito al destinatario.
  4. Dopo che tutti gli innesti sono stati raccolti, spostarli in una cappa di cultura sterile per l'elaborazione dei tessuti. Posizionare l'innesto in un piatto di Petri e tagliare il tessuto in piccoli pezzi (1 mm) utilizzando forbici sterili, scure e microchirurgiche.
  5. Con forc-sharp dentiEps, trasferire i pezzi in un tubo da 50 mL con 5 ml di collagenasi A (0,1 mg / mL collagenasi in sterile 1x PBS). Incubare per 1 h in un bagno di 37 ° C.
  6. Aggiungere 5 ml di mezzo RPMI per neutralizzare la collagenasi e trasferire il campione attraverso un filtro da 100 μm con l'aiuto dello stantuffo di una siringa da 1 ml.
  7. Spingere il campione a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  8. Resuspendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi ACK. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
  9. Aggiungere 1 mL di mezzo RPMI per neutralizzare il tampone di lisi e spinare il campione a 400 xg per 5 m a 4 ° C.
  10. Resuspendere il pellet di cellule in 200 μl di mezzo RPMI e trasferirlo in un tubo rotondo di 5 ml di polipropilene.
    NOTA: I tubi in polipropilene supportano meno aderenza. Inoltre, mantenere le celle a bassa temperatura, ad esempio 4 ° C, riduce l'adesione.

3. Isolamento dei Macrofagi infiltranti mediante innesto mediante ordinamento delle cellule attivate mediante fluorescenzaing

  1. Bloccare il legame specifico indesiderato sulle cellule mieloide usando il bloccaggio del recettore Fc mAb (topo anti-mouse CD16 / 32). Aggiungere 1-2 μL per campione, 15 minuti prima della colorazione superficiale.
  2. Macellare con anti-mouse CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL di concentrazione finale nel mezzo RPMI), anti-mouse CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μL), anti-mouse Ly6C APC (2 μg / E anti-mouse Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μL). Coprire i tubi con foglio di alluminio per proteggere gli anticorpi fluorescenti dalla luce e incubare i tubi in frigorifero a 4 ° C per 45 minuti.
    NOTA: Per le compensazioni a singola macchia, preparare un tubo di controllo negativo (senza macchia) e tubi con celle etichettate singolarmente con ciascuno dei fluorochromi. Per facilitare l'installazione del cancello, i controlli isotipici possono essere utilizzati soprattutto per Ly6C (IgG2a) e Ly6G (IgG2b).
  3. Lavare le cellule due volte con il mezzo RPMI e spingerle a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Conte le cellule usando tripan blu e un emocitometeR e diluirli in 1 mL di mezzo RPMI per 1 x 10 6 cellule. Prima di ordinare, trasferire i campioni attraverso un tappo di tubo da 5 ml e 70 μm. Aggiungere DAPI (1 μg / mL) come marcatore di vitalità cellulare e procedere per ordinare.
  4. Poiché i macrofagi sono cellule sensibili e fragili, impostare le condizioni di ordinamento a 20 psi e utilizzare una dimensione dell'ugello da 100 μm per isolare i macrofagi utilizzando una modalità di purezza a 4 vie.
  5. Preparare i tubi di raccolta con 1 mL di supporto RPMI in un tubo di 5 mL di polipropilene.
  6. Utilizzando il software di selezione, apri un nuovo esperimento e seleziona un esperimento vuoto con un pannello vuoto per definire le impostazioni.
  7. Impostare un tracciato a punti che visualizza il dispersione laterale (FSC) in avanti (contro) e la porta su tutti i leucociti, escludendo i detriti e le griglie con il più basso spostamento in avanti e laterali. Da questa porta padre, crea una nuova linea di punti che visualizza SSC vs DAPI e gate sulle celle DAPI.
    1. Su questa popolazione recente, creare annuncioOt che visualizza CD11b vs CD45 e gate su macrofagi e neutrofili doppio-positivi (CD11b + CD45 + ).
    2. Da qui crea un tracciato puntale finale che mostra Ly6C vs Ly6G e porta le popolazioni desiderabili: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - e Ly6C int Ly6G + ( Figura 2 ).
  8. Dopo l'ordinamento, controllare la purezza e la vitalità delle cellule (> 90%) e spinare i tubi di raccolta a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Conte le cellule utilizzando il blu di trypan ed un emocitometro e li resuscitano alla concentrazione desiderata ( ad esempio 1 x 10 6 macrofagi / mL) nel mezzo RPMI completo.
  9. Piastra 50 x 10 3 macrofagi per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con un volume finale di 100 μL di mezzo RPMI completo. Lasciare le cellule indisturbate per almeno 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2 .

