I macrofagi sono cellule plastiche del sistema ematopoietico che hanno un ruolo fondamentale nell'immunità protettiva e nell'omeostasi. In questa relazione, descriviamo tecniche ottimizzate in vitro per caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente macrofagi regolatori infiltranti che si accumulano nell'organo trapiantato in condizioni tolerogene.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l'immunità reattiva dell'inferta
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'accumulo di macrofagi negli organi trapiantati è da tempo riconosciuto come una caratteristica del rifiuto di allograft 1 . I monociti immunogenici infiltrano l'allograft presto dopo il trapianto, montano una risposta reattiva dell'innesto contro l'organo trapiantato e iniziano il rigetto dell'organo 2 . Recenti dati suggeriscono che i macrofagi soppressivi facilitano il successo del trapianto a lungo termine 3 e sono necessari per l'induzione della tolleranza al trapianto 4 . Ciò suggerisce un concetto multidimensionale di ontogenesi, attivazione e funzione dei macrofagi, che richiede una nuova tabella di marcia per l'isolamento e l'analisi della funzione macrofagi 5 . A causa della plasticità dei macrofagi, è necessario fornire una metodologia per isolare e caratterizzare i macrofagi, a seconda dell'ambiente tissutale, e per definire le loro funzioni secondo diversi scenari. Qui, abbiamo descriEssere un protocollo per la caratterizzazione immunitaria dei macrofagi infiltranti innestati e dei metodi che abbiamo usato per valutare funzionalmente la loro capacità di inibire la proliferazione CD8 + T e promuovere l'espansione di CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .
Introduzione
Questo protocollo descrive tecniche in vitro per studiare la funzione dei macrofagi infiltranti del tessuto isolati da allograft cardiaci, in base alla loro capacità di modulare le risposte delle cellule T. Ampiamente descritti in letteratura, i coloranti fluorescenti di monitoraggio delle cellule in combinazione con la citometria a flusso sono strumenti potenti per studiare la funzione soppressiva di specifici tipi di cellule in vitro e in vivo. Il nostro protocollo segue il metodo estere carbossfluoresceina succinimidile (CFSE) per il monitoraggio della proliferazione linfocitaria in vitro .
Quando un....
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Protocollo
In questo studio, i topi sono alloggiati in conformità con gli orientamenti degli Stati Uniti Dipartimento per l'Agricoltura e le raccomandazioni della Guida Sanitaria Pubblica Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le tecniche sperimentali che coinvolgono l'uso degli animali sono state eseguite in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali e di utilizzazione (IACUC) della Scuola di Medicina Monte Sinai.
1. Preparazione dei supporti
- Preparare il mezzo completo RPMI 1640 con 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 U / mL) utilizzando 2 mM ....
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Risultati
I risultati rappresentativi mostrano la strategia di gating descritta nel precedente protocollo. I risultati mostrano anche l'analisi dell'attività di proliferazione delle cellule T dopo la co-cultura con macrofagi infiltranti innestati. La capacità suppressiva in vitro dei sottoinsiemi macrofagi è stata analizzata in Figura 4 . I risultati indicano che i macrofagi Ly6C lo Ly6G ottenuti da riceventi tollerati sono soppressivi. I risultati indicano ino.......
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Discussione
Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo usato per immunocharacterizzare le sottostazioni di cellule mieloide infiltrando l'innesto in un modello sperimentale murino del trapianto di cuore, che è applicabile anche ad altri tessuti in diversi modelli sperimentali murini. La selezione di celle a bassa pressione a 20 psi è il metodo preferito per isolare una buona resa di sottogruppi di cellule pura. Il mantenimento della purezza di ogni sottoinsieme mieloide è fondamentale per stabilire risultati concreti della.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo i contributi tecnici dei centri di flusso, della microchirurgia e dei centri di bio-repository / patologia dell'esperienza di ricerca sul Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto dalla COST Action BM1305: Azione per focalizzare e accelerare le terapie tollerogeniche delle cellule (A FACTT), i fondi per lo sviluppo dello Istituto di trapianto di Mount Sinai Recanati / Miller, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1.000x 2-mercaptoetanolo | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutammina | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Aminoacidi essenziali | Corning | 25025039 | |
| tampone HEPES 1 M | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Piruvato di sodio | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilina/Streptavidina | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (senza calcio e magnesio) | Corning | 21031CV | |
| 70 µ m Filtro cellulare | Fisher | 22363548 | |
| tampone di lisi ACK | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Attivatore di cellule T di topo CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 pozzetti Piastra inferiore | a U Corning | 353077 | |
| Anticorpi: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience 25008181 | ||
| Citometro a flusso LSRII | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | Il Laboratorio Jackson | 008374 | |
| C57BL/6 | Il Laboratorio Jackson | 000664 | |
| Balb/c | Il Laboratorio Jackson | 000651 |
Riferimenti
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocyte....
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Ristampe e permessi