4. IsolationN delle cellule T usando la selezione delle cellule attivate con fluorescenza

NOTA: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn è un ceppo di topo bersaglio a bersaglio X che coinvolge le cellule che esprimono il gene Foxp3 (scatola a forchetta P3) con proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP).

  1. Anestetizzare e sacrificare i topi C57BL / 6 e C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) come precedentemente descritto nel punto 2.1. Isolare la milza e linfonodi (LN: inguinale, lombare, ascellare, brachiale e cervicale) e posizionarli rapidamente in mezzo RPMI ghiacciato.
  2. Per isolare il LN, posizionare il mouse in posizione supina, effettuare una incisione cutanea da fondo a cima, tagliando con cura il peritoneo e spalmandola delicatamente. Una volta raccolti tutti i LN inguinali, lombari, ascellari, brachiali e cervicali ( figura 1C , colorati in rosso), tagliare il peritoneo e isolare la milza nella parte superiore sinistra dell'intestino.
  3. Disaggregare la milza e LN usando un filtro da 100 μm postoSopra un tubo da 50 ml. Usando lo stantuffo di una siringa da 1 ml, premere delicatamente il tessuto. Sciacquare il filtro con il supporto RPMI il più volte necessario fino a che non sia pulito.
    NOTA: LN e milza di ciascun mouse possono essere raggruppati nello stesso tubo.
  4. Spin giù a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. Resuspendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi ACK. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
  6. Aggiungere 2 mL di mezzo RPMI per neutralizzare il tampone di lisi. Spin giù a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  7. Resuspendere il pellet di cellule in 200 μl di mezzo RPMI e trasferirlo in un tubo rotondo da 5 ml di polistirolo.
  8. Carteggiare per anti-mouse CD4 APC (0,6 μg / μL) e / o anti-mouse CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Coprire i tubi con foglio di alluminio per proteggere gli anticorpi fluorescenti dalla luce e incubare i tubi in frigorifero a 4 ° C per 45 minuti.
    NOTA: Per compensazioni a singola macchia, preparare un tubo di controllo negativo (senza macchia) eTubi con cellule etichettate singolarmente con ciascuno dei fluorochromi.
  9. Lavare le cellule due volte con il mezzo RPMI e spingerle a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Contare le cellule usando il blu di trypan ed un emocitometro.
    NOTA: il colorante CFSE è fornito come polvere di carbossiofluoresceina diacetato succinimidil estere in genere a 50 μg. Aggiungere 18 μl di DMSO in una fiala di CFSE per una soluzione di riserva finale di 5 mM e conservare a -20 ° C per diversi mesi.
  10. Per l'etichettatura CFSE, risospendere le cellule macchiate CD8 ad una concentrazione fino a 10 6 cellule per ml in PBS a una concentrazione di lavoro finale di 5 μM CFSE dalla soluzione di riserva. Incubare in un bagno a 20 ° C per 5 minuti come descritto in precedenza 6 .
    NOTA: (STEP CRITICO) Per le cellule a bassa concentrazione (≤10 6 per ml), è essenziale che le cellule siano etichettate in presenza di proteine ​​aggiunte per buffer degli effetti tossici di CFSE. Pertanto PBS può contenere il 5% di FBS. Notate che se meDium è usato, gli amminoacidi liberi possono abbassare l'efficacia di etichettatura competendo per CFSE.
  11. Neutralizzare il CFSE con 2 mL di mezzo RPMI. Spin a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di mezzo RPMI per 1 x 10 6 cellule T CD8.
  12. Prima di ordinare, trasferire il campione attraverso un filtro cellulare da 70 μm su un tappo da 5 ml. Aggiungere 50 μl di 1x DAPI (1 μg / mL) come marcatore di vitalità cellulare e procedere alla selezione.
    NOTA: 1x significa 1: 1 rapporto del reagente rispetto ad altri costituenti.
  13. Impostare le condizioni di ordinamento a 20 psi e 100 μm di ugello per isolare le cellule CD8 + CFSE + T a doppio positivo ( Figura 3A ).
  14. Preparare i tubi di raccolta con 1 ml di supporto RPMI in un tubo di 5 ml di polipropilene e procedere alla loro ordinazione.
  15. Utilizzando il software di selezione, apri un nuovo esperimento e seleziona un esperimento vuoto con un pannello vuoto per definire le impostazioni.
  16. Per l'isolamento delle cellule CD4 + T, impostare un grafico a punti che disGioca il FSC vs SSC e la porta sui linfociti, escludendo i detriti e le grandi cellule granulari, come le cellule dendritiche.
    1. Da questa porta padre, crea una nuova linea di punti che visualizza SSC vs DAPI e gate sulle celle DAPI.
    2. Su questa popolazione recente, creare un plot di punti che visualizza SSC vs CD4 per isolare tutte le cellule CD4 + ( Figura 3B ). In alternativa, un mAb anti-CD3 può essere utilizzato per assicurare l'isolamento delle popolazioni di cellule T puro.
      NOTA: Una piccola frazione di tutte le cellule CD4 + T (5-10%) dovrebbe essere Foxp3 + mRFP + .
  17. Dopo l'ordinamento, controllare la purezza e la vitalità delle cellule (> 90%) e spinare i tubi di raccolta a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Contare le cellule usando il blu di trypan ed un emocitometro. Resuspendere usando 1 mL di mezzo RPMI completo per 2x106 T cellule.
  18. Impostare il saggio di soppressione coltivando le cellule T con macrofagi precedentemente ordinati. Piatto 10 x 10 4 CD4 + T e 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T cellule nello stesso pozzetto in un volume finale di 100 μL di mezzo RPMI completo. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 96 h.
    NOTA: Macrofagi e cellule T sono stati utilizzati in un rapporto 1: 4.
  19. Stimolare la divisione delle cellule T mediante lavaggio di branelli magnetici CD3 / CD28 dell'attivatore cellulare T in 2 ml di PBS prima di utilizzarli per eliminare il tampone contenente azide. Aggiungere 5 μl di mouse CD3 / CD28 per cellula-attivazione T cellula per pozzetto.
    NOTA: Le perle magnetiche sono di dimensioni simili alle celle presentanti antigene e sono accoppiate a mAb anti-CD3 e anti-CD28, offrendo un metodo semplice per l'attivazione e l'espansione delle cellule T.

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Risultati

I risultati rappresentativi mostrano la strategia di gating descritta nel precedente protocollo. I risultati mostrano anche l'analisi dell'attività di proliferazione delle cellule T dopo la co-cultura con macrofagi infiltranti innestati. La capacità suppressiva in vitro dei sottoinsiemi macrofagi è stata analizzata in Figura 4 . I risultati indicano che i macrofagi Ly6C lo Ly6G ottenuti da riceventi tollerati sono soppressivi. I risultati indicano ino...

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Discussione

Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo usato per immunocharacterizzare le sottostazioni di cellule mieloide infiltrando l'innesto in un modello sperimentale murino del trapianto di cuore, che è applicabile anche ad altri tessuti in diversi modelli sperimentali murini. La selezione di celle a bassa pressione a 20 psi è il metodo preferito per isolare una buona resa di sottogruppi di cellule pura. Il mantenimento della purezza di ogni sottoinsieme mieloide è fondamentale per stabilire risultati concreti della...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Riconosciamo i contributi tecnici dei centri di flusso, della microchirurgia e dei centri di bio-repository / patologia dell'esperienza di ricerca sul Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto dalla COST Action BM1305: Azione per focalizzare e accelerare le terapie tollerogeniche delle cellule (A FACTT), i fondi per lo sviluppo dello Istituto di trapianto di Mount Sinai Recanati / Miller, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10% FBSLife Technologies26140-079
1.000x 2-mercaptoetanoloLife Technologies21985023
100x Pen/StrepLife Technologies15140122
100x L-glutamminaLife Technologies25030081
100x Non Aminoacidi essenzialiCorning25025039
tampone HEPES 1 M Corning25060CL
100 mM Piruvato di sodioThermoScientificSH30239.01
Penicilina/StreptavidinaThermoScientific15140122
Collagenese ARoche70381322
DPBS (senza calcio e magnesio)Corning21031CV
70 µ m Filtro cellulareFisher22363548
tampone di lisi ACKLife TechnologiesA10492-01
DAPISigma32670-5mg-F
CFSE-FITCInvitrogenC34554
Dynabeads Attivatore di cellule T di topo CD3/CD28Life Technologies11452D
96 pozzetti  Piastra inferiorea U Corning353077
Anticorpi:
anti-Ly6C-APCeBioscience175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7Biolegend127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5eBioscience45011282
anti-CD45-APC/Cy7eBioscience47045182
anti-CD4-APCeBioscience17004181
anti-CD8-P/ Cy7eBioscience 25008181
Citometro a flusso LSRIIBD Bioscience
FACSDiva SoftwareBD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J Il Laboratorio Jackson008374
C57BL/6Il Laboratorio Jackson000664
Balb/cIl Laboratorio Jackson000651

Riferimenti

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